专利名称：一种具有完整红血球功能的新的血液替代品的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及人造血液替代品及其使用和制造的方法。特别是，人造血液替代品包含可溶性复合物，该复合物的制备是通过将无基质血红蛋白(SFHb)或血红蛋白(Hb)与抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]以及具有酸-碱平衡及ニ氧化碳转运功能的酶(碳酸酐酶，CA)交联，从而形成聚-[SFHb-SOD-CAT-CA]可溶性复合物。
背景技术：
在急救和外科手术中对输血需求的提高导致了对红血球(RBC)替代品的迫切需求。我们对不同类型的携氧血液替代品进行了调查。此类产品中的一种是基于纳米生物技术的聚血红蛋白(polyHb)。将血红蛋白与双功能的试剂如ニ酸或戊ニ醛交联可导致polyHb的形成。研究显示这些4-5个血红蛋白(Hb)分子的复合物可以通过维持Hb水平在ー个安全范围内并且转运足够的氧从而补充外科手术中的失血。其中两种纳米生物技术产品已达到了 III 期临床试验[Jahr JS et al, J Trauma 64 1484-97 (2008) and Moore EEet al, J Am Coll Surg. 208 :1-13 (2009)]，但是由于副作用，美国FDA并未批准这些产品。这些副作用包括在给予聚血红蛋白的急救创伤患者中，有3%的心肌梗死发生率，而相比之下，只接受盐溶液的患者只有0.6%的发生率。这很可能是由于缺血再灌注损伤引起的，尤其对于那些之前有缺血性心脏病的患者而言。此外，在所有的血红蛋白休克的病例中，也存在ニ氧化碳的积聚和酸碱的变化[Moore EE et al, J Am Coll Surg. 208 :1-13 (2009)]。基于血红蛋白的血液替代品如polyHb相较于献血者供血的优势为(I)它们不含有血型抗原。因此它们可以当场立即输血而不需要将患者转移至医院进行交叉配血和血型鉴定，而这对献血者供血而言是需要的。这在急救或在自然或人为灾难中转移很困难的时候尤其重要。(2)与RBC不同，polyHb可以进行灭菌处理，因此在流行病的情况下不存在传染物的可能(现在，在将来的其他类型感染起因的流行病中，AIDS和由此导致的HIV污染的献血者供血的早期案例就可以避免)。(3)献血者供血必须储存于4°C并且只能保存大约42天。PolyHb可以储存于室温一年多。这就使PolyHb可以保存于塑料袋中放在任何可能需要该产品的地方至少I年，并且如果保存于更低温度的话时间可以更长。然而，polyHb只具有RBC三种重要功能的其中ー种。RBC的三种重要功能为(I)转运和供给氧，(2)转运和清除ニ氧化碳，(3)清除有害的氧自由基。目前，polyHb形式的产业化的RBC替代品只能转运氧，并且由于副作用的原因，它们未获得美国FDA的批准。此外，RBC提取物的抗氧化酶SOD和CAT的活性不够用于预防在严重的失血性休克，中风，心肌梗死及其他情况下的缺血再灌注损伤。现已将SOD和CAT与polyHb结合形成poIyHb-SOD-CAT (D，AgniIIo和Chang拥有的美国专利5，606, 025)。然而，该复合物仍然缺少RBC的ー种重要的功能，即它不能从血液中转运和清除ニ氧化碳，因此会引发副作用。因此，需要具有RBC全部三种功能的更完善的RBC替代品来治疗失血。此外，还需要更完善的RBC替代品来预防缺血再灌注损伤。
发明内容
根据实施例，提供了ー种可溶性复合物，其包含与用于减少活性氧簇的抗氧化酶和用于转运CO2和O2的酸-碱平衡及ニ氧化碳转运酶交联的血红蛋白。抗氧化酶可以选自超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，或其组合。抗氧化酶可以是超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的组合。
血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)的比例可以为约Ig 4000U至约Ig 25000U。血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)的比例可以约为Ig 18000U。血红蛋白与过氧化氢酶(CAT)的比例可以为约25，OOOU至约Ig 310, OOOU0血红蛋白与过氧化氢酶(CAT)的比例可以约为Ig 310000U。酸-碱平衡及ニ氧化碳转运酶可以包括碳酸酐酶(CA)。血红蛋白与碳酸酐酶(CA)的比例可以为约Ig 80000U至Ig 250000U。血红蛋白与碳酸酐酶(CA)的比例可以约为Ig 130000U。血红蛋白可以包括无基质血红蛋白(SFHb)或血红蛋白(Hb)。可溶性复合物可以具有大于IOOkDa的分子量。可溶性复合物可以具有大于约IOOkDa至大于约450kDa的分子量。根据另ー个实施例，提供了ー种人造血液替代品，其包含以适宜的药液形式存在的本发明的可溶性复合物。根据另ー个实施例，提供了一种治疗疾病症状的方法，包括给需要的患者施与治疗有效剂量的本发明的可溶性复合物，或本发明的人造血液替代品。该疾病症状可以选自失血，ニ氧化碳积聚性症状，缺血再灌注损伤和潜水员病。缺血再灌注损伤可以包括严重的失血性休克，中风，心肌梗死，或其组合。根据另ー个实施例，提供了 ー种从流体中清除ニ氧化碳的方法，包括用有效剂量的本发明的可溶性复合物，或本发明的人造血液替代品来处理该流体。该流体可以选自血液和空气。该流体可以是透析的血液。该流体可以是人工肺中的血液。该流体可以是将环境中CO2清除后的空气。根据另ー个实施例，提供了本发明的可溶性复合物的用途，用于制备治疗疾病症状的药物。根据另ー个实施例，提供了本发明的可溶性复合物的用途，用于治疗疾病症状。根据另ー个实施例，提供了本发明的人造血液替代品的用途，用于制备治疗疾病症状的药物。根据另ー个实施例，提供了本发明的人造血液替代品的用途，用于治疗疾病症状。该疾病症状可以选自失血，ニ氧化碳积聚性症状，缺血再灌注损伤，潜水员病。
缺血再灌注损伤包括严重的失血性休克，中风，心肌梗死，或其组合。根据另ー个实施例，提供了本发明的可溶性复合物或本发明的人造血液替代品的用途，用于处理流体来清除其中的ニ氧化碳。该流体可以选自血液和空气。该流体可以是人工肺中的血液。该流体可以是透析的血液。通过以下详细描述，结合附图
，本发明更多的特点和优势可以得以明确图I说明碳酸酐酶活性(CA) (I)无基质血红蛋白(SFHb)-有CA活性的红血球成分(SFHb) ；(2)聚无基质血红蛋白(polySFHb)-交联形成polySFHb的红血球成分，具有很低的CA活性；(3)无基质血红蛋白+S0D+CAT+CA(SFHb+S0D+CAT+CA)_酶不通过交联直接添加到红血球成分的提取物中，以及(4)聚-[Hb-SOD-CAT-CA] (Poly-[Hb-SOD-CAT-CA])表示根据本发明的实施例用上述组分交联形成的Poly-[Hb-SOD-CAT-CA]，由此产生令人满意的CA活性。SFHb :无基质血红蛋白；PolySFHb :交联的无基质血红蛋白；SFHb+S0D+CAT+CA :每克 SFHb 添加 15000U S0D,300, 000UCAT 和 15，300U CA ；Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]:交联的SFHb+SOD+CAT+CA。图2说明超氧化物歧化酶(SOD):无基质血红蛋白(SFHb)-具有很低的SOD活性的红血球成分(SFHb);聚无基质血红蛋白(polySFHb)-交联形成polySFHb的红血球成分，具有很低的SOD活性；无基质血红蛋白+S0D+CAT+CA (SFHb+SOD+CAT+CA)-酶不通过交联直接添加到红血球成分的提取物中，以及聚-[SFHb-SOD-CAT-CA](Poly- [SFHb-SOD-CAT-CA]) _表示根据本发明的实施例用上述组分交联形成的Poly- [SFHb-SOD-CAT-CA]，由此产生的SOD活性大大提高。SFHb :无基质血红蛋白；PolySFHb :交联的无基质血红蛋白；SFHb+SOD+CAT+CA 每克SFHb添加15000U S0D、300，OOOU CAT 和 15，300U CA ；Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]:交联的 SFHb+SOD+CAT+CA。图3说明过氧化氢酶的活性(CAT):无基质血红蛋白(SFHb)-具有很低的SOD活性的红血球成分；聚无基质血红蛋白(polySFHb) -交联形成polySFHb的红血球成分,具有很低的SOD活性；无基质血红蛋白+S0D+CAT+CA(SFHb+SOD+CAT+CA) -酶不通过交联直接添加到红血球成分的提取物中，以及聚-[SFHb-SOD-CAT-CA] (Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA])表示根据本发明的实施例用上述组分交联形成Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]，由此产生的CAT活性大大提高。SFHb :无基质血红蛋白；PolySFHb :交联的无基质血红蛋白；SFHb+SOD+CAT+CA 每克 SFHb 添加 15000U S0D,300, OOOU CAT 和 15，300U CA ；Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]:交联的 SFHb+SOD+CAT+CA。图4说明根据本发明的实施例获得的可溶性复合物的体内实验。RBC:全血，PHcsc :酶活性低的 PolyHb，PHCSC :酶活性高的 PoIyHb-PoIyHbCAT-SOD-CA。
具体实施例方式在实施例中，公开了可溶性复合物，它是通过将血红蛋白与抗氧化酶和酸-碱平衡及ニ氧化碳转运酶交联而形成的。红血球提取物包含带有很低抗氧化酶(如SOD和CAT)活性以及酸碱平衡及ニ氧化碳转运(CA)活性的血红蛋白。然而，当直接交联这些酶时，SODjCAT和CA的酶活性会极大地降低至大大低于最优的水平。并且，红血球提取物中的抗氧化酶(如SOD和CAT)并不足够用于预防严重的失血性休克，中风，心肌梗死和其他疾病中发生的缺血再灌注损伤。此外，交联之后的CA水平不足以维持酸-碱平衡及ニ氧化碳转运功能，尤其是在严重的缺血吋。因此，根据本发明的实施例，本发明的可溶性复合物(例如Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA])包含RBC的三种功能它是具有抗氧化活性(SOD，CAT)以及可以促进转运和酸碱平衡功能(CA活性)的氧载体(PolySFHb)。它也包含增强的S0D，CAT和CA的活性从而增强了这种新的红血球替代品的功能。这种交联的聚血红蛋白Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]中的SOD和CAT水平比在RBC中要高得多。因此,相信它也可以用作治疗剂来治疗或预防缺血再灌注损伤，并且可以促进清除在严重的失血性休克和其他疾病中积聚的ニ氧化碳。根据本发明的实施例，可溶性复合物中的血红蛋白成分作为ー种氧载体。可溶性复合物的血红蛋白成分可以由任何合适的血红蛋白制备获得，合适的血红蛋白是由红血球，人或动物(牛，猪等等)或重组或其他类型的生物体，甚至合成的血红蛋白中提取的。 本发明的可溶性复合物也包括治疗有效剂量的抗氧化酶。抗氧化酶可以是超氧化物歧化酶(S0D)，过氧化氢酶(CAT)，或其组合。这些酶可以来自外源于血红蛋白的来源。SOD酶与血红蛋白成分的比例可以相应是Ig血红蛋白比4000U至25000U的S0D。优选地，血红蛋白与超氧化物歧化酶(SOD)的优选比例约为Ig 18000U。CAT酶与血红蛋白的比例可以相应是Ig血红蛋白比25000U至310，OOOU的CAT。优选地，血红蛋白制品与上述过氧化氢酶(CAT)的比例约为Ig 310000U。本发明的可溶性复合物也包括治疗有效剂量的酸碱平衡及ニ氧化碳转运酶。优选地，酸碱平衡及ニ氧化碳转运酶可以是碳酸酐酶(CA)，但是也可以使用带有相同活性的合成酶(例如具有提供CA活性所必需的活性位点的合成酶)。这些酶可以来自外源的来源。CA酶与血红蛋白成分的比例可以相应是约Ig血红蛋白比80000U至250000U的CA。优选地，血红蛋白与上述碳酸酐酶(CA)的比例为约Ig 130000U。可溶性复合物的成分是化学连接的，因为当血红蛋白和酶以游离形式输入后会被迅速分开，并且它们可能也会引起有害作用。尤其是敏感性，过敏性和免疫性反应。因此，根据本发明的实施例，可溶性复合物可以是Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]，其中SFHb，SOD, CAT和CA是互相交联的。本发明的SOD和CAT的活性比正常存在于RBC中的要高很多，因此可以增强抗氧化活性。增强的活性可预防氧自由基的有害作用，这对于在严重的失血性休克，中风，心肌梗死中所面临的缺血再灌注是很重要的。CA活性很重要是因为在任何失血性休克或缺血性状况下，也会有ニ氧化碳的积聚，这也是需要清除的。根据另ー个实施例，可溶性复合物Poly-[SFHb-S0D-CAT-CA]可以具有至少IOOkD的分子量。优选地，Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]可溶性复合物的分子量为约IOOkDa至大于450kDa，最优选地，Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]可溶性复合物具有大于450kDa的分子量。下面表 I 显示 Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]的分子量分布和酶活性。Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]显示三种分子量成分(I)低(く IOOkDa)，(2)中等(100-450kDa)，以及(3)高分子量(>450kDa)。样品包含约86%分子量高于IOOkDa的成分。将低分子量部分(く IOOkDa)去除。Hb，SOD, CAT和CA的大部分活性(分别为70%，82%，90%和84% )保留于分子量大于450kDa的Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]部分中。分子量在IOOkDa和450kDa之间的部分所含的Hb，SOD, CAT和CA活性分别为16%，11%，9%和13%。分子量小于IOOkDa的部分的Hb, SOD，CAT和CA的活性更低(14%，5%，0. 5%和0. 05% )——该部分包含未交联的Hb和
酶并且被去除。表I Poly-[SFHb-SOD-CAT-CA]的分子量分布和酶活性
权利要求
1.ー种可溶性复合物，包含与用于减少活性氧簇的抗氧化酶和用于转运CO2和O2的酸-碱平衡及ニ氧化碳转运酶交联的血红蛋白。
2.如权利要求I所述的可溶性复合物，其中所述抗氧化酶选自超氧化物岐化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，或其组合。
3.如权利要求2所述的可溶性复合物，其中所述抗氧化酶是超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的组合。
4.如权利要求2至3中任一项所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述超氧化物岐化酶(SOD)的比例为Ig 4000U至约Ig 25000U。
5.如权利要求2至3中任一项所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述超氧化物岐化酶(SOD)的比例为约Ig 18000U。
6.如权利要求2至3中任一项所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述过氧化氢酶(CAT)的比例为 Ig 25000U 至约 Ig 310000U。
7.如权利要求2至3中任一项所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述过氧化氢酶(CAT)的比例为约 Ig 310000U。
8.如权利要求1-7中任一项所述的可溶性复合物，其中所述酸-碱平衡及ニ氧化碳转运酶包括碳酸酐酶(CA)。
9.如权利要求8所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述碳酸酐酶(CA)的比例为Ig 80000U 至约 Ig 250000U。
10.如权利要求8所述的可溶性复合物，其中血红蛋白与所述碳酸酐酶(CA)的比例为约 Ig : 130000U。
11.如权利要求1-9中任一项所述的可溶性复合物，其中所述血红蛋白包括无基质血红蛋白(SFHb)或血红蛋白(Hb)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的可溶性复合物，其中所述可溶性复合物具有大于约IOOkDa的分子量。
13.如权利要求1-11中任一项所述的可溶性复合物，其中所述可溶性复合物具有约大于IOOkDa至大于450kDa的分子量。
14.ー种人造血液替代品，包含以适宜的药液形式存在的权利要求1-13中任一项所述的可溶性复合物。
全文摘要
本发明涉及一种可溶性复合物，其包含与抗氧化酶和酸碱平衡及二氧化碳转运酶交联的血红蛋白。交联可以增强可溶性复合物在体内的循环时间，并防止了在体内的有害作用，该有害作用能够被易受可溶性复合物的每种游离成分影响的人体所承受。
文档编号A61K38/42GK102861323SQ201210179670
公开日2013年1月9日 申请日期2012年5月28日 优先权日2011年5月26日
发明者张明瑞, 卞玉珠 申请人:张明瑞, 卞玉珠