诊断、预防或治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病的组合物的制作方法

专利名称：诊断、预防或治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因治疗组合物，其用于将治疗基因、标记基因或其产物转移到细胞，所述细胞表达白细胞介素-8 (interleukin-8, IL-8)或生长调节致癌基因α(growth-regulated oncogene- α , GRO- α ),且诱导脐带血来源间质干细胞或从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(UCB-MSC)的趋向性(trop i sm)，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC。 本发明还涉及在基因疗法中使用包含UCB-MSC的组合物来治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病或脑肿瘤。本发明还涉及一种使用UCB-MSC来诊断脑肿瘤、预防脑肿瘤、治疗脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物或试剂盒。
背景技术：
众所周知干细胞会向病变部位迁移。最近发现骨髓来源间质干细胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)对多种肿瘤具有趋向性且会向肿瘤部位迁移。所述BM-MSC可迁移到特定肿瘤部位，可以证明是适用于基因疗法的工具。举例来说，对多种肿瘤具有趋向性的BM-MSC可用作将治疗性自杀基因转移到肿瘤部位的运载体(vehicle)[参见A. L.彭特(Ponte A. L.)等人，干细胞(StemCells)，25，1737-1745(2005) ；C. Μ.凯勒(Kahler C. Μ.)等人，呼吸研究(Respir Res)
8,50 (2007)] ο尽管发现这一有趣现象，但调控MSC运输(trafficking)到肿瘤的分子机制并不清楚。经数年研究，越来越多的证据表明BM-MSC迁移的诱导似乎是由数种可溶性因子所刺激。最近，已证实从乳癌细胞分泌来的单核细胞趋化蛋白-I (monocytechemoattractant protein-1, MCP-1)可刺激 BM-MSC 迁移[参见 R. Μ.杜威(Dwyer R. Μ.)等人临床癌症研究(Clin Cancer Res) 13，5020-5027 (2007)]。此外，趋化因子配体2(chemokine ligand2,CCL2)以及趋化因子配体 10 (chemokine ligandlO,CCL-10)可诱导神经祖细胞迁移到大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAo)中风模型中的受损部位[参见神经科学研究杂志(J Neurosci Res)85，2120-2125 (2007)]。胰岛素样生长因子-1( insulin-like growth factor-1, IGF-1)可显著增加大鼠BM-MSC迁移应答[参见Y.李(Li Y.)等人,生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)356，780-784 (2007)]。因此，鉴定影响MSC迁移事件的可溶性因子对于了解MSC如何向肿瘤或受损组织迁移很重要。被引入BM-MSC中的多种基因在体内(in vivo)过表达并显示生物活性。举例来说，引入有人血管生成素-I (hAngl)基因的BM-MSC可刺激急性心肌梗塞模型动物的梗塞部位中形成血管[参见L.孙(Sun L.)等人,生物化学与生物物理研究通讯(BiochemicalBiophysical Research Communi cat ion )357 (2007) 779-784],过表达 Akt 的 BM-MSC 意外地治疗心肌梗塞并改善心脏功能[参见N.尼古拉斯(Nicolas N.)等人,分子疗法(MolecularTherapy) 14(6),840-850, 2006]，经Bcl_2基因修饰的BM-MSC防止细胞凋亡并改善心脏功能[参见干细胞(Stem Cells) 25，2118-2127(2007)]，以及过表达内皮一氧化氮合成酶的BM-MSC可恢复由肺动脉高压所引起的右心室损伤[参见幸子(Sachiko)等人，循环(Circulation), 114[增刊I] : I-181-I-185]。这些结果表明引入有基因的MSC可用作基因疗法的工具。同时，一般来说，中枢神经系统的细胞受到很好的调控，其中中枢神经系统由脑和脊髓组成。然而，当这种调控崩溃时，细胞连续分裂且形成肿瘤。肿瘤可分成良性肿瘤或恶性肿瘤。中枢神经系统内具有神经元，和支持与保护神经元的胶质细胞。在胶质细胞中形成的肿瘤被称为胶质瘤。胶质瘤占原发性脑肿瘤的50%且占原发性脊髓肿瘤的15%。另外，脑肿瘤包含神经肿瘤、血管肿瘤以及腺体肿瘤。也存在由身体其它部位中所形成的其它肿 瘤引起的继发性脑肿瘤。继发性脑肿瘤是最常见类型的脑肿瘤。脑肿瘤因肿瘤所处部位而难以治疗。可通过物理手术或化学疗法来治疗脑肿瘤。在物理手术中，当肿瘤部位被完全去除时，可能会出现并发症。在化学疗法中，由于脑血屏障(brain-blood barrier)而需要注射高浓度抗癌药,因此会严重损伤其它器官。最近，已使用基因疗法来治疗脑肿瘤。在基因疗法中，通过使用病毒载体来引入抑制癌细胞生长的基因。因为所述病毒载体不具有向癌症靶部位选择性迁移的能力，所以对病毒载体进行表面修饰来获得这种能力。然而，将病毒载体迁移到癌症靶部位的量是有限的。有人已揭示关于寻家效应(homing effect)(干细胞向疾病部位迁移的一种现象)的研究结果，表明干细胞可适合作为治疗脑肿瘤的传递媒介物。然而，调控干细胞运输到肿瘤的机制并不清楚。众所周知神经干细胞对一类脑肿瘤(即恶性胶质瘤)具有趋向性。基于这一理论，正在研究一种通过使用神经干细胞充当运载体来将多种基因转移到脑肿瘤部位的方法(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J) 9 (3)，189-204，2003 ;SK金(Kim SK)等人，临床癌症研究(Clin Cancer Res) 12 (18)，5550-5556，2006)。叶(Yip)等人发现脑肿瘤可用携带有免疫调节基因、细胞凋亡促进基因、前药转化酶、溶瘤病毒等的神经干细胞来治疗。经布朗(Brown)等人鉴定，通过将含胞嘧啶脱氨酶基因的载体注入脑中，可有效治疗脑肿瘤，其中胞嘧啶脱氨酶基因将5-氟胞嘧啶(5-fluorOCytOSine，5-FC)变为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，其中5-FU是抗癌药而5-FC是5-FU的前药(参见AB 布朗(Brown AB)等人，人类基因疗法(Human Gene Ther. ) 14 (18)，1777-1785，2003)。厄特山姆(Ehtesham)等人报道了通过注射被处理成传递白细胞介素_12或肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体的神经干细胞，来减缓脑肿瘤的生长(癌症研究(Cancer Res)62, 5657-5663, 2002 ;癌症研究(Cancer Res)62，7170-7174，2002)。然而，在临床实验中使用神经干细胞引起与如何取得神经干细胞有关的伦理问题，以及由同种异体移植造成的免疫排斥反应。因此，需要寻找不引起这些问题且可轻易获得的其它类型干细胞。秋田(Akira)等人揭示了 BM-MSC对脑肿瘤具有趋向性(参见癌症研究(CancerRes)65 (8)，3307-3316，2005)。BM-MSC可取自患者。当通过自体移植来注射BM-MSC时，不会出现免疫排斥反应，这对于临床上使用是个优点。研究中，通过颈动脉将人BM-MSC注入颅骨中移植了人胶质瘤细胞系的裸小鼠。结果，仅在胶质瘤中见到人BM-MSC而在脑中相邻于胶质瘤的正常部分中未见到。另外，即使当将人BM-MSC移植到颅骨中时，人BM-MSC也向胶质瘤迁移。当将人BM-MSC用含有IFN-β基因cDNA的腺病毒载体感染并接着通过颈动脉将所得载体注入裸小鼠移植了胶质瘤的颅骨中时，裸小鼠的寿命增加。W007/037653A1揭示了一种治疗癌症的组合物，其包括表达胞嘧啶脱氨酶基因的BM-MSC。然而，在这种情况下，因为BM-MSC是通过多个复杂过程获得，所以被从中取得BM-MSC的个体遭受长时间的心理和身体压力。因此，需要寻找其它类型的干细胞。·与骨髓不同,具有许多MSC的脐带血(umbilical cord blood,UCB)可从分娩过程中丢弃的脐带轻松取得。而且UCB储存产业已完善建立，因此容易找到供体。即使当使用从其它人类诱导式UCB取得的MSC时，在移植后也不会出现免疫排斥反应。据此，可获得高免疫稳定性。因而，鉴定疾病(诸如脑肿瘤)是否可根据UCB MSC的趋向性来治疗是极其重要的。然而，所述鉴定UCB-MSC可用性的尝试尚未有人进行。本说明书中所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。而且本说明书中所揭示的所有信息都仅用于帮助理解本发明概念的背景而不可视为现有技术。

发明内容
技术难题最近开发的靶基因疗法使用间质干细胞(MSC)的特定迁移特征，其中将治疗基因引入MSC中且接着所得MSC迁移到疾病部位而使疾病得到治疗。为开发使用MSC趋向性的基因疗法，应完全了解调控MSC向肿瘤迁移的分子机制。然而，所述分子机制尚未确定。因此，本发明的概念是要弄清楚UCB-MSC向肿瘤细胞迁移的分子机制并且在基因疗法中使用这种分子机制。尽管正在进行脑肿瘤是否可用神经干细胞或骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)治疗的研究，但收集神经干细胞和BM-MSC可能会产生伦理问题、免疫排斥反应以及被从中取得BM-MSC的个体的心理和身体压力。因此，本发明的概念还提供可在不发生上述这些问题的情况下获得且对脑肿瘤具有较好趋向性的干细胞。技术解决方案为解决这些问题，本发明的发明人进行了研究，并发现从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(UCB-MSC)对脑肿瘤细胞具有趋向性，并且UCB-MSC的迁移能力比从骨髓分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(BM-MSC)强。本发明人提供了使用UCB-MSC治疗脑肿瘤的治疗性应用。本发明的发明人还发现UCB-MSC的趋向性受白细胞介素-8 (IL_8)或GRO-α所影响。根据这一发现，本发明的发明人提供一种将治疗基因或其产物传递到表达IL-8或GRO- α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞的方法，以及其治疗性应用。有益效果本发明组合物中的脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)对表达IL-8或GRO-α且因此诱导UCB-MSC趋向性的细胞或对脑肿瘤细胞具有选择性趋向性。UCB-MSC的趋向能力优于其它干细胞且因此治疗基因或其产物会比使用其它常规干细胞时得到更有效传递。因此，本发明的包括UCB-MSC的医药组合物或试剂盒可用于诊断、预防以及治疗与表达白细胞介素(IL)-8或GRO-α的细胞有关的疾病或脑肿瘤。发明模式本发明的发明人研究了对肿瘤具有有效趋向性的多种干细胞，且意外地发现脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)对脑肿瘤具有强趋向性，特别是对脑肿瘤的趋向性比骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)强，这是以前从不知道的。本发明人还发现白细胞介素(IL)-8或GRO-α与UCB-MSC的趋向性有关。本发明人将UCB-MSC与代表性肿瘤细胞系共培养以鉴定UCB-MSC的趋向性特征以及与那些肿瘤细胞系有关的细胞因子。具体来说，将UCB-MSC与选自以下的一种细胞系在
穿膜(transwell)小室中共培养以测量UCB-MSC的迁移率(mobility):人脑肿瘤细胞系，诸如U-87MG、LN18、U138或U251细胞；人直肠癌细胞系，诸如LS-174T ;人B淋巴细胞，诸如NC37 ;小鼠纤维母细胞(NIH3T3);胃癌细胞系，诸如KATO III ;肺癌细胞系，诸如A549 ;以及肝癌细胞系，诸如PLC/PRF5。结果发现，UCB-MSC对脑肿瘤细胞U-87MG、LN18、U138以及U251细胞具有强趋向性(参见图3A、图3B和图4A至图4D)。对于不包含U-87MG细胞且是通过培养U-87MG所获得的条件培养基，UCB-MSC也具有趋向性(参见图4A至图4D)。还将UCB-MSC对一种脑肿瘤细胞系的趋向性与目前用作干细胞源的BM-MSC作比较。结果发现UCB-MSC对这种脑肿瘤细胞系的趋向性比BM-MSC强(图5)。而且在多种癌细胞系中，UCB-MSC对于脑肿瘤细胞系的趋化指数最大(图6)。UCB-MSC除了比BM-MSC可更易获得且免疫稳定性更高外，所述对脑肿瘤细胞的高趋化指数是UCB-MSC的另一个优点，这证明UCB-MSC是极适合于脑肿瘤基因疗法的媒介物，因为治疗基因可被有效地转移到脑肿瘤的内部或相邻部分。在穿膜(transwell)小室中UCB-MSC的趋向性可能通过产生后分泌在两种细胞共培养物中的细胞因子来驱动。由此，将两种细胞在穿膜(transwell)小室中共培养以制备培养基且接着使用细胞因子阵列分析这种培养基。结果经鉴定，在UCB-MSC与U87MG被共培养过的培养基中分泌出高含量的细胞因子(诸如IL-8或GRO-α )(参见图7)。因此，很有可能这些细胞因子可驱动UCB-MSC的趋向性。本发明的发明人单独培养UCB-MSC，单独培养U_87MG，且共培养UCB-MSC与U-87MG，并接着使用RT-PCR分析这些细胞的IL_8mRNA含量。结果，UCB-MSC在U-87MG细胞存在或不存在下都不表达IL-8。然而，U-87MG在UCB-MSC存在和不存在下都组成性表达IL-8 (参见图8)。用IL-8处理UCB-MSC与未经处理的细胞相比，显著增强其迁移(参见图9A)。然而，当将 UCB-MSC 与抗 CXC 趋化因子受体 1(CXC chemokine receptor 1，CXCR1)抗体(针对IL-8受体的抗体)一起预培育且对UCB-MSC施用重组IL-8时，通过抗CXCRl处理，UCB-MSC的IL-8介导性迁移以剂量依赖性方式减少(图9B)。抗CXC趋化因子受体2 (CXCchemokine receptor 2, CXCR2 )处理也显示相同作用。类似地,与未经处理的UCB-MSC相比，GRO- α处理也增强UCB-MSC迁移(图9C)。相比之下，在用MCP-I处理的培养物中UCB-MSC迁移无显著差异(图9D)。这一数据表明IL-8和GRO- α参与UCB-MSC向U-87MG细胞的迁移。测量了由各种癌细胞分泌的IL-8浓度与UCB-MSC迁移之间的关系。结果，迁移最高浓度UCB-MSC的U-87MG显示最高的IL-8产量(图10A)。本发明人还测量了多种胶质瘤细胞的IL-8分泌水平。作为UCB-MSC趋向性靶细胞的所有受测试的胶质瘤细胞系也都显示IL-8高分泌水平(图10B)。这一数据表明UCB-MSC对分泌IL-8的细胞具有强迁移吸引力。为了对此进行鉴定，人为地使IL-8在A549 (是低IL-8表达水平的人肺癌细胞)中过表达且接着将过表达IL-8的A549与UCB-MSC共培养。结果发现尽管UCB-MSC对A549具有弱迁移吸引力，但UCB-MSC对过表达IL-8的A549具有强迁移吸引力。因而，IL-8可能是UCB-MSC的强诱导剂(参见图10C)。本发明的发明人比较了 BM-MSC与UCB-MSC关于U-87MG细胞或IL-8的迁移特征。结果发现UCB-MSC向U-87MG细胞或IL-8的迁移比BM-MSC强。UCB-MSC迁移回应IL-8处理而急剧增强，但BM-MSC迁移回应IL-8处理而较弱(参见图IlA及图11B)。通过测量mRNA和蛋白质比较了 CXC趋化因子受体I(CXCRl)与CXC趋化因子受体
2(CXCR2)在UCB-MSC和BM-MSC中的表达水平(参见图12A至图12D)。使用从UCB-MSC和BM-MSC分离来的总RNA的RT-PCR分析揭露，CXCRl与CXCR2的PCR产物在UCB-MSC中的强度都高于在BM-MSC中。关于CXCRl和CXCR2的蛋白质表达，CXCRl与CXCR2在UCB-MSC和BM-MSC中都高度表达。因为IL-8对CXCRl和CXCR2具有高亲和力，所以UCB-MSC向U-87MG的迁移增加可能归因于CXCRl和CXCR2的表达上调。本发明的发明人进行了将编码绿色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的基因引入UCB-MSC中的实验。结果发现GFP被成功引入并表达(参见图13)。还发现过表达GFP编码基因的UCB-MSC也对U87MG具有趋向性(参见图14)。所述结果表明引入了基因或其产物的UCB-MSC可被转移到分泌IL-8或GRO- α的细胞。根据上述结果，本发明涉及一种通过使用UCB-MSC将基因或其产物转移到表达IL-8或GRO- α的细胞的方法。本发明还涉及含有UCB-MSC的治疗组合物，其用于将治疗或标记基因或其产物转移到表达IL-8或GRO- α且驱动UCB-MSC趋向性的细胞。本发明还涉及使用UCB-MSC的治疗性医药组合物、试剂盒、预防或治疗脑肿瘤的用途，以及脑肿瘤治疗方法。本发明还涉及使用UCB-MSC的组合物、诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的试剂盒，以及脑肿瘤的诊断方法或脑肿瘤治疗进展的监测方法。具体来说，本发明的概念涉及[I] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC ；[2] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中所述UCB-MSC充当脑肿瘤基因疗法的载体；[3] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中；[4] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因；[5] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组磷酸酶以及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的基因、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(marray serine proteinase inhibitor,Maspin)的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白-I (Caveolin-I)的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-I的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(X chromosome linked inhibitor apoptosis protein,XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(neural apoptosis inhibitory protein, NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；[6] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的基因、干扰素(INF-α、INF- β、INF- y )的基因、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)的基因、p53的基因、细胞凋亡蛋白酶活化因子-I (apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)的基因、肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的基因、卡斯蛋白酶(Caspase)的基因、Bax的基因、Bad的基因、Fas相关死亡结构域蛋白(Fas_associateddeath domain protein, FADD)的基因、c_Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,·JNK)的基因、p38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；[7] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组cdc2的基因、细胞周期蛋白(Cyclin)(细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p2IffAF的基因、pl6INK4的基因、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin depent kinase, CDK) (CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)的基因、Rb蛋白的基因、E2F的基因、其反义物或SiRNA以及调控这些基因的蛋白质的基因；[8] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因，其中所述血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组凝血栓蛋白-I (thrombospondin-1)的基因、内皮抑素(endostatin)的基因、肿瘤抑素(tumstatin)的基因、血管能抑素(canstatin)的基因、内皮生长抑制蛋白(vastatin)的基因、细胞静息因子(restin)的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)的基因、血管生成素的基因、16_kd促乳素片段的基因以及基底膜蛋白多糖片段(endoi^pellin)的基因；[9] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中；[10] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶以及CYP2B1基因；[11] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将与脑肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中；[12] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将与脑肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中，其中所述与脑肿瘤有关的基因可选自由以下组成的群组Ras家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB_l的基因、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor-Receptor, EGF-R)的基因、Bax的基因、Apaf-I 相互作用蛋白(Apaf-1 interacting protein, APIP)的基因、Wnt-I 诱导分泌蛋白 I (ffnt-l-induced secreted proteinl, WISP-1)的基因、Wnt 的基因、Raf-I 的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-I, 2的基因以及BcL-2的基因；[13] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中；[14] 一种预防或治疗脑肿瘤的医药组合物，其中所述医药组合物包括UCB-MSC，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中，其中所述溶瘤病毒是选自单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus)以及呼肠孤病毒 3 型(Reovirus type 3)；[15]上述预防或治疗脑肿瘤的医药组合物中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；[16] 一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC ；[17] 一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记；[18] 一种诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记，其中所述可检测标记是选自含荧光素酶的酶基荧光检测剂以及Tat肽衍生的磁性纳米粒子；[19]诊断脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；[20] 一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC ;以及抗癌药的前药；[21] 一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC;以及抗癌药的前药，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1 基因；[22] 一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含具有前药转化酶基因的表达载体；UCB-MSC;以及抗癌药的前药，其中所述前药转化酶基因是选自胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因，其中所述UCB-MSC经所述具有前药转化酶基因的表达载体转染；[23]上述套组中的任一种，其中所述脑肿瘤是选自由以下组成的群组星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症；[24] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性；[25] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC充当基因疗法的载体；[26] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其 中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中；[27] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组；[28] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组磷酸酶以及张力蛋白同源物(PTEN)的基因、Maspin的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白-I的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-I的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；[29] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(TNF)的基因、干扰素(INF-α、INF-β、INF- y )的基因、集落刺激因子(CSF)的基因、P53的基因、Apaf-I的基因、TRAIL的基因、卡斯蛋白酶的基因、Bax的基因、Bad的基因、FADD的基因、JNK的基因、P 38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因；[30] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组cdc2的基因、细胞周期蛋白(细胞周期蛋白Α、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p21WAF的基因、pl6INK4的基因、⑶K (⑶K1、⑶K2、⑶K4、⑶K6)的基因、Rb蛋白的基因、E2F的基因、其反义物或SiRNA以及调控这些基因的蛋白质的基因；[31] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将抗肿瘤基因引入所述UCB-MSC中，其中所述抗肿瘤基因是选自由肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因以及血管生成抑制剂基因组成的群组，其中所述血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组凝血栓蛋白-I的基因、内皮抑素的基因、肿瘤抑素的基因、血管能抑素的基因、内皮生长抑制蛋白的基因、细胞静息因子的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、maspin的基因、血管生成素的基因、16_kd促乳素片段的基因以及endorepellin 的基因；[32] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其·中将前药转化酶基因引入所述UCB-MSC中；[33] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将前药转化酶基因弓I入所述UCB-MSC中，其中所述前药转化酶基因是选自由胞嘧啶脱氨酶基因以及CYP2B1基因组成的群组；[34] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中；[35] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA引入所述UCB-MSC中，其中所述与肿瘤有关的基因可选自由以下组成的群组Ra s家族的基因、c-myc的基因、abl的基因、erbB_l的基因、EGF-R的基因、Bax的基因、APIP的基因、WISP-1的基因、Wnt的基因、Raf-I的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-I, 2的基因以及BcL-2的基因；[36] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中；[37] 一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其中所述基因治疗组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO- α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中将溶瘤病毒引入所述UCB-MSC中，其中所述溶瘤病毒是选自由单纯疱疹病毒以及呼肠孤病毒3型组成的群组；[38] 一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性；[39] 一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-a且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记；以及
[40] 一种诊断在包含细胞的某部位发生的疾病或监测所述疾病的治疗进展的组合物，其中所述组合物包含UCB-MSC，其中所述细胞表达IL-8或GRO-α且诱导所述UCB-MSC的趋向性，其中所述UCB-MSC标记有可检测标记，其中所述可检测标记可选自由含荧光素酶的酶基荧光检测剂以及Tat肽衍生的磁性纳米粒子组成的群组。


图I是说明收集间质干细胞(MSC)的方法的图。图2是用于共培养脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)以及本发明各种细胞系的穿膜(transwell)小室的示意图。图3A及图3B是当将置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC
与各置于穿膜(transwell)小室的下室中的U87-MG、LS174-T、NC-37以及NIH3T3细胞共培养时，向穿膜(transwell)小室的下室迁移的UCB-MSC数目的图，其中在图3A中，左柱表示穿膜(transwell)小室的下室中细胞系的细胞数目是IX IO5个细胞的情况而右柱表示穿膜(transwell)小室的下室中细胞系的细胞数目是5X IO5个细胞的情况，且在两种情况下，UCB-MSC的数目都是I X IO5个细胞，且在图3B中，左荧光显微图像显示当仅使用无人细胞系的培养基(对照组)时，标记PKH26的UCB-MSC向穿膜(transwell)小室的下室的迁移，而右荧光显微图像显示当将UCB-MSC与U87-MG细胞共培养时，标记PKH26的UCB-MSC向穿膜(transwell)小室的下室的迁移。图4A至图4D是当将置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC与各置于穿膜(transwell)小室的下室中的 U87_MG、KAT0 III、A549、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251细胞共培养时，向穿膜(transwell)小室的下室迁移的UCB-MSC数目的图(图4A和图4C)，其中图4B是标记PKH26的UCB-MSC向下室迁移的荧光显微图像，而图4D是当将UCB-MSC与U-87MG细胞或与无U87MG细胞培养的条件培养基共培养时，所迁移的UCB-MSC数目的图，所述条件培养基是通过在培养基中培养U87MG细胞并接着从培养基去除U87MG细胞而制得。图5是比较BM-MSC和UCB-MSC对于U-87MG细胞的趋向性的图，其中将各置于穿膜(transwell)小室的上室中的标记PKH的UCB-MSC和标记PKH的BM-MSC与置于穿膜(transwell)小室的下室中的U-87MG细胞共培养且将向下室迁移的标记PKH的UCB-MSC数目与标记PKH的BM-MSC数目作比较，其中左柱表示不存在U-87MG细胞的情况而右柱表示存在U-87MG细胞的情况(U-87MG细胞的数目是5X105个，且在两种情况下，MSC的数目都是 IX IO5 个)。图6是当将UCB-MSC与癌细胞系(A549、海拉(HeLa)以及U-87MG细胞)共培养时，UCB-MSC趋化指数的图。图7绘示在将NC37、LS174-T以及U-87MG细胞各与UCB-MSC共培养后用细胞因子阵列分析细胞溶解液和细胞培养物上清液所获得的结果。图8绘示通过收集单独培养UCB-MSC、单独培养U-87MG细胞以及共培养UCB-MSC与U-87MG细胞两者的条件培养基，在阵列膜上培育所述条件培养基，并接着用ECL试剂观察培育结果所获得的分析结果，其中A绘示使用UCB-MSC的条件培养基和培养基对照组的细胞因子抗体阵列分析结果，B绘示使用仅培养U-87MG的条件培养基时以及使用共培养UCB-MSC与U-87MG的培养基时的分析结果，且C绘示在U-87MG细胞存在或不存在下培养的UCB-MSC (左)以及在UCB-MSC存在或不存在下培养的U-87MG细胞的mRNA分离结果，其中用IL-8特异性引物进行RP-PCT且使用GAPDH作为对照。图9A至图9D是鉴定在参考图8所分析的细胞因子之中IL-8和GRO-α对MSC迁移的作用的图，其中图9A是当用O、I、10以及100纳克的重组IL-8蛋白处理MSC24小时时细胞向下室迁移的图，图9B是当用O. 02,0. 2以及2微克CXC趋化因子受体I (CXCRl)抗体(称为细胞中IL-8的受体)预处理UCB-MSC并接着用50纳克IL-8处理以促进MSC迁移时细胞向下室迁移的图。(*，ρ=0·007 ;#，ρ〈0·001)，图9C是当用GRO-a (*，ρ〈0·005)处理UCB-MSC时细胞向下室迁移的图，且图9D是当用单核细胞趋化蛋白-I (MCP-I)处理MSC时细胞迁移的图。图IOA至图IOD由图10Α、图10Β、图IOC以及图IOD组成，其中图IOA和图IOB是通过 ELISA 所测量，使用 U-87MG, KATO III、Α549、PLC/PRF5、LN18、U138 以及 U251 细胞的 培养后培养基中所分泌的IL-8量的图，图IOC是当将IL-8基因引入分泌低含量IL-8的Α549细胞中并过表达时细胞迁移的图，且图IOD是通过ELISA所测量，处于图IOC条件下的培养基中所分泌的IL-8量的图。图IlA及图IlB是比较UCB-MSC和BM-MSC对于U-87MG细胞的趋向性的图，其中图IlA是就U-87MG细胞来比较UCB-MSC和BM-MSC向下室移动的趋向性的图，且图IlB是当用IL-8处理UCB-MSC和BM-MSC14小时时比较UCB-MSC和BM-MSC的趋向性的图。图12Α至图12D绘示通过测量mRNA和蛋白质来比较CXC趋化因子受体I与CXC趋化因子受体2 (CXCRl与CXCR2)(称为IL-8受体)在UCB-MSC和BM-MSC中的表达水平的分析结果，其中图12A绘示当从UCB-MSC和BM-MSC各分离mRNA且在UCB-MSC和BM-MSC中用CXCRl和CXCR2引物进行RT-PCR时的分析结果，其中参考与各样品反应的GAPDH来定量所分离的RNA，图12B是通过用光密度计测量从图12A获得的各凝胶的mRNA条带密度所得的CXCRl和CXCR2表达水平的图(*和**，p〈0. 001 ；η=4),图12C绘示通过抗CXCRl和抗CXR2抗体执行免疫染色法(X 400)所得的CXCRl和CXCR2在UCB-MSC和BM-MSC中的蛋白质表达水平的分析结果，且图12D绘示通过仅用二次抗体来代替抗CXCRl和抗CXCR2抗体对UCB-MSC和BM-MSC进行免疫染色以鉴定抗CXCRl和抗CXCR2抗体的抗原特异性所获得的分析结果。图13是被引入且过表达编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因的UCB-MSC的荧光显微图像。图14绘示编码GFP的基因和空基因各在UCB-MSC中过表达的实验结果。将所述UCB-MSC置于穿膜(transwell)的上室中而将U-87MG细胞置于穿膜(transwell)的下室中且共培养24小时，并接着鉴定向下室迁移的UCB-MSC。图15绘示本发明实例中所使用的引物序列。
具体实施例方式下文将详细描述本发明。在本说明书中，术语“脐血”是指取自所有哺乳动物(包含人类)中连接胎盘与胎儿的脐静脉的血液。
在本说明书中，术语“脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC) ”是指从哺乳动物(优选为人类)的脐血分离并培养的MSC。在本说明书中，术语“治疗”是指预防尚未诊断出疾病但易患疾病的动物(优选为哺乳动物且更优选为人类)的疾病或病症形成；抑制疾病进展；以及减轻疾病。在本说明书中，术语“脑肿瘤”是指在脑和脊髓中形成的恶性或良性肿瘤以及在胶质细胞和非胶质细胞中形成的各种肿瘤。在此，脑肿瘤可为原发性脑肿瘤或继发性脑肿瘤。同时，本说明书中未定义的术语可具有业界通常所定义的含义。为从UCB分离包含MSC的单核细胞，可使用任何已知方法，诸如由本申请的申请人所申请并登记过的韩国登记专利第489248号中所揭示的方法。举例来说，分离方法可为葡聚糖-泛影葡胺密度梯度法(ficoll-Hypaque density gradient method),但不限于此。具 体来说，将在分娩后且在分离胎盘前取自脐静脉的UCB以葡聚糖-泛影葡胺梯度离心来获得单核细胞，且接着洗涤单核细胞数次去除其中的杂质。所得单核细胞可直接用于MSC分离或培养，或长时间低温保存。可从UCB分离MSC并使用任何已知方法培养(参见MF皮滕杰(Pittinger MF)等人，科学(Science), 284:143-7，1999 ;以及HM拉扎罗丝(Lazarus HM)等人，骨髓移植(BoneMarrow Transplant), 16:557-64，1995)，诸如韩国公开专利第2003-0069115号中所揭示的方法。首先，例如以葡聚糖-泛影葡胺梯度离心所分离的UCB，以分离包含造血细胞和MSC的单核细胞，且接着洗涤单核细胞数次去除其中的杂质。接着，将单核细胞以适当浓度接种于培养皿中，使细胞以单层形式生长。用相差显微镜鉴定这些细胞。在相差显微图像中，一群具有均匀纺锤形的细胞就是MSC。接着，在培养细胞和生长时，进行细胞传代培养随后繁殖直到细胞数目达到所需数目。本发明组合物中所包含的UCB-MSC可以使用已知方法低温保存(参见坎波斯(Campos)等人，低温生物学(Cryobiology) 35:921-924，1995)。用于低温保存法的培养基可包含10 20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及10% 二甲亚讽(dimethylsulfoxide，DMS0)。将细胞悬浮于所述培养基中直到细胞浓度为每I毫升培养基约IXlO6到5 X IO6个细胞。将细胞悬浮液分份并将每一份加载于用于低温保存的玻璃或塑料安瓿中，接着密封样品并装载于控制温度的程序冷冻器中。可使用提供-1°C /分钟的温度变化的冷冻程序冷冻细胞，以致当解冻冷冻的细胞时可减少对细胞的损伤。当样品温度达到-90°C或更低时，将样品移到温度为_150°C或更低的液氮贮槽中。当解冻冷冻的细胞时，将样品从所述液氮贮槽快速移到温度控制在37°C的水浴中。安瓿中解冻的内容物立即移到含有处于稳定条件下的培养基的培养皿中。根据本发明，用于分离和培养MSC的培养基可为含有10%到30%FBS的细胞培养基。所述细胞培养基可为业界通常所用的任何细胞培养基。细胞培养基的实例包含杜尔贝可改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM )培养基、最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)培养基、a-MEM 培养基、McCoy s5A 培养基、伊格尔氏基础培养基(eagle’s basalmedium)、化学定性基础培养基(Chemically DefinedBasal Medium, CMRL)培养基、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow minimum necessarilymedium)、(汉姆氏(Ham’s)) F-12培养基、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(iscove’ smodified Dulbecco’s medium, IMDM)、(莱博维茨氏(Liebovitz' )) L-15 培养基以及RPMI1640培养基。举例来说，细胞培养基可为DMEM培养基。在培养期间，可将细胞悬浮以致细胞浓度为每I毫升培养基约5 X IO3到2 X IO4个细胞。需要时，细胞培养基也可进一步包含一种或多种添加剂。添加剂可包含至少一种选自由以下组成的群组的物质胎牛、胎马或人类胎儿的血清；防止微生物污染的青霉素G (penicillin G);抗生素，诸如硫酸链霉素(streptomycin sulfate)或庆大霉素(gentamycin);抗真菌剂,诸如两性霉素B (amphotericin B)或制霉菌素(nystatin);以及至少两种选自上述的物质的混合物。根据本发明，UCB-MSC可经遗传工程改造以转移实质上抑制脑肿瘤细胞生长的治疗性药物。又根据本发明，UCB-MSC可经遗传工程改造以将治疗基因或其产物转移到分泌IL-8或GRO- α的细胞。在此，术语“抑制”是指抑制细胞增殖和生长，而且包括坏死和凋亡。所述治疗基因可例如为抗肿瘤基因、使前药转化为药物的酶的基因、与肿瘤有关的·基因的反义物或SiRNA，或溶瘤病毒(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J.)9(3)，189-204，2003)。所述抗肿瘤基因可为肿瘤抑制基因、细胞凋亡诱导因子基因、细胞周期调节基因或血管生成抑制剂基因。具体来说，肿瘤抑制基因可选自由以下组成的群组磷酸酶以及张力蛋白同源物(PTEN)的基因、Maspin的基因、RUNX3的基因、小窝蛋白_1的基因、nm23的基因、Rb蛋白的基因、Brush-I的基因、肿瘤生长抑制剂(ING-4)的基因、存活素的基因、X染色体连锁细胞凋亡抑制蛋白(XIAP)的基因、神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因。肿瘤抑制基因并不限于上述那些基因。细胞凋亡诱导因子基因可选自由以下组成的群组细胞因子的基因、白细胞介素的基因、肿瘤坏死因子(TNF)的基因、干扰素(INF-α ,INF-β、INFi )的基因、集落刺激因子(CSF)的基因、ρ53的基因、Apaf-I的基因、TRAIL的基因、卡斯蛋白酶的基因、Bax的基因、Bad的基因、FADD的基因、JNK的基因、p38激酶的基因以及调控这些基因的蛋白质的基因。细胞凋亡诱导因子基因并不限于上述那些基因。细胞周期调节基因可选自由以下组成的群组cdc2的基因、细胞周期蛋白(细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E)的基因、cdc25C的基因、p2IffAF 的基因、pl6INK4 的基因、CDK (CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)的基因、Rb 蛋白的基因、E2F的基因。细胞周期调节基因并不限于上述那些基因。血管生成抑制剂基因可选自由以下组成的群组凝血栓蛋白-I的基因、内皮抑素的基因、肿瘤抑素的基因、血管能抑素的基因、内皮生长抑制蛋白的基因、细胞静息因子的基因、血管内皮生长抑制剂的基因、maspin的基因、血管生成素的基因、16-kd促乳素片段的基因以及Endor印ellin的基因。血管生成抑制剂基因并不限于上述那些基因。使前药转化为药物的酶的基因可为使5-FC转化为5-FU(是抗癌药)的胞嘧啶脱氨酶，或参与生物活化环磷酰胺和异环磷酰胺(ifosfamide)(是抗癌药)的CYP2B1基因，其中5-FC是5-FU的前药。使前药转化为药物的酶的基因并不限于上述这些物质。与肿瘤有关的基因的反义物或SiRNA可为(但不限于)Ras家族的基因、c_myc的基因、abl的基因、erbB-Ι的基因、EGF-R的基因、Bax的基因、APIP的基因、WISP-I的基因、fct的基因、Raf-I的基因、Src的基因、Akt的基因、Erk-I, 2的基因以及BcL_2的基因的反义物或SiRNA。可由UCB-MSC运载的溶瘤病毒可为单纯疱疹病毒或呼肠孤病毒3型，但不限于此。
在可表达状态下引入所需基因的UCB-MSC可适当地使用业界已知的技术来制造。举例来说，制备包含待引入基因的载体(参见H德里(Dehari H)等人，癌症基因疗法(Cancer Gene Ther. )，10，75-85，2003;W007/037653)且接着可离体(ex vivo)将载体转导于原代培养MSC中。在此,载体的实例包含腺病毒载体、反转录病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、SV40载体、多瘤病毒载体、乳头状瘤病毒载体、微小核糖核酸病毒载体、牛痘病毒载体以及慢病毒载体。举例来说，可使用由H津田(Tsuda H)等人开发的方法(分子疗法(Mol Ther) 2003，7，354-365)。具体来说，可在感染腺病毒基因前一天，将MSC(5X 105个细胞)接种于培养皿中。接着将MSC和包含引入有腺病毒基因的腺病毒载体的溶液于37°C在5%C02恒温箱中培育I小时，以致MSC感染上腺病毒基因。接着用磷酸缓冲溶液洗涤被感染的MSC，随后对其施用常规培养基。或者，不使用病毒载体，可通过使用裸DNA和选自磷酸钙法、阳离子脂质体法以及电穿孔法的任何方法将所需基因引入UCB-MSC中。或者，可使用包含蛋白转导域(proteint ransduction domain, PTD)与抗肿瘤蛋白的融合蛋白基因的载体将所述融合蛋白基因引入UCB-MSC中(参见SP吴(Wu SP)等人生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun. ) 346 (I)，1-6，2006)。 载体可进一步包含用于其它历史检查的基因标记。所述基因标记可例如为编码发色或荧光蛋白(诸如IacZ或绿色荧光蛋白(GFP))的基因，但不限于此(参见S叶(Yip S)等人，癌症杂志(The Cancer J. ) 9 (3)，189-204，2003)。可使用本发明医药组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤可为原发性脑肿瘤或继发性脑肿瘤。可使用本发明组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤实例包含星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、低级星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、室管膜下瘤、节细胞神经瘤、混合型胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、听神经瘤、脊索瘤、中枢神经系统淋巴瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤、横纹肌样瘤、神经鞘瘤、囊肿、神经纤维瘤病、假性脑瘤以及结节性硬化症。然而，可使用本发明组合物诊断、预防以及治疗的脑肿瘤并不限于上述这些肿瘤。本发明医药组合物可与任何已知抗癌药一起投药。因为UCB-MSC 不表达人白细胞抗原 DR (human leukocyte antigen-DR, HLA-DR)(II型主要组织相容性复合体,Major Histocompatibility Complex class 11)(这是移植组织或器官时产生免疫排斥反应的主要原因)(参见KC勒布朗(Le Blanc1KC),实验血液学(Exp Hematol), 31:890-896, 2003 ;以及 WT 谢(Tse WT)等人，移植(Transplantation),75:389-397, 2003)，所以不发生免疫反应(诸如排斥反应)(这是主要移植问题)或可减到最少。因此，本发明医药组合物中所包含的UCB-MSC除自身来源的UCB外，也可取自来源于另一个体的UCB。根据本发明，UCB-MSC可在低温保存后使用。本发明的用于基因疗法或用于预防或治疗疾病的含UCB-MSC医药组合物除有效组分外，还可进一步包含医药学上可接受的添加剂。含UCB-MSC的医药组合物可成形为适合于身体投药的剂型。所述适合的剂型可为非口服剂型，诸如可注射剂型或可局部投药剂型。举例来说，包含水或医药学上可接受的溶剂的已灭菌溶液或悬浮液可以可注射形式非口服投药。具体来说，将水或医药学上可接受的溶剂与医药学上可接受的载剂或介质适当组合，从而形成呈通常可接受的单位剂量的可注射剂型。医药学上可接受的载剂或介质的实例可包含无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒剂、防腐剂、粘合剂等。上述可注射剂型可通过使用常规方法来非口服投药，具体来说直接投药到疾病部位。或者，上述可注射剂型可经由向疾病部位供血的脑脊髓液、静脉或动脉来投药，优选直接投药到脑或脊髓中疾病部位的相邻部分或其相对部分。举例来说，所述可注射剂型可使用由匹兹堡(Pittsburgh)的道格拉斯 孔德兹卡(Douglas Kondziolka) (1998)开发的临床方法来投药。即，将待投药的个体颅骨切开直径约I厘米的豌豆大小，且接着向其中注入与汉可氏平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution, HBSS))混合的MSC溶液。在此，使用包含长针的注射器和将MSC溶液精确注入脑中的立体定位架(stereotactic frame)来注射MSC溶液。UCB-MSC的每日剂量可为每千克体重I X IO4到I X IO7个细胞，优选为每千克体重
5X105到5X106个细胞。每日剂量可一次性投药或分次投药进行数次治疗。然而，根据本发明，UCB-MSC的投药剂量可根据待治疗疾病的种类、待治疗疾病的严重程度、投药途径以及患者的体重、年龄和性别而变化。因此，上述投药剂量不限制本发明的范围。本发明还提供治疗与产生IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病或脑肿瘤的方法，其中所述方法包含向患者投与治疗有效量的本发明医药组合物。在此，医药组合物中所包含的UCB-MSC可取自患者自身或用于医学目的的其它人或动物的UCB。在此，UCB-MSC可在低温保存后使用。所述使用UCB-MSC的方法并不限于人类，且可应用于其它哺乳动物。本发明还提供诊断与产生IL-8或GRO-α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病或脑肿瘤的方法，以及用于进行所述方法的试剂盒，其中所述方法使用UCB-MSC。在这种方法中，UCB-MSC可标记有可检测标记。标记有可检测标记的UCB-MSC可通过现有技术观察，且可在活动物体内实时追踪。所述可检测标记可为含荧光素酶的酶基荧光检测剂或Tat肽衍生的磁性纳米粒子(S叶(Yip S)等人,癌症杂志(The Cancer J.)9(3)，189-204,2003)。如果使用表达荧光素酶的干细胞，那么所投与干细胞向疾病部位的迁移可通过实时鉴定生物发光来追踪，且因此可诊断出疾病并可鉴定疾病部位(参见R维斯勒德尔(Weissleder R)等人，自然 医学(Nat Med) 9，123-128，2003)。使用由卢因(Lewin)等人开发的方法(参见自然·生物技术(Nat Biotech) 18，410-414，2000)将Tat肽衍生的磁性纳米粒子与UCB-MSC连接且接着体内投药。所投与的UCB-MSC可通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)来追踪。因此,标记有标记的UCB-MSC可体内投药且接着可通过鉴定UCB-MSC聚集的位置来鉴定肿瘤以及肿瘤部位。另外，标记有标记的UCB-MSC还可在脑肿瘤治疗期间或在脑肿瘤治疗之后投药，以鉴定所投与UCB-MSC的分布位置与尺寸。即，还可监测脑肿瘤治疗的进展。因此，本发明还提供监测脑肿瘤治疗进展的方法和用于进行所述方法的试剂盒，其中所述方法使用UCB-MSC。所述监测方法和用于进行所述方法的所述试剂盒还可应用于与产生IL-8或GRO- α且诱导UCB-MSC趋向性的细胞有关的疾病。应注意本说明书中所提及的现有技术都以全文弓I用的方式并入本文中。将参考以下实例来更详细地描述本发明。这些实例仅用于说明目的而不欲限制本发明概念的范围。
实例从美国菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC)购得 U-87MG、A549、KAT0 III、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251细胞系并用于本发明实验中。在37°C下在5%C02恒温箱中将A549、KAT0 III以及PLC/PRF5细胞培养于含有10-20% (v/v)FBS (美国犹他州洛根市的海克隆公司(HyClone，Logan, UT, US))和庆大霉素的RPMI中。使U-87MG细胞、LN18、U138以及U251细胞生长于含有10-20% (v/v)FBS的伊格尔最低必需培养基(MEM)中。骨髓来源间质干细胞(BM-MSC)购自龙沙公司(L0NZA)。将BM-MSC和所建立的UCB-MSC培养于含有10-20%FBS的a -MEM培养基中。<实例1>制备脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC)在得到母亲同意后，从分娩的脐静脉收集UCB样品。具体来说，将含有44毫升CPDA-I抗凝剂的UCB收集袋(韩国京畿道龙仁市的绿十字公司(GreencrossCo.，Yongin, Kyungki-do, Korea)的16号针插入脐静脉中且自流收集UCB。所有情况下,在·收集48小时内处理UCB收集物，成活率(viability)是90%或更多。<实例2>分离和扩增UCB-MSC以葡聚糖-泛影葡胺梯度(由西格马公司(Sigma Co.)制造,密度I. 077克/毫升)离心根据实例I制备的UCB-MSC，且接着洗涤数次去除杂质。向所得产物加入含有10到20%FBS (海克隆公司(HyClone Co.))的基础培养基(α -MEM,吉布科BRL公司(Gibco BRLCo.))使UCB-MSC悬浮。使UCB-MSC以适合的浓度分配于各含有10到20%FBS的基础培养基中，且接着在37°C下在5%C02恒温箱中培养，同时一周内更换培养基两次(图I)。当培养的细胞形成单层时，用相差显微镜鉴定以纺锤形扩增的MSC。接着，重复进行传代培养直到MSC充分扩增。<实例3>制备标记有PKH-26的UCB-MSC使用参考文献中所揭示的方法，用PKH-26 (西格马公司(Sigma Co.))使根据实例2培养的UCB-MSC染色[DA巴雷达(Barreda DA)等人，发育与比较免疫学(Developmentaland Comparative Immunology)，24:395-406，2000]。首先，通过使用胰蛋白酶从细胞培养皿分离UCB-MSC，且接着用无FBS培养基洗涤2 X IO7个细胞。使用离心机收集经洗涤的细胞且接着悬浮于制造商所提供试剂盒中的I毫升稀释剂C中。接着将所得细胞悬浮溶液(2X )与I毫升PKH荧光染料溶液(2X )混合，随后使混合物在25V反应5分钟。为终止标记反应，向反应产物中加入含有等体积胎牛血清(FBS)的培养基且接着使其静置I分钟。通过离心收集标记有PKH26的细胞，且接着用含有10到20%FBS的培养基洗涤三次并用于实验中。<实例4>在穿膜(transwell)小室中共培养MSC与其它细胞系用PKH-26 (由西格马公司(Sigma)制造)使人UCB-MSC (hUCB-MSC)染色。将经染色的hUCB-MSC与其它肿瘤细胞系在培养条件下共培养于穿膜(transwell)小室(猎鹰公司(FALCON))中(MSC:癌细胞系=1:5))。对照组是在如上文所述的相同条件下培养无癌细胞系的MSC。如图2中所示，用于共培养的穿膜(transwell)小室包含下室和上室，其中下室与上室靠微孔膜(8微米尺寸)分开。在上室中，培养标记PKH26的hUCB-MSC ;而在下室中，培养人脑肿瘤细胞系U87-MG、人直肠癌细胞系LS174-T、人B淋巴细胞NC-37以及小鼠纤维母细胞NIH3T3中的每一个。各共培养一天、两天以及三天后，使用相差显微镜(X100)鉴定标记PKH26的UCB-MSC的迁移且对所迁移的标记PKH26的UCB-MSC进行计数(图3A及图3B)。使用肿瘤细胞系KATO III、A549、PLC/PRF5、LN18、U138以及U251进行相同实验且鉴定标记PKH26的UCB-MSC的迁移。在将通过U-87MG细胞条件化的培养基置于下室中的情况下进行相同实验(图4A至图4D)。S卩，在穿膜(transwell)小室中将标记PKH26的UCB-MSC与各种肿瘤细胞系共培养且接着对迁移到下室中的标记PKH的间质干细胞进行计数。结果发现，UCB-MSC对脑肿瘤细胞系U87-MG、LN18、U138以及U251具有强趋向性，而对其它肿瘤细胞具有弱趋向性(图3A、图3B和图4A至图4D)。在图3B中，左图像绘示添加无人细胞系的培养基来代替肿瘤细胞的对照组情况，而右图像绘示将UCB-MSC与U87-MG细胞共培养的情况。参看图3A及图3B，鉴定了许多标记PKH26的UCB-MSC的迁移。当使用无人细胞系的培养基来代替肿瘤细胞并培养时，标记PKH26的UCB-MSC的迁移可忽略不计(参见图3B的左图像)。然而，标记PKH26的UCB-MSC对不含U-87MG细胞、但曾在其中培养U-87MG细胞的条件培养基具有趋向性(参见图4D)。所述结果表明条件培养基含有可将UCB-MSC吸引向U-87MG细胞的可溶性因子。 <实例5>比较BM-MSC对U87-MG的趋向性与UCB-MSC对U87-MG的趋向性使用穿膜(transwell)小室，将BM-MSC 对 U87-MG 的趋向性与 UCB-MSC 对 U87-MG的趋向性作比较。将U87-MG癌细胞或培养基置于下室中，而将BM-MSC和UCB-MSC各置于上室中。所有情况下，进行培养两天。结果发现，UCB-MSC对U87-MG的趋向性比BM-MSC强(图 5)。<实例6>比较MSC的迁移将上室中由四位捐献者捐献的UCB-MSC与各处于下室中的A549 (肺癌细胞)、海拉(HeLa)(子宫颈癌细胞)以及U87-MG (脑癌-胶质瘤细胞)共培养于穿膜(transwell)小室中。接着比较在各种情况下UCB-MSC的趋化指数(图6)。A549、海拉以及U87-MG细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)。将A549和U87MG细胞各培养于含有10-20%牛血清的RPMI1640中，而将海拉培养于DMEM中。在各种情况下，通过将向U87MG迁移的UCB-MSC数目除以对照实验中所迁移的UCB-MSC数目来计算趋化指数。分析UCB-MSC对那些癌细胞的趋向性。结果，发现UCB-MSC对U87MG (脑肿瘤细胞系)的趋向性最强。〈实例7>细胞因子阵列将MSC与三种人类细胞(包含U87-MG肿瘤细胞)各进行共培养，并收集培养后的培养基。使用细胞因子抗体阵列来检查培养后培养基的细胞因子概况。从购自R&D系统公司(R&D System Co.)的细胞因子阵列试剂盒取得上面附有各种细胞因子的抗体的膜，并使其与阻断溶液反应I小时。分别将通过共培养UCB-MSC与三种人类细胞(包含U87-MG肿瘤细胞)中每一种所制得的培养基的量调节到I. 5毫升或更少，并将各培养基与试剂盒中所含的细胞因子的混合抗体混合且诱导抗原-抗体反应I小时。使所供应的细胞因子抗体与所分泌的细胞因子于其中组合的培养基与经受4°C阻断12小时的所述膜反应。反应后，将膜置于洗涤液中洗涤，并接着用三重蒸馏水洗涤。接着在室温下干燥膜。重复洗涤与干燥过程两次或三次后，使膜在含有链亲合素-辣根过氧化物酶(streptavidin-Horseradish Peroxidase/HRP)的溶液中反应30分钟。接着用洗漆液洗漆膜三次，与染色剂反应，且接着在暗室中暴露于X射线胶片。诱导UCB-MSC强趋向性的U87-MG分泌有生长相关致癌基因(GRO- a )、IL-8、MCP-1、G-CSF、GM-DSF、IL-6、IL-I β、迁移抑制因子(migration inhibitory factor, MIF)以及丝氨酸蛋白酶抑制剂El (serine protease inhibitor El, Serpin El)。具体来说，GRO-α 和 IL-8 的量高于 MCP-1、G-CSF, GM-DSF, IL-6、IL-1 β、MIF 以及 Serpin El 的量。图7绘示使用细胞因子阵列分析细胞溶解液和细胞培养物上清液所获得的结果。图I绘示阵列结果和有关与对照组相比所改变斑点的信息。表I中，括号内的细胞因子是通过与肿瘤细胞共培养所产生的细胞因子。很有可能这些细胞因子可诱导UCB-MSC的趋向性。[表 I]
权利要求
1.一种鉴定对表达白细胞介素-8或生长调节致癌基因α的细胞具有趋向反应的间质干细胞的方法，其特征在于包括鉴定至少一种选自CXC趋化因子受体I或CXC趋化因子受体2以及其组合的存在。
2.一种将治疗基因或其产物转移到细胞的基因治疗组合物，其特征在于所述基因治疗组合物包括从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞，其中所述细胞表达选自由白细胞介素-8与生长调节致癌基因α组成的群组中的至少一者，以及诱导从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞的趋向性，其中所述间质干细胞表达CXC趋化因子受体I或CXC趋化因子受体2。
3.根据权利要求2所述的基因治疗组合物，其特征在于从脐带血分离来的所述间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的所述间质干细胞表达所述治疗基因。
全文摘要
提供一种基因治疗组合物，其用于将治疗基因、标记基因或其混合物中之一转移到细胞，所述细胞表达白细胞介素-8(IL-8)或生长调节致癌基因α(GRO-α)，且诱导从脐带血分离来的间质干细胞和/或从所述间质干细胞扩增来的间质干细胞(脐带血来源间质干细胞(UCB-MSC))的趋向性，其中所述细胞治疗组合物包含UCB-MSC。提供一种在基因疗法中通过使用UCB-MSC来治疗与表达IL-8或GRO-α的细胞有关的疾病(即脑肿瘤)的组合物。提供一种通过使用UCB-MSC来诊断脑肿瘤、预防脑肿瘤、治疗脑肿瘤或监测脑肿瘤治疗进展的组合物或试剂盒。
文档编号A61K48/00GK102776285SQ20121024557
公开日2012年11月14日 申请日期2008年8月27日 优先权日2007年8月29日
发明者吴元一, 梁允瑄, 蒋锺旭, 金达洙 申请人:米迪波斯特股份有限公司