专利名称：一种组织修复材料及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种组织修复材料及其制备方法和用途，属生物材料领域。
背景技术：
创面是正常皮肤或组织在外界致伤因子以及机体内在因素下导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能也受损。创面主要分为急性创面、慢性创面。常见的急性创面有手术切ロ、皮肤擦伤、烧伤等；常见的慢性创面有褥疮、下肢血管性溃疡、糖尿病性足溃疡以及其他难愈合创面。创面一旦形成，机体就会迅速作出反应，启动愈合过程进行修复。普通的急性创面，可通过机体的自身修复进行创面愈合，而大多慢性创面，特别是对于糖尿病性足溃疡等难愈合创面，则需要药物辅助。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是典型的神经营养因子,支持感觉神 经和交感神经细胞的存活，促进其生长、分化，維持其功能。近年来，大量研究表明NGF可用于促进创面愈合，也有学者将NGF应用于糖尿病溃疡患者的临床治疗，发现NGF可促进溃疡愈合。但是神经生长因子半衰期短，体内平均滞留时间仅有约3. 5小时，稳定性较差，局部一次性给药很快被代谢，限制了它在临床上的广泛应用。小肠黏膜下层(small intestine submucosa, SIS),为小肠的组成结构之一,是ー种可降解的天然细胞外基质类生物衍生材料，含有多种生长因子如转化生长因子-0 (transforming growth factor- ^ , TGF-0 )、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosisfactor-a , TNF-a )、喊性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等，但经检测，SIS中不含有NGF。SIS具有低免疫原性，不影响受体对细菌和病毒的免疫反应；良好的生物力学性质、细胞相容性、组织相容性及体内降解能力；促进血管再生等优点。因此，已将SIS运用于肌腱、韧带、膀胱等创伤修复中。专利申请号200710177285. 6中，公开了 SIS的制备方法将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒、脱脂、脱细胞、去垢处理后，制备而成。目前，还未见将SIS与NGF联合用于促进创面愈合的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种组织修复材料。本发明的另ー目的在于提供这种组织修复材料的制备方法和用途。本发明提供了ー种组织修复材料，它是由小肠黏膜下层和神经生长因子组成的。其中，它是由如下重量配比的原料制备而成的小肠黏膜下层(SIS) I飞份，神经生长因子(NGF) IX 10_5 5X 10_5份。进ー步地，它是由如下重量配比的原料制备而成的小肠黏膜下层2份，神经生长因子1X10—5份。更进一歩地，所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质；神经生长因子为3 -神经生长因子。
其中，其制备方法如下取小肠黏膜下层，按(I 3) : (80^120) W/V与0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。本发明还提供了上述的组织修复材料的制备方法，它具有如下操作步骤取小肠黏膜下层，按(I 3) : (80^120) W/V与0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。进ー步地，它具有如下操作步骤取小肠黏膜下层，按2:100W/V与0. 5Mこ酸混合，4°C下搅拌至凝胶状，再向凝胶状液体中加入神经生长因子至100ng/ml，混匀，冷冻干燥后，
消毒，即得。
更进一歩地，所述小肠黏膜下层是由如下方法制备的(I)取小肠，刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后，剪断；(2)加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脱脂后，去离子水冲洗；(3)再用胰蛋白酶消化，去离子水冲洗；(4)最終再以十二烷基硫酸钠水溶液浸泡，去离子水冲洗后，即得小肠黏膜下层。本发明还提供了上述的组织修复材料在制备促进创面愈合的药物中的用途。进ー步地，所述的药物是治疗糖尿病足溃疡、促进成纤维细胞増殖、促进脐静脉内皮细胞增殖的药物。本发明中，NGF在単独使用或与SIS简单混合使用时，会很快失活，不利于对创面的修复；但将NGF与SIS按照本发明特定方法制备成复合材料后，不仅能够有效延长NGF的作用时间，同吋，与単独使用SIS相比，NGF-SIS复合材料对细胞的増殖活性显著增强，表明本发明NGF-SIS复合材料发挥了协同增效作用，为临床用药提供了一种新的选择。
图ISIS 扫描电镜观察(A : X 500 ;BX 1000)图2NGF-SIS对人真皮成纤维细胞增殖的影响(** :与对照组比p〈0. 01)图3NGF-SIS对人脐静脉内皮细胞增殖的影响(* :与对照组比p〈0. 05)图4人真皮成纤维细胞接种于NGF-SIS(A-2h、B-4h、C-ld、D_5d电镜观察(X 1000)图5 人真皮成纤维细胞接种于 NGF-SISS (A-2h、B_4h、C_ld、D_3d、E_5d)HE 染色(XlOO)图6人脐静脉内皮细胞接种于NGF-SIS (A_2h、B_4h、C_ld、D_5d)电镜观察(XlOOO)图7人脐静脉内皮细胞接种于NGF-SIS (A-2h、B_4h、C_ld、D_3d、E_5d)电镜观察(XlOO)图8NGF对人真皮成纤维细胞增殖的影响图9NGF对人真皮成纤维细胞hCOLlAl和hC0L3AlmRNA表达的影响图10各组人真皮成纤维细胞的迁移(倒置显微镜X 100);其中，A划痕后0h，B对照组培养24h后，C50ng/ml浓度组培养24h后，D100ng/ml浓度组培养24h后，E200ng/ml浓度组培养24h后图IlNGF对人真皮成纤维细胞迁移的影响；其中，* :与对照组比p〈0. 05 :与对照组比 p〈0. Ol ；# :与 100ng/ml 和 200ng/ml 组比 p〈0. 05图12 免疫荧光；其中，A，C:trkANGFR 检测，AX 100，C X 200 ;B, D:p75NTR 检测，BX100, DX200图13NGF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响图14NGF对VEGF mRNA表达的影响图15NGF对Ang_2mRNA表达的影响
图16NGF对Ti e_2mRNA表达的影响图17NGF对人脐静脉内皮细胞迁移的影响；其中，林与对照组比p〈0. 01 ；## :与50ng/ml 和 100ng/ml 组比 p〈0. 0具体实施例方式实施例I本发明组织修复材料的制备取小肠黏膜下层(SIS)，按2:100W/V与0. 5Mこ酸混合，4°C下组织匀浆机间歇搅拌Ih至凝胶状，置于自制圆柱形模具中。再向凝胶状的SIS中添加NGF至100ng/ml，搅拌均匀。经过-20°C过夜预冻后，冷冻干燥，环氧こ烷消毒，即得本发明组织修复材料(NGF-SIS)0经测定，本发明组织修复材料中NGF含量为5ng/mg ;使用时，取适量NGF-SIS加水膨胀后，敷贴于创ロ。本发明中所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质，目前主要的制备方法是取空小肠，水洗净后，去除浆膜层、肌层和黏膜层后，分别经脱脂、除蛋白、去垢后，冻干、消毒即得。本发明中采用以下方式取4h内市售新鲜猪空肠清洗后进行以下处理制备SIS，备用(I)机械处理刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后将其剪成长20 30cm ；(2)脱脂加入等体积三氯甲烷-甲醇溶液，4°C过夜，去离子水冲洗；(3)胰蛋白酶消化4°C条件下用0. 25%胰蛋白酶800ml消化过夜，去离子水冲洗；(4)去垢剂处理4 °C条件下加入0. 5%十二烧基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS) 800ml过夜，去离子水冲洗，即得SIS。本发明也可采用现已报道的方法制备SIS，如，罗静聪，等，小肠黏膜下层细胞相容性的研究，生物医学工程学杂志，2004年21卷5期；或者如，申请号CN200710177285. 6，发明名称ー种SIS组织修复材料的制备方法。实施例2本发明组织修复材料中NGF的浓度优选I、主要试剂与仪器I. I 试剂重组人@ -NGF (Peprotech 公司，美国)；P -NGF 抗体(abeam 公司，英国)；MTT(Sigma公司，美国)；DMEM/F12培养基(GIBC0公司，美国)；探针及引物(上海生エ生物工程技术服务有限公司)；I. 2 仪器倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；突光显微镜(Olympus公司，日本)；连续光谱微孔板光密度测读仪(Molecular Devices公司，美国)；实时荧光定量基因扩增仪(Bio-Rad公司，美国)；Gel DoclOOO凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)；2实验方法2. I细胞培养2. I. I人真皮成纤维细胞培养采用酶消化法进行人真皮成纤维细胞体外培养。取2 12岁儿童包皮(四川大学华西医院行包皮环切术者自愿捐赠)，去除皮下脂肪及部分残留血迹后，0. 25%透明质酸酶4°C过夜消化；次日剥离表皮，将真皮剪碎后，加入0. 1% I型胶原酶37°C振荡水浴摇床中消化45min ;终止消化，1200r/min (离心半径13. 7cm)离心5min，以含10%FBS的DMEM/F12培养液重悬接种培养。每隔3d更换I次培养液，待细胞融合至80% 90%吋，进行传代培养。2. I. 2人脐静脉内皮细胞培养
人脐静脉内皮细胞系购买于美国标准品收藏中心ATCC，以含5%FBS的L-DMEM正常培养，当细胞融合率达到80% 90%时传代培养。2. 2NGF对细胞增殖的影响2. 2. INGF对人真皮成纤维细胞增殖的影响取生长状态良好的第3代细胞，活细胞计数后以4X 103个/孔密度接种于96孔板。在含10%FBS的DMEM/F12培养液中培养过夜，再用无血清的DMEM/F12培养液培养24h。之后分别加入NGF浓度为25、50、100、200、400ng/ml含0. 5%FBS的DMEM/F12培养液，每浓度组设6个复孔。继续培养48h后，每孔加入20 ill MTT，37°C孵育3. 5h后吸弃，每孔加入50 u I DMSO,振荡lOmin，于连续光谱测读仪490nm处测定吸光度(A)值。2. 2. 2NGF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响取生长状态良好的细胞，无血清培养基重悬细胞以2 X 103个/孔密度接种于96孔板。过夜培养后，分别加入NGF浓度为6. 25,12. 5、25、50、100、200ng/ml和NGF抗体(I U g/ml)无血清培养液，每浓度组设6个复孔。继续培养48h后，每孔加入20 u I MTT,37°C孵育3. 5h后吸弃；每孔加入50iU DMS0，振荡lOmin，于连续光谱测读仪490nm处测定吸光度(A)值。2. 3NGF对细胞功能的影响2. 3. INGF对人真皮成纤维细胞胶原合成的影响取生长状态良好的第3代细胞，以I X 105个/孔密度接种于6孔板，含10%FBS的DMEM/F12培养液中培养过夜后，再用无血清的DMEM/F12培养液继续培养24h。之后分别加入NGF浓度为50、100、200ng/ml含0. 5%FBS的DMEM/F12培养液，每浓度组设3个复孔。培养48h后，细胞进行实时荧光定量PCR分析按Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模板采用TaqMan荧光探针技术进行Col I和Col III核酸定量。引物及TaqMan探针序列如表I。扩增条件94°C、2min，94°C、20s, 52 56°C、20s，60°C、30s，45 个循环。表I hC0LlAl、hC0L3Al、P-actin 实时荧光定量 PCR 引物
权利要求
1.ー种组织修复材料，其特征在于它是由小肠黏膜下层和神经生长因子组成的。
2.根据权利要求I所述的组织修复材料，其特征在于它是由如下重量配比的原料制备而成的 小肠黏膜下层I飞份，神经生长因子1父10-5 5\10-5份。
3.根据权利要求2所述的组织修复材料，其特征在于它是由如下重量配比的原料制备而成的 小肠黏膜下层2份，神经生长因子IX 10_5份。
4.根据权利要求1-3任意ー项所述的组织修复材料，其特征在于所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质；神经生长因子为￠-神经生长因子。
5.根据权利要求1-4任意ー项所述的组织修复材料，其特征在于其制备方法如下 取小肠黏膜下层，按(I 3) : (8(T120)W/V与0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。
6.权利要求1-4任意ー项所述的组织修复材料的制备方法，其特征在于它具有如下操作步骤 取小肠黏膜下层，按(I 3) : (8(T120)W/V与0. 3 0. 7Mこ酸混合，2 5°C下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于它具有如下操作步骤 取小肠黏膜下层，按2:100W/V与0. 5Mこ酸混合，4°C下搅拌至凝胶状，再向凝胶状液体中加入神经生长因子至100ng/ml，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述小肠黏膜下层是由如下方法制备的 (1)取小肠，刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后，剪断； (2)加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脱脂后，去离子水冲洗； (3)再用胰蛋白酶消化，去离子水冲洗； (4)最終再以十二烷基硫酸钠水溶液浸泡，去离子水冲洗后，即得小肠黏膜下层。
9.权利要求1-5任意ー项所述的组织修复材料在制备促进创面愈合的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的药物是治疗糖尿病足溃疡、促进成纤维细胞增殖、促进脐静脉内皮细胞增殖的药物。
全文摘要
本发明公开了一种组织修复材料，它是由小肠黏膜下层(SIS)和神经生长因子(NGF)组成的。本发明中，NGF在单独使用或与SIS简单混合使用时，会很快失活，不利于对创面的修复；但将NGF与SIS按照本发明特定方法制备成复合材料后，不仅能够有效延长NGF的作用时间，同时，与单独使用SIS相比，NGF-SIS复合材料对细胞的增殖活性显著增强，表明本发明NGF-SIS复合材料发挥了协同增效作用。
文档编号A61L27/36GK102743791SQ20121024771
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月17日 优先权日2011年8月1日
发明者杨志明, 罗静聪, 解慧琪, 钱志勇 申请人:四川大学华西医院