专利名称：人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
树突状细胞(Dendritic cells，简称DC)大约占血液中整个细胞群体的O. 3%，是一种专职抗原递呈细胞，它能够激发和调控机体的免疫应答。树突状细胞的以下几个特点使得它能够有效的递呈抗原激发机体的免疫应答(1)能够通过吞噬作用、胞饮作用和受体介导的内吞作用而高效的捕捉抗原(如凋亡和坏死的细胞微生物及可溶性的外源蛋白等)；(2)具有强的运动性，能够将捕捉到的抗原从外周组织转运到初级和次级淋巴器官；能够高水平表达MHC-I、MHC- II分子，与细胞内加工形成的抗原决定簇形成复合体并表达于树突状细胞表面为激活抗原特异的淋巴细胞提供必需的第一信号；(4)能够高水平表达共刺激分子及粘附分子，为激活抗原特异的T淋巴细胞提供必需的第二信号；(5)能够合成重要的细胞因子(如IL-12和IFN-Y等)，激活多种免疫相关细胞。所以树突状细胞是最有效的抗原递呈细胞，其抗原递呈能力远远强于其他的抗原递呈细胞(如B细胞和巨噬细胞)。肿瘤免疫治疗是放疗、化疗和手术治疗之外的另一种治疗肿瘤的方法，虽然目前这种方法还只处于I期和II期临床研究阶段，但它已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。肿瘤免疫治疗的关键是通过激活机体的免疫系统来清除肿瘤细胞，其中关键的是产生肿瘤特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。广泛的研究表明有效的抗肿瘤CTLs应答需要专职抗原递呈细胞——树突状细胞来激活T淋巴细胞。树突状细胞在激活抗原特异T淋巴细胞及维持T淋巴细胞活性上具有重要作用。目前树突状细胞肿瘤疫苗正在被迅速、广泛的研究，并且已在动物实验和早期的临床实验中取得了很有意义的结果。这些研究结果表明 树突状细胞肿瘤疫苗不仅能够诱发针对原发肿瘤的免疫应答，而且也能够诱发针对转移肿瘤的免疫应答。
发明内容
本发明的目的之一是解决上述问题，提供一种人树突状细胞肿瘤疫苗。本发明的目的之二是提供上述人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法。本发明的目的之三是提供上述人树突状细胞肿瘤疫苗的应用。实现本发明目的之一的技术方案是一种人树突状细胞肿瘤疫苗，它是由葡聚糖诱导获得。实现本发明目的之二的技术方案是一种人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，具有以下步骤①获得CD14+外周血单核细胞和肿瘤抗原用含有GM-CSF和IL-4的培养基培养步骤①获得的CD14+外周血单核细胞IOOh 140h，获得未成熟人树突状细胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培养基中GM-CSF的浓度为80ng/mL 120ng/mL，IL-4的浓度为
330ng/mL 70ng/mL ;③用β -葡聚糖诱导步骤①获得的肿瘤抗原负载到步骤②获得的未成熟人树突状细胞内，获得人树突状细胞肿瘤疫苗；所述β -葡聚糖的浓度为80 μ g/mL 120 μ g/mL。上述步骤①中所述的CD14+外周血单核细胞是由血细胞分离机从人外周血中先分离获得外周血单个核细胞，再通过磁珠分选系统从外周血单个核细胞中分选获得。上述步骤①中所述的肿瘤抗原是通过生物法和/或物理法诱导肿瘤细胞凋亡而获得。即可以单独通过生物法诱导肿瘤细胞凋亡，也可以单独通过物理法诱导肿瘤细胞凋亡，还可以先通过生物法再通过物理法诱导肿瘤细胞凋亡。所述的生物法是采用抗肿瘤化疗药物处理肿瘤细胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者采用紫外线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者对肿瘤细胞进行反复冻融使之凋亡。上述肿瘤为各种恶性实体瘤，包括肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌
坐寸O实现本发明目的之三的技术方案是上述人树突状细胞肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明具有的积极效果是本发明采用β -葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到未成熟的人树突状细胞内，从而得到人树突状细胞肿瘤疫苗，该疫苗能够提高人树突状细胞的免疫效能，促进T细胞的增殖能力，特别能够体外刺激T细胞具有特异性肿瘤杀伤能力，从而用于治疗各种恶性实体瘤。
图I为β -葡聚糖的结构式。图2为未成熟人树突状细胞吞噬β -葡聚糖的示意图。图3为β -葡聚糖影响共刺激分子表达的示意图。图4为β -葡聚糖影响细胞因子浓度的示意图。图5为T细胞的特异性肿瘤杀伤能力的检测示意图。
具体实施例方式(实施例I)
本实施例的人树突状细胞肿瘤疫苗由以下方法获得
①使用费森尤斯血细胞分离机以及与其配套的一次性消耗管路，选择双针单个核细胞程序，输入被采集人相应的参数(性别、身高、体重、血细胞比容等)，根据被采集人具体情况调整血液流速为50mL/min 80mL/min，抗凝剂和全血比例为I : 10，将单个核细胞从人外周血中分离出来，处理全血量不超过自身血量的2倍，获得外周血单个核细胞。将获得的外周血单个核细胞先置于15mL的离心管中,取10 μ L细胞进行计数,然后加入抗人⑶14+免疫磁珠抗体，在108cellS/100l·! L，4°C避光培养15min，接着用2mL的PBS (磷酸盐缓冲液) 洗涤细胞5min，去除上清液，再加入O. 5mL的PBS，最后用自动磁珠分选系统阳性分选获得 ⑶14+外周血单核细胞。将肿瘤细胞(本实施例的肿瘤来源于胃癌)接种于无血清培养基(市售，下同)中， 加入抗肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶继续培养36h后，收集凋亡的肿瘤细胞，然后用PBS洗涤3次，接着将凋亡的肿瘤细胞收集并悬浮于无血清培养基中，在37°C和液氮之间反复冻融5 次，获得肿瘤抗原。②将步骤①获得的CD14+外周血单核细胞洗涤后用无血清培养基制备ImL的细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度至3 X IOVmL,加入6孔培养板中，贴壁此后，收集悬浮细胞，-80°C保存备用。向上述6孔培养板中加入含GM-CSF和IL_4的无血清培养基(GM-CSF浓度为 100ng/mL, IL-4浓度为50ng/mL)，在37°C、5%的CO2的条件下培养CD14+外周血单核细胞， 在培养24h后换液(保证GM-CSF浓度为100ng/mL，IL-4浓度为50ng/mL，下同)一次，在培养72h后再换液一次，培养IOOh 140h获得的细胞即为未成熟人树突状细胞。③将步骤②培养120h获得的未成熟人树突状细胞按照I : 3的细胞数量比加入到步骤①获得的肿瘤抗原中，同时加入β_葡聚糖(β_葡聚糖的浓度为100yg/mL)，诱导 48h，使肿瘤抗原负载到未成熟人树突状细胞中，最后常规离心法洗涤，收集负载了肿瘤抗原的人树突状细胞并悬浮于生理盐水中，获得人树突状细胞肿瘤疫苗。(实验例I、未成熟人树突状细胞能够吞噬β-葡聚糖)
取5Χ IO5个实施例I的步骤①培养120h获得的未成熟人树突状细胞与荧光素DTAF 标记的β -葡聚糖(浓度为20 μ g/mL)在37°C培养lh，马上置于冰上，用预冷的PBS洗涤3 次，进行流式细胞检测。实验结果见图2。由图2可知未成熟人树突状细胞能够吞噬β -葡聚糖。(实验例2、β-葡聚糖对共刺激分子表达以及细胞因子浓度的影响)
本实验例采用三组人树突状细胞进行⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR、CCR7表面标志检测， 判定成熟度。其中第一组为离心收集的实施例I的步骤①培养120h获得的未成熟人树突状细胞。第二组为由葡聚糖(浓度为100 μ g/ml)激发第一组获得的未成熟人树突状细胞48h后的人树突状细胞。第三组为由TNF- α (浓度为20ng/mL)激发第一组获得的未成熟人树突状细胞48h后的人树突状细胞，实验结果见图3。由图3可知由β_葡聚糖激发后的第二组的共刺激分子的表达明显上升。另外，收集上述三组人树突状细胞的培养上清液，检测其细胞因子浓度，结果见图4。由图4可知由葡聚糖激发后的第二组的细胞因子浓度明显上升。(实验例3、T细胞的特异性肿瘤杀伤能力)
将实施例I获得的人树突状细胞肿瘤疫苗与T细胞按照I : 10的数量比混合培养24h， 加入IL-2 (浓度为500U/mL)，收集T细胞，并与靶细胞混合，分别按照效靶比为30 I、 20 UlO 1、5 I的比例加入到培养板中，同时设置最大释放孔、效应细胞自然释放孔、 靶细胞自然释放孔，在37°C、5%的CO2的条件下培养4h后，加入LDH反应液检测。实验结果见图5。由图5可知由实施例I获得的人树突状细胞肿瘤疫苗体外刺激的T细胞具有特异性肿瘤杀伤能力。
权利要求
1.一种人树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于它是由β-葡聚糖诱导获得。
2.根据权利要求I所述的人树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于它是由以下步骤的方法获得①获得CD14+外周血单核细胞和肿瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培养基培养步骤①获得的CD14+外周血单核细胞IOOh 140h,获得未成熟人树突状细胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培养基中GM-CSF的浓度为 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的浓度为 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖诱导步骤①获得的肿瘤抗原负载到步骤②获得的未成熟人树突状细胞内，获得人树突状细胞肿瘤疫苗；所述β -葡聚糖的浓度为80 μ g/mL 120 μ g/mL。
3.根据权利要求2所述的人树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于步骤①中所述的CD14+ 外周血单核细胞是由血细胞分离机从人外周血中先分离获得外周血单个核细胞，再通过磁珠分选系统从外周血单个核细胞中分选获得。
4.根据权利要求2所述的人树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于步骤①中所述的肿瘤抗原是通过生物法和/或物理法诱导肿瘤细胞凋亡而获得。
5.根据权利要求4所述的人树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于所述的生物法是采用抗肿瘤化疗药物处理肿瘤细胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者采用紫外线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者对肿瘤细胞进行反复冻融使之凋亡。
6.权利要求I所述的人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于具有以下步骤①获得CD14+外周血单核细胞和肿瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培养基培养步骤①获得的CD14+外周血单核细胞IOOh 140h,获得未成熟人树突状细胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培养基中GM-CSF的浓度为 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的浓度为 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖诱导步骤①获得的肿瘤抗原负载到步骤②获得的未成熟人树突状细胞内，获得人树突状细胞肿瘤疫苗；所述β -葡聚糖的浓度为80 μ g/mL 120 μ g/mL。
7.根据权利要求6所述的人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于步骤①中所述的CD14+外周血单核细胞是由血细胞分离机从人外周血中先分离获得外周血单个核细胞，再通过磁珠分选系统从外周血单个核细胞中分选获得。
8.根据权利要求6所述的人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于步骤①中所述的肿瘤抗原是通过生物法和/或物理法诱导肿瘤细胞凋亡而获得。
9.根据权利要求8所述的人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于所述的生物法是采用抗肿瘤化疗药物处理肿瘤细胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者采用紫外线照射肿瘤细胞使之凋亡，或者对肿瘤细胞进行反复冻融使之凋亡。
10.权利要求I或2所述的人树突状细胞肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用。该人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法是获得CD14+外周血单核细胞和肿瘤抗原；用含有GM-CSF和IL-4的培养基培养CD14+外周血单核细胞100h～140h获得未成熟人树突状细胞；用β-葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到未成熟人树突状细胞内获得人树突状细胞肿瘤疫苗；β-葡聚糖的浓度为80μg/mL～120μg/mL。本发明采用β-葡聚糖诱导肿瘤抗原负载到未成熟的人树突状细胞内，从而得到人树突状细胞肿瘤疫苗，该疫苗能够提高人树突状细胞的免疫效能，促进T细胞的增殖能力特别能够体外刺激T细胞具有特异性肿瘤杀伤能力，从而用于治疗各种恶性实体瘤。
文档编号A61K39/00GK102600462SQ20121008875
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者宁永玲, 戚春建, 王仕忠, 钱科卿 申请人:戚春建