专利名称：一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗。
背景技术：
狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。由于狂犬病尚无有效的治疗手段，发病死亡率极高，因此，疫苗的预防接种是防止狂犬病发生、保证人民健康的唯一有效手段。 人二倍体细胞(Human Diploid Cell, HDC)狂犬病疫苗是将狂犬病病毒固定毒株在人二倍体细胞上适应、传代增殖、浓缩、纯化而来。因为所用细胞来源于人类，具有副反应小、免疫起效时间短、抗体滴度高等优点，尤其对狂犬病这种高致死性疾病，能够使个体尽快获得保护性抗体是至关重要的。HDCV的缺点在于HDC不太容易培养，而且狂犬病毒在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在空间有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格比较昂贵。在美国，用HDCV暴露后处理一个疗程费用高达一千多美元，这样就限制了该疫苗在发展中国家的使用。由于狂犬病疫苗的特殊性和复杂性，制备该疫苗具有相当的难度，特别是在分离和纯化方面。另外，在狂犬咬伤后通常需要注射大量的破伤风抗毒素，用于预防破伤风梭状芽孢杆菌的感染，这就造成用药的不便。
发明内容
本发明的目的是提供一种能同时预防狂犬病和破伤风的疫苗。本发明的技术方案为一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其由狂犬疫苗和破伤风类毒素组成，所述狂犬疫苗由人用二倍体细胞WI-38接种⑶KHBP-I毒株纯化得到。进一步地，所述破伤风类毒素的量为5 9LF/剂。进一步地，破伤风类毒素可采用任何现有工艺制备，所述狂犬疫苗由以下方法制得
1)人二倍体细胞WI-38的复苏、培养及扩增；
2)在人二倍体细胞WI-38上接种⑶KHBP-I毒株；
3)收获病毒液，灭活、浓缩；
4)纯化；
进一步地，所述纯化包括以下步骤
1)超滤纯化；
2)蔗糖密度区带离心；
3)Sepharose4FF柱层析纯化；
4)加入纳米氢氧化铝佐剂吸附，加保护剂人血白蛋白。本工艺使用的人二倍体细胞种来源于中国疾病预防控制中心，先建立人二倍体细胞种子库和工作库，并对细胞库细胞进行系统的鉴定，在制备疫苗前，先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞培养液，所述的培养液可以选择199培养液、平衡盐培养液，其中优选199培养液，细胞培养液中含2 10%的牛血清和卡那霉素或庆大霉素26 30U/ml，pH7. 0 7. 5，其培养温度为35 37°C，培养方式为转瓶培养、细胞工厂培养或微载体反应器培养。 培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1:2 1:4当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬病病毒，细胞维持液中最好加入0. 3 0. 5% (W/W)的人血白蛋白，同时调整PH7. 0 7. 5，培养温度35 37°C，并可加入抗生素适量，可使用的培养液包括199液、平衡盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株CDKHBP-I毒株0. I 0. Olmol及上述细胞维持液，培养66 79小时，即可收获病毒液。狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是3 5天收获一次，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8. 0LgLD50/ml。本工艺在人二倍体细胞上接种的狂犬病毒为在传代的人二倍体细胞狂犬病毒，实验结果显示，狂犬病毒在人二倍体细胞上能很好生长繁殖，在人二倍体细胞上传代狂犬病毒10代以内很稳定，10代以上的毒株免疫原性则有明显下降。即接种人二倍体细胞上的狂犬病毒最好是10代以内的。收获的病毒液用13-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗，本工艺选用超滤浓缩的方法对粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万 30万的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上，然后纯化疫苗。所述纯化包括以下步骤病毒液先经超滤纯化除去部分杂蛋白，再经过蔗糖密度区带离心，然后经过Sepharose4FF柱层析。本工艺的纯化方法中超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗反复如此6 7次，牛血清残量可以去除95%以上，再经过蔗糖密度梯度离心，用38%和45% (W/W)的蔗糖密度梯度，21000 24000rpm超速离心4小时，经紫外吸收峰检测抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒所在位置，收集病毒。再经S印har0Se4FF柱层析纯化。经三步层析柱纯化后，疫苗总蛋白的减少约99%以上，残留血清量比2010版药典规程所规定的更低。采用超滤纯化初步纯化,鹿糖密度梯度离心法和Sepharose4FF凝胶过滤层析进行进一步提纯。测试结果表明，经过本发明的三步提纯后，可使疫苗细菌内毒素去除率可达87. 5% 98. 7%，总蛋白含量减少约99%以上，牛血清残余用量等均符合中国药典2010版关于生物制品规程的要求，加入纳米氢氧化铝佐剂后可使疫苗的稳定性大大提高，且效价提高25%，接种时减缓病毒释放的速度，保持良好的抗体水平,通过纯化疫苗持久刺激机体产生抗体。CDKHBP-I毒株为市售，来自于成都康华生物制品有限公司。狂犬病属于弹状病毒科狂犬病属，病毒基因组由约12kb的单股负链RNA组成，由3 ‘端至5’端依次排列着N、P、 M、G和L5个结构基因，分别编码核蛋白、憐蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶蛋白。其中由G基因编码的糖蛋白，是病毒与宿主细胞结合的本体，倡导了病毒与靶细胞的结合及在神经系统的分布，免疫方面主要保护作用，刺激机体产生中和抗体，保护机体抵抗病毒的感染。当前疫苗的效价主要取决于疫苗制剂中的糖蛋白含量。通过转基因技术，在巴斯德PM株全基因组3’-N-P-M-G-L_5’的G和L之间插入一个G基因，构建了携带双G基因的毒株，命名为⑶KHBP-I。狂犬病毒⑶KHBP-I株在WI-38细胞上多次进行传代接种病毒，观察细胞形态、透明度、折光性与接种狂犬病毒PM株无明显差异，故CDKHBP-I株适应人二倍体细胞。WI-38细胞接种⑶KHBP-I毒株后收获的多批次病毒液，通过噬斑法测定病毒滴度，平均滴度达到106_ 5FFU/ml，高于PM株IO6 Vml的平均滴度。将⑶KHBP-I病毒收获液经超滤浓缩，病毒纯化后制成冻干疫苗，接种小白鼠，小白鼠产生高水平中和抗体时间大体在11天左右，较PM株14天产生高水平中和抗体提前了 2-3天.，其效价平均水平达到6. 0IU， 高于PM株平均效力。注射豚鼠，豚鼠无异常现象，生长状况良好。综上，⑶KHBP-I株糖蛋白表达量优于PM株，从而提高了机体的免疫力，产生的抗体水平较高，疫苗的效价较高，接种豚鼠无毒性异常现象发生。本发明与现有技术相比具有如下优点
通过采用将本发明的制备方法制备的狂犬疫苗和破伤风类毒素联用，不仅能免疫狂犬病，还能免疫破伤风，且破伤风类毒素还能明显增加狂犬病疫苗的效价作用，起到增强免疫的效果，用药方便。
具体实施例方式 以下通过实施进一步说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定。实施例I
一.先对人二倍体细胞WI-38进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。使用动物细胞培养液199培养液，细胞培养液中加入2的牛血清和卡那霉素26U/ml，pH7. 0，其培养温度为35°C，培养方式为转瓶培养。培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，本实施例选择1:2，当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬病病毒，细胞维持液中加入0. 3% (W/W)的人血白蛋白，同时调整pH7. 0，培养温度35°C，并可加入抗生素适量，接种时先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株⑶KHBP-I毒株0. Imol，培养66小时，即可收获病毒液。狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是3 5天收获一次，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8. 0LgLD50/ml。收获的病毒液用13-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗，
超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗反复如此6次，牛血清残量可以去除95%以上，再经过蔗糖密度梯度离心，用38%和45% (W/W)的蔗糖密度梯度，2IOOOrpm超速离心4小时，经紫外吸收峰检测抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒所在位置，收集病毒，再经Sephar0Se4FF柱层析纯化。经三步层析柱纯化后，疫苗总蛋白的减少约99%，并加入纳米氢氧化铝佐剂。二.采用现有技术中任一制备破伤风类毒素的方法制备破伤风类毒素。
三.向上述制备的狂犬疫苗中按一剂量加入9LF/剂的破伤风类毒素即得成品。实施例2
一.先对人二倍体细胞WI-38进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。使用动物细胞培养液199培养液，细胞培养液中加入10%的牛血清和庆大霉素30U/ml，PH7. 5，其培养温度为37°C，培养方式为微载体反应器培养。培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，本实施例选择1:4，当细胞长成致密单层后，即可接种狂犬病病毒，细胞维持液中最好加入0. 5% (W/W)的人血白蛋白，同时调整pH7. 5，培养温度37°C，并可加入抗生素适量，可使用的培养液包括199液、平恒盐液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已生长致密单层的人二倍体细胞上接种狂犬病毒毒株⑶KHBP-I毒株0. Olmol，培养79小时，即可收获病毒液。 狂犬病毒在人二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是3 5天收获一次，要求每批所收获病毒液病毒滴度均应不低于8. 0LgLD50/ml。收获的病毒液用13-丙内酯灭活病毒得到的是粗制疫苗。灭活后的粗制疫苗要进行浓缩提纯制备成纯疫苗，
超滤纯化即把疫苗超滤浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS冲洗，再浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗反复如此7次，牛血清残量可以去除95%以上，再经过蔗糖密度梯度离心，用38%和45% (W/W)的蔗糖密度梯度，24000rpm超速离心4小时，经紫外吸收峰检测抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒所在位置，收集病毒。再经Sephar0Se4FF柱层析纯化。二.采用现有技术中任一制备破伤风类毒素的方法制备破伤风类毒素。三.向上述制备的狂犬疫苗中按一剂量加入5LF/剂的破伤风类毒素即得成品。经检测按照实施例I的方法制备的狂犬疫苗，其效价为4. 8IU/ml,当加入9LF的破伤风类毒素后，其效价达到7. 2IU/ml ;按照实施例2的方法制备的狂犬疫苗，其效价为
4.6IU/ml,当加入5LF的破伤风类毒素后，其效价达到6. 7IU/ml。
权利要求
1.一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于其由狂犬疫苗和破伤风类毒素组 成，所述狂犬疫苗由人用二倍体细胞WI-38接种⑶KHBP-I毒株纯化得到。
2.根据权利要求I所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于所述破伤风类毒素的量为5 9LF/剂。
3.根据权利要求I所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于所述狂犬疫苗由以下方法制得 1)人二倍体细胞的复苏、扩增培养； 2)在人二倍体细胞上接种⑶KHBP-I毒株； 3)收获病毒液，灭活、浓缩； 4)纯化。
4.根据权利要求3所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于所述纯化包括以下步骤 1)超滤纯化； 2)蔗糖密度区带离心； 3Sepharose4FF柱层析纯化； 4)佐剂吸附，加保护剂人血白蛋白。
5.根据权利要求3所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于步骤I)中细胞培养液为199培养液，且该细胞培养液中含牛血清的体积分数为2 10%、卡那霉素或庆大霉素26 30U/ml，并调pH至7. O 7. 5，其培养温度为35 37°C，扩增培养方式为转瓶培养、细胞工厂培养、微载体反应器培养中的一种。
6.根据权利要求3所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于灭活采用β_丙内酯灭活，用截留10万 30万的超滤器浓缩疫苗，浓缩至20倍以上。
7.根据权利要求4所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于所述纯化的具体方法为加入适量的PBS冲洗，再浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗反复6 7次；再经过蔗糖密度梯度离心，用38%和45% (W/W)的蔗糖密度梯度，21000 24000rpm超速离心4小时，经紫外吸收峰的抗原含量，蛋白浓度的分析，确定病毒所在位置，再经Sepharose4FF柱层析纯化。
8.根据权利要求4所述的一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，其特征在于所述佐剂为纳米氢氧化招。
全文摘要
本发明公开了一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗，属于疫苗领域，其由狂犬疫苗和破伤风类毒素组成，所述狂犬疫苗由人用二倍体细胞WI-38接种CDKHBP-1毒株纯化得到。通过采用将本发明的制备方法制备的狂犬疫苗和破伤风类毒素联用，不仅能免疫狂犬病，还能免疫破伤风，且破伤风类毒素还能明显增加狂犬病疫苗的效价作用，起到增强免疫的效果，用药方便。
文档编号A61P31/04GK102671194SQ20121013789
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者侯文礼, 冯晓, 蔡勇, 钟泽荣 申请人:成都康华生物制品有限公司