专利名称：一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，属于疾病免疫技术领域。
背景技术：
鸡新城疫病、鸡传染性法氏囊病是养鸡业中常见的疾病，容易大面积爆发从而造成严重的经济损失。其中，鸡新城疫(NewCastledisease)，由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。常呈急性败血鸡新城疫鸡新城疫症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率高，对养鸡业为害严重。1926年首先发现于 印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载，有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型(即缓发型)、中等毒力型(即中发型)、强毒力型(即速发型)3型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。鸡科动物都可患罹本病，家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。鸡传染性法氏囊病又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病，以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果，发病率高，几乎达100%，死亡率低，一般为5% 15%，是目前养禽业最重要的疾病之一。自然条件下，此病只感染鸡，所有品种的鸡均可感染，但不同品种的鸡中，白来航鸡比重型品种的鸡敏感，肉鸡较蛋鸡敏感，此病仅发生于2周至开产前的小鸡，3 7周龄为发病高峰期。病毒主要随病鸡粪便排出，污染饲料、饮水和环境，使同群鸡经消化道、呼吸道和眼结膜等感染；各种用具、人员及昆虫也可以携带病毒，扩散传播；此病还可经蛋传递。目前主要防止方法包括抗病毒药、中西药及其制齐U、单一病的卵黄抗体及其他生物制剂等，其中卵黄抗体是最有效的治疗鸡发生病毒病的方法。
发明内容
本发明的目的提供了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，以针对鸡两种病毒疾病制备的二联高免卵黄抗体冻干粉制剂，不仅方便运输、保存，同时减少饲养成本和劳动操作，减少对鸡群的刺激，提高养殖经济效益。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法将两种不同的传染病的病毒株制成相应的疫苗，首次免疫接种O. 5mL，二、三次免疫接种lmL，每次间隔5天，两种疫苗交替进行免疫，第二次免疫后开始检测抗体效价，达到抗体效价要求时开始收集高免蛋，然后经过一系列物理、化学方法从高免蛋的卵黄中提取抗体，再经过配制加入辅料冻干，得到鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄冻干粉制剂。本发明的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，具体包括以下步骤
I)选出标准毒株制成疫苗，采用每间隔5天对选定的健康鸡群免疫，新城疫抗体与法氏囊抗体交替进行，第二次免疫后开始抗体效价检测，新城疫抗体效价达I :256、法氏囊抗体效价达I :512时,开始收集高免蛋；2)收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；3)分离高免卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到充分混匀卵黄溶液；搅拌混匀的程度到发白色，这样卵黄才能破碎彻底，抗体释放比较完全；4)步骤3)得到的卵黄溶液放入水浴锅内加热30min，然后加入pH为4. 9-5. 2的预冷酸化水溶液，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min,留上清液；5)向步骤4)上清液中加入O. 8-1. 0%体积的辛酸，混匀，静置，弃去杂质漂浮物；6)将步骤5)得到上清液离心lOmin, 20000rpm/min,留取上清液，静置，再用 O.45 μ m的滤膜进行过滤，除去较大的杂质或者杂蛋白，得到卵黄抗体溶液；7)采用超滤装置进行超滤浓缩，浓缩到已定好的体积和抗体效价为止；8)将浓缩好的卵黄溶液加入灭活剂和防腐剂；9)加入辅料；10)制定出合理的冻干曲线，冻出完整的卵黄抗体冻干粉。步骤3)所述无菌水的加入量与卵黄溶液等体积。步骤4)中的采用盐酸配制的酸化水pH为4. 9-5. 2，预冷于温度为4_6°C，时间为l-2h，加入量为未稀释卵黄液体积的6倍。步骤4)中卵黄溶液加热温度为60_65°C，时间30min，要间断性搅拌。步骤6)所述第一次过滤要求的滤膜孔径为O. 45 μ m。将步骤7)中超滤装置的滤膜孔径为截流分子量大于30-100KD的卵黄抗体溶液。步骤8)所述的灭活剂为甲醛，甲醛的加入量为O. 2-0. 3%。步骤8)所述的防腐剂为硫柳汞，硫柳汞为O. 01-0. 02%。步骤9)所述的辅料为葡萄糖、山梨醇、甘氨酸或甘露醇，各辅料的重量百分比为4%葡萄糖、1%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇。冻干曲线程序-40°C开始升华，2h后升到_35°C保持14h。本发明的制备方法是针对这两种发生率最较高、最流行的病毒病，开发一种二联高免卵黄抗体生物制剂，采用鸡新城疫、传染性法氏囊病病毒株制成相应疫苗，制定合理的免疫程序，免疫健康鸡群，收集达到高抗体效价鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取鸡新城疫、传染性法氏囊病的抗体，为了便于运输和保存将这种二联高免卵黄抗体制成冻干粉剂型，这种通过鸡强化免疫后制成的二联卵黄抗体对鸡新城疫、传染性法氏囊病见效快、疗效显著，而且针对性强，同时对鸡的这两种病具有很好的预防效果。本发明提供一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉制剂的制备，分别采用冷热酸化水处理、辛酸溶液、高速离心及过滤提纯和净化，最后经超滤浓缩制得浓缩卵黄抗体液，然后加入各种辅助料，制定冻干曲线和冻干程序得到完美的冻干粉，这种制剂不仅减少饲养成本，而且便于运输、保存，还可以提高工作效率，减少对机体的刺激。
具体实施例方式实施例I
本实发明鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其步骤如下I)选出标准毒株制成疫苗，采用每间隔5天对选定的健康鸡群免疫，新城疫抗体与法氏囊抗体交替进行，第二次免疫后开始抗体效价检测，新城疫抗体效价达I :256、法氏囊抗体效价达I :512时,开始收集高免蛋；2)收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；3)分离高免卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到充分混匀卵黄溶液；搅拌混匀的程度到发白色，这样卵黄才能破碎彻底，抗体释放比较完全；4)步骤3)得到的卵黄溶液放入60°C水浴锅内加热30min，然后加入pH为4. 9的预冷酸化水溶液，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min,留上清液； 5)加热后加入6倍预冷的pH为4. 8盐酸水溶液，混匀，静置，取上清液，离心20min, 15000rpm/min,留上清液；6)将步骤5)得到的上清液中按体积加入O. 8%辛酸，混匀，静置，弃除上浮杂质，留取下清液，离心lOmin, 20000rpm/min,取上清液；7)将步骤6)上清液经过O. 45 μ m滤膜过滤，得到滤液，经过超滤装置截流分子量大于50KD的物质，采用的是循环方式浓缩至已计算好的体积和抗体效价为止；8)浓缩液按体积加入甲醛量为O. 2%，硫柳汞量为O. 01% ；9)配制过程中，加入辅料为4%葡萄糖、1%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇物质；10)预冷，根据冻干曲线程序将配制好的浓缩液进行预冻；11)按照冻干曲线设定冻干程序。质量标准[性状]本品为淡黄色，呈致密的团块。[无菌检验]按《中国兽药典》进行，应无菌生长。[支原体检验]按《中国兽药典》进行，应支原体生长。[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，应符合规定。[安全检验]用14日龄SPF鸡5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。[效力检验]按生产的规格进行稀释至I羽份/mL。I)保护力检测用21日龄SPF雏鸡30只，其中10只，每只肌肉注射I羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h，取试验组和对照组中的10只雏鸡点眼接种IBD和ND稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率应该在90%以上，攻毒对照组死亡率应在80%以上，空白对照组雏鸡无任何变化。2)治愈力测定用21日龄SPF雏鸡90只，30只作阴性对照，60只点眼接种IBD和ND稀释的病毒液，感染12h后，其中30只，每只肌肉注射本品，每日I次，连续3日，另30只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率应80%以上，治疗组存活率应在90%以上，健康阴性对照组30只无任何变化。[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行，应符合兽用生物制品通则规定。[真空度测定]按《中国兽药典》进行，应符合规定。[保质期]根据常温效价检测实验结果，至少可以存放2年。
本发明在研制过程中，为了检测卵黄抗体冻干粉在常温下的保质期，做了以下试验将本品保存在37°C环境中，保存30个月，分别I周、2周、I月、4月、8月、12月、16月、20月、24月、28月、30月后，用琼脂扩散(AGP)法，测定每个时间点取样品的抗体效价变化，结果见表I。表I.常温放置冻干粉不同时间段效价的变化
权利要求
1.一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于先通过制备出免疫性强的毒株制成疫苗，并制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到二联卵黄抗体冻干粉。
2.根据权利要求I所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤 1)选出标准毒株制成疫苗，采用每间隔5天对选定的健康鸡群免疫，新城疫抗体与法氏囊抗体交替进行，第二次免疫后开始抗体效价检测，新城疫抗体效价达I :256、法氏囊抗体效价达I :512时，开始收集高免蛋； 2)收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用； 3)分离高免卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到充分混匀卵黄溶液； 4)步骤3)得到的卵黄溶液放入水浴锅内加热30min，然后加入pH为4.9-5. 2的预冷酸化水溶液，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min,留上清液； 5)向步骤4)上清液中加入O.8-1. 0%体积的辛酸，混匀，静置，弃去杂质漂浮物； 6)将步骤5)得到上清液离心lOmin，20000rpm/min,留取上清液，静置，再用O.45 μ m的滤膜进行过滤，除去较大的杂质或者杂蛋白，得到卵黄抗体溶液； 7)采用超滤装置进行超滤浓缩，浓缩到已定好的体积和抗体效价为止； 8)将浓缩好的卵黄溶液加入灭活剂和防腐剂； 9)加入辅料； 10)制定出合理的冻干曲线，冻出完整的卵黄抗体冻干粉。
3.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤3)所述无菌水的加入量与卵黄溶液等体积。
4.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤4)中的采用盐酸配制的酸化水pH为4. 9-5. 2，预冷于温度为4-6°C，时间为l_2h，加入量为未稀释卵黄液体积的6倍。
5.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤4)中卵黄溶液加热温度为60-65°C，时间30min，要间断性搅拌。
6.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤6)所述第一次过滤要求的滤膜孔径为O. 45 μ m。
7.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于将步骤7)中超滤装置的滤膜孔径为截流分子量大于30-100KD的卵黄抗体溶液。
8.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤8)所述的防腐剂为硫柳汞，硫柳汞为O. 01-0. 02%。
9.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤9)所述的辅料为葡萄糖、山梨醇、甘氨酸或甘露醇中的一种或任意组合。
10.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于冻干曲线程序-40°C开始升华，2h后升到_35°C保持14h。
全文摘要
本发明涉及了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，先通过制备出免疫性强的毒株制成疫苗，并制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到二联卵黄抗体冻干粉。采用本发明的方法制备的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉可以同时针对鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病进行治疗的制剂，在临床上减少了操作强度、降低饲养成本，本发明的鸡新城疫、传染性法氏囊二联高免卵黄抗体冻干制剂便于运输和储藏，而且保存时间长，能保持较高的抗体效价。
文档编号A61K9/19GK102743751SQ20121027250
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者吴红云, 哈斯通拉嘎, 徐进, 郭俊清 申请人:郑州后羿制药有限公司