专利名称：美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及美洲凌霄花多糖的应用，具体涉及美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用。
背景技术：
人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡的状态，过度凝血会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病。在血栓形成过程中，血小板活化与凝血系统激活具有重要作用，两者在体内紧密联系，凝血系统激活后产生的凝血酶，是一个强有力的血小板活化因子，血小板活化后又将促进凝血过程。抗血栓治疗主要针对凝血系统和血小板两个环节，分别称为抗凝治疗和抗血小板治疗。目前临床上常用的抗凝血药主要包括肝素类和香豆素类等，抗血小板药物最常用的是阿司匹林。肝素类药物通过促进抗凝血酶III对含有丝氨酸残基的已经活化的凝血因子Ila、IXa, Xa, XIa, XIIa的灭活，产生强大的抗凝血作用，但肝素类药物不能口服给药，不便于患者用药。香豆素类药物与维生素K结构相似，通过拮抗维生素K 的利用，抑制凝血因子II、VII、IX、X在体内的合成，产生抗凝血作用，香豆素类药物可以口服给药，但起效慢，且在体外没有抗凝血活血。阿司匹林可抑制环氧酶活性，抑制血小板花生四烯酸代谢产生血栓素A2，产生抗血小板活性。此外，阿司匹林还抑制凝血酶原在肝内的合成，具有抗凝血作用(参见李素燕等，抗血栓药物的研究进展，国外医学药学分册，2006， 33 (6) :428)。血液凝固有内源性和外源性两条凝血途径，研究药物的抗凝血作用通常测定药物对小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，以及凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)、血浆复钙时间(PRT)的影响。APTT和PT是临床凝血功能检测中最常用的两个参数，其中APTT主要用于检测机体的内源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和XII的血浆活性降低或增加，PT则主要用于检测机体的外源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子I、II、V、VII和X的血浆活性降低或增加(参见王晓锋等，抗血小板聚集药物的机制研究进展，中国康复理论与实践，2010，16 (10) :954)。紫葳科植物凌霄或美洲凌霄的干燥花作为凌霄花入药，凌霄花水煎液能加快老龄大鼠的血流速度，增加毛细血管网交叉点，扩张小血管管径，抑制红细胞聚集，降低血液粘度。小剂量的凌霄花粗提物能显著抑制血小板聚集，一定程度上具有较好的改善微循环、活血化瘀的功效。凌霄花甲醇提取物对卵白溶菌酶致敏小鼠血流量降低有显著的改善作用。 凌霄花水煎液对大鼠的血栓形成有抑制作用(参见杨阳等，凌霄花的化学成分及药理作用综述，中国药师，2008,11(1 :1521)。该文献同时指出美洲凌霄花多糖不具有抑制血栓形成的作用。同时，现有技术中未见关于美洲凌霄花多糖是否具有抗凝血作用的报道。 发明内容
本发明的发明目的是提供美洲凌霄花多糖的一种新的应用，即美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用。上述技术方案中，概念“多糖”为本领域技术人员公知的概念，例如，现有技术中有 “黄芪多糖”、“紫锥菊多糖提取物”等多糖，多糖是极性大分子化合物，常用的提取方法有 热水浸提法、稀碱浸提法、酸浸提法和酶法。前三种为化学方法，酶法为生物方法。稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50°C。一般植物多糖提取多采取热水浸提法。优选的技术方案中，上述美洲凌霄花多糖是粗多糖，是混合物，其制备方法包括以下步骤
(1)取美洲凌霄花，先用水回流提取至少1次，然后将提取液过滤后合并，然后浓缩， 得到浓缩滤液；
(2)向浓缩滤液中加入沉淀剂无水乙醇，获取沉淀；将沉淀加入水中溶解，再加入三氯乙酸除去蛋白，离心，弃去沉淀，上清液用氢氧化钠中和多余的三氯乙酸；然后采用透析法分离得到多糖，即位供美洲凌霄花多糖。人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡的状态，过度凝血会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病。血液凝固有内源性和外源性两条凝血途径，研究药物的抗凝血作用通常测定药物对小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，以及凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)、血浆复钙时间(PRT)的影响。APTT和PT是临床凝血功能检测中最常用的两个参数，其中APTT主要用于检测机体的内源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和XII的血浆活性降低或增加，PT则主要用于检测机体的外源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子I、II、V、VII和X的血浆活性降低或增加。本发明通过体内给药测定美洲凌霄花多糖对小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间的作用；测定美洲凌霄花多糖对小鼠凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)、血浆复钙时间(PRT)的影响。抗凝血实验结果表明，美洲凌霄花多糖能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，并显著延长小鼠凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和血浆复钙时间(PRT)，显示其主要通过抑制外源性凝血因子活性，使纤维蛋白的生成受到抑制，凝血酶时间显著延长。实验结果确定，美洲凌霄花多糖具有显著的抗凝血作用。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.本发明提供了美洲凌霄花多糖的新用途，即制备抗凝血药物中的应用，采用该抗凝血药物能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，并显著延长小鼠凝血酶时间 (TT)、凝血酶原时间(PT)和血浆复钙时间(PRT)，显示其主要通过抑制外源性凝血因子活性，使纤维蛋白的生成受到抑制，凝血酶时间显著延长。
图1为实施例中得到的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步描述 实施例一
本实施例所使用的药品与试剂包括美洲凌霄花多糖(含量> 50%，紫外分光光度法测定)苏州大学提供，动物给药用0.5% CMC-Na配制。阿司匹林肠溶片(批号H32026500)， 南京白敬宇制药有限责任公司，动物给药用0.5% CMC-Na配制。凝血酶原时间(PT)试剂盒(编号-XW沪0556-40-2009)、活化部分凝血激酶时间(APTT)试剂盒(编号-XW沪 0555-40-2009 )和凝血酶时间(TT )试剂盒(编号AZB/沪0558-40-2009 )，上海太阳生物制品有限公司。(一)美洲凌霄花多糖制备
IOOg美洲凌霄花，水回流提取两次，第一次用水1500ml，回流提取两小时；第二次用水 1000ml,回流提取一小时，提取液过滤合并。将滤液浓缩至100ml，加入300ml无水乙醇放置12h，离心取沉淀。沉淀加入IOOml水溶解，溶液加入60%三氯乙酸33ml，40°C静置4h，离心，弃去沉淀，上清液用NaOH中和。透析17小时。将透析液蒸干得粗多糖5. 91g。(二)美洲凌霄花多糖含量测定 (1)标准曲线绘制
准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准品IOOmg置100 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度摇均。准确吸取0. 2ml, 0. 4ml, 0. 6ml, 0. 8ml, 1. 0ml，分别置具塞试管中，分别加水至 2ml，各精密加入5%苯酚溶液Iml，摇勻，迅速精密加入硫酸5 ml，摇勻放置10分钟，置40°C 水浴15分钟，取出，冷却至室温，以蒸馏水做空白，与490nm处测定吸光度，得标准曲线如图 1 所示。回归方程:y=36. 2x+0. 661 ；R2=O. 9937。(2)多糖含量测定
精密称取粗多糖lOOmg，置100 m 1容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度摇均。精密吸取1 ml置具塞试管，加水至anl，其余按上述操作，计算含量。结果为所得美洲凌霄花多糖含量 508mg · g-1。(三)体外实验
本实施例中所述实验对象为ICR小鼠，体重18 22g，扬州大学动物繁殖中心提供，实验动物生产许可证SCXK (苏)2007-0001。1.研究美洲凌霄花多糖对小鼠凝血时间的影响取雄性ICR小鼠，选基础生理凝血时间在40 160s者用于实验，根据基础凝血时间随机分为5组，每组10只，空白组按 0. lml/10g灌胃生理盐水，其余各组均按等体积灌胃相应的药液，分别给美洲凌霄花多糖低剂量50mg/kg、中剂量100mg/kg、高剂量200mg/kg和阿司匹林50mg/kg，每天给药1次，连续给药7d。小鼠于末次给药前禁食不禁水12h，于末次给药后Ih按毛细管法测小鼠凝血时间(末次给药后lh，用长10cm、内径Imm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦后静脉丛中，深约 4 5mm，轻轻转动，自血液注满开始计时，取出毛细管平放于桌上，每隔约1 折断一端约 0. 5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处出现凝血丝所需时间)。结果见表1，与空白组比较，美洲凌霄花多糖能显著延长小鼠凝血时间，阳性药阿司匹林也能显著延长小鼠凝血时间。表1美洲凌霄花多糖对小鼠凝血时间的影响(Mean 士 SD，η = 10)
权利要求
1.美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及美洲凌霄花多糖的应用，特别涉及美洲凌霄花多糖在制备抗凝血药物中的应用。体内给药测定美洲凌霄花多糖对小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间的作用；测定美洲凌霄花多糖对小鼠凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血激酶时间、血浆复钙时间的影响。抗凝血实验结果表明，美洲凌霄花多糖能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，并显著延长小鼠凝血酶时间、凝血酶原时间和血浆复钙时间，显示其主要通过抑制外源性凝血因子活性，使纤维蛋白的生成受到抑制，凝血酶时间显著延长。实验结果确定，美洲凌霄花多糖具有显著的抗凝血作用。
文档编号A61K31/715GK102552308SQ201210070300
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者吴双庆, 姚士, 孙群, 张健, 褚纯隽, 韩海燕 申请人:苏州大学