专利名称：荔枝核黄酮类化合物在制备治疗单纯疱疹病毒脑炎药物上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及荔枝核黄酮类化合物在制备治疗单纯疱疹病毒脑炎药物上的用途，属于医药技术领域。
背景技术：
单纯疱疹病毒(HSV)在人群中的感染极为普遍，而较为严重的是HSV感染能引发单纯疱疹病毒脑炎(HSVE)，又称急性坏死性脑炎，病死率高达50% _70%，存活者致残率高，常有不同程度的脑功能障碍，后遗症严重。目前临床治疗HSV感染主要用疱疹净、阿糖腺苷、无环鸟苷等抗病毒药物，但这些药物副作用较大，如消化道症状明显，常出现过敏和耐药现象。因此，研究和开发新的抗单纯疱疹病毒药物具有重要的现实意义和社会意义。蒸枝核是无患子科植物蒸枝(Litchi chinensis Sonn)的干燥成熟种子,又名蒸仁或荔核，味甘、微苦，我国古代药典记载荔枝核性温、归肝、肾经、能祛寒止痛和行气散结； 荔枝核的化学成分有留类、皂苷、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素、糖类、蛋白质以及无机盐。黄酮类化合物为荔枝核提取物中的主要成分，具有毒性低、副作用小等特点。荔枝核黄酮类化合物除具有降血糖、调血脂和抗氧化作用等多种功效外，还具有抗病毒作用，已有文献报道其具有体外抗こ型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒等多种病毒作用，我们前期也发现其在体外有抗单纯疱疹病毒的作用，但其对由单纯疱疹病毒感染所引起的疱疹性脑炎的治疗作用尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供荔枝核黄酮类化合物在制备治疗单纯疱疹病毒引起的疱疹性脑炎的药物中的应用。本发明发现荔枝核黄酮类化合物在体内可提高单纯疱疹病毒致死感染动物的生存率，加快组织中病毒的清除，临床上可用于单纯疱疹病毒感染引起的疱疹性脑炎病人的治疗。本发明采用的荔枝核黄酮类化合物的提取方法，其过程如下将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取荔枝核粉，加入こ醇溶液，采用微波预处理，恒温提取并间歇震荡，经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍量的无水こ醇静置一段时间后，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收こ醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨ロ锥形瓶中加入预处理好的吸附树脂和上述制备的荔枝核浸出液，于室温下振荡，调节上柱液pH = 5. 0左右，室温下以相应流速吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用こ醇解吸，控制脱附剂流速和脱附剂的用量，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剤，最后获得纯度更高，活性更好的荔枝核黄酮类化合物。荔枝核黄酮类化合物对小鼠感染单纯疱疹病毒具有治疗作用。感染后24小时给药，随着药物剂量的増加，小鼠死亡率降低，平均生存时间延长。
荔枝核黄酮类化合物在动物体内对单纯疱疹病毒具有抑制作用。感染后24小时给药，可降低体内病毒核酸表达水平，减轻组织(脑)病理改变，降低组织(脑、肺、肝)中
病毒滴度。本发明可从荔枝核中获得含量更高、纯度更高的黄酮类化合物，提取的黄酮类化合物对单纯疱疹病毒感染所致疱疹性脑炎有良好的治疗作用。
图I. PCR检测HSV-I感染小鼠不同组织中HSV-I核酸I :100bp标准分子量；2、8、10 :正常小鼠脑、肺、肝组织；3、4、5、6 :病毒感染小鼠
脑组织；7 :病毒感染小鼠肺组织；9 :病毒感染小鼠肝组织；11 :病毒阳性对照；12 :空白对照。图2. HSV-I感染小鼠模型的检测HSV-I感染小鼠脑组织HE染色镜下显示小鼠前脑有明显的淋巴细胞浸润(图 2B)，并有特征性的出血性坏死(图2C)，而正常组无任何病理变化(图2A)，由此可见已成功建立了单纯疱疹病毒感染小鼠模型。图3.荔枝核黄酮类化合物治疗HSV-I感染组小鼠脑组织病理切片A.高剂量组(166. 25mg/kg/d)B.中剂量组(83. 13mg/kg/d) C.低剂量组 (41. 56mg/kg/d)。
具体实施例方式实施例I :荔枝核黄酮类化合物的提取与纯化将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取一定量的荔枝核粉，按照料液比I : 12加入相应体积的浓度为60vol %こ醇溶液，在700W频率微波下作用150S后，恒温提取并间歇震荡， 经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍量的无水こ醇静置一段时间，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收こ醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨ロ锥形瓶中加入600mg预处理好的X-5吸附树脂和450ml上述制备的荔枝核浸出液，并调整上样液质量浓度为0. 5mg/ml，于室温25°C下振荡(180r/min) 24h， 调节上柱液pH = 5. 0,室温下以流速2ml/min吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用85vol% こ醇解吸，控制脱附剂流速为0. 5ml/min，脱附剂的用量为50ml/批，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剤。实施例2 :荔枝核提取物中黄酮的定性鉴定和含量测定I)首先取荔枝核提取物，溶于60vol%こ醇，与HCl-Mg，AlCl3, Pb (Ac)3反应均为阳性，表明荔枝核提取物中含有黄酮类化合物。2)以60vol %こ醇为溶剤，以NaNO2-Al (NO3) 3_NaOH作为显色剂，分别作芦丁标准品及荔枝核提取物的吸收曲线，二者均在508nm有一强吸收峰，故选择508nm为测定波长。 准确称取芦丁标准品5. OOmg，用50VOl%こ醇溶解后定容至50ml容量瓶中，配制成芦丁标准溶液(IOOii g/ml)。精确量取芦丁标准溶液 0. 00、I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 0,6. 0,7. Oml 分别置于25ml容量瓶中，各加入5被％亚硝酸钠溶液Iml摇匀，放置6min，加IOwt%硝酸铝溶液1ml，摇匀放置6min，加4被％氢氧化钠溶液10ml，然后用60vol %こ醇稀释至刻度，摇匀放置15min，试剂为空白作參比，測定吸光度，显色測定吸光度A，用最小二乗法得到回归方程为A = 0. 0049C(u g/ml)+0. 0027。取荔枝核提取物Iml置于25ml容量瓶中，依次加入 5被％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加4% 氢氧化钠溶液10ml，然后用60vol%こ醇定容，摇匀，放置15min，以不含荔枝核提取物的上述试剂作參比液，在508nm处测定吸光度，得到黄酮类化合物的浓度为13. 33333mg mじ1， 从而推知荔枝核中黄酮类化合物质量含量为1.98%。实施例3 :荔枝核黄酮类化合物对小鼠的毒性作用取昆明小鼠40只(雄性)，4 5周龄，16± lg。完全随机法分为5组,姆组8只， 其中包含ー个正常对照组。将荔枝核黄酮类化合物用双蒸水梯度稀释成3436. 25,344. 00、 34. 40,3. 44mg/kg 4组，小鼠空腹4小时后，按每只0. 2ml灌胃，每天I次，连续14天，每天定时补充饲料、水分，更换垫料，室内温度为22±2°C，记录动物体重变化和死亡情況。观察 14天后，发现344. 00mg/kg、34. 40mg/kg、3. 44mg/kg三个不同浓度组中的动物无中毒和死亡情況，结果显示荔枝核黄酮类化合物对昆明小鼠以灌胃给药途径在344. 00mg/kg浓度以下为安全给药浓度。实施例4 :荔枝核黄酮类化合物体内抗单纯疱疹病毒I、致病模型的建立动物室应保持空气新鲜、相対湿度60%，温度22±2°C。4 周 5周龄雄性昆明鼠72只，こ醚麻醉及感染部位常规消毒后，将病毒进行10倍连续稀释 (KT1 10_8)，每个浓度接种8只小鼠，病毒总量0. 02ml/只，脑部接种，位置在小鼠右耳和右眼前缘连线中间，稍偏离正中线的头盖部，将注射针垂直刺入2 3_深，缓慢注射药液。 正常对照组给予无病毒的稀释液。观察2晩，记录小鼠发病、死亡情況，按Reed-Muench法计算半数致死量(Median lethal dose, LD50)。结果为感染后经过短暂潜伏期后，出现震颤、耸毛、弓背、抽搐、体重下降。在脑、 肺、肝组织中均检测到病毒核酸存在，结果见图I。组织病理切片镜下显示小鼠前脑中有明显神经结构的病理改变，并伴有大量的淋巴细胞浸润和出血性坏死灶，结果见图2。该病毒的半数致小鼠死亡剂量(LD50)为IO-5 VO. 2ml。2、体内抗病毒实验实验小鼠随机分成①正常对照组，灌服生理盐水病毒感染对照组，灌服生理盐水；③ACV治疗对照组(100. 00mg/kg/d)，已有文献报道ACV 在100mg/kg/d时对小鼠感染疱疫病毒的治疗效果最好；@蒸枝核黄酮类化合物低剂量组(41. 56mg/kg/d);⑤蒸枝核黄酮类化合物中剂量组(81. 13mg/kg/d) 蒸枝核黄酮类化合物高剂量组(166. 25mg/kg/d);每组小鼠12只，病毒感染剂量采用致死剂量 (IOOLD50)O. 02ml/只，经脑部注射接种。24小时后开始灌胃给药，疗程5天。观察动物的症状和体征，记录各组动物的死亡数和存活天数，比较各组的死亡保护率和平均生存天数(Mean time to death,MTA)0各治疗组动物干治疗结束后第5天和第10天各处死4只小鼠，摘眼球取血并分离血清，同时无菌取脑、肺、肝等脏器，用于组织病理学检查、感染性病毒分离以及病毒核酸检测，各组动物均观察14天后处死。实验结果为荔枝核黄酮类化合物给药组中，高剂量组动物在观察14天后，存活率为67%，与病毒对照组比较，显示有明显差异(p<0.01);但中剂量组和低剂量组的存活率分别为50%和42%，与病毒对照组比较，则均无统计学差异(p>0.05)。荔枝核黄酮类化合物高剂量组的平均存活时间与病毒对照组比较，有统计学差异(p<0.05);但中剂量组和低剂量组的平均存活时间与病毒对照组分别比较，均无统计学差异(P > 0. 05)。详细结果见表I。表I.荔枝核黄酮类化合物对HSV-I所致小鼠病毒性脑炎作用
权利要求
1.荔枝核黄酮类化合物在制备治疗单纯疱疹病毒引起的病毒性脑炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了荔枝核黄酮类化合物在制备治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染所致的病毒性脑炎药物中的应用，具体体现在体内试验发现荔枝核黄酮类化合物在小鼠体内有明显抑制HSV作用，表现为随着药物浓度的增加，小鼠感染症状减轻，死亡率降低，平均存活时间延长，小鼠脑炎症状明显缓解，与病毒对照组相比有显著性差异，且与药物浓度呈正相关。
文档编号A61K131/00GK102600290SQ20121007080
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者侯炜, 彭璇, 朱丹, 李立, 杨艳, 罗凡 申请人:武汉大学