专利名称：一种昆嵛林蛙改造体抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域,具体地说是ー种昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。
背景技术：
自由基指任何包含ー个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、ニ氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一歩引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。
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目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关,如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。昆箭林娃(Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目娃科娃属，为中国特有种,仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。
发明内容
本发明的目在于ー种昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为ー种昆箭林娃改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3,其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587. 97Da，等电点 8. 96。所述改造体抗菌肽为苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸ー丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー异亮氨酸一苏氨酸一精氨酸ー赖氨酸一半胱氨酸。改造体抗菌肽的应用，所述所述的改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。本发明的有益效果在于本发明根据昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Kunyuenin的改造体Kunyuenin-3,该改造体具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。
具体实施例方式下面用实施例来进ー步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例I昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆I)昆嵛林蛙皮肤总RNA提取①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入Iml总RNA提取缓冲液(Trizol,美国Invitrogen公司产品)，充分混勻，而后于4°C,12000rpm 离心 lOmin。②离心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75% (V/V)こ醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆嵛林蛙皮肤总RNA。2)昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(I) cDNA第一链合成(mRNA反转录):①经DEPC处理(DEPC处理是在含0. I % (V/V) DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入Iul昆箭林娃皮肤总RNA、1 ii I 3’端一链合成引物(3’ In-FusionSMARTer CDS Primer)和 2. 5 y I DEPC 处理的水(DEPC 处理的水是含 0. I % (V/V) DEPC 的水，放置过夜，高压灭菌)使总体积达到4. 5iU，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72°C保温3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。 ②在上述离心管中加入以下试剂(均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备),2. 0 u I 5X 第一链缓冲液、0.25iil IOOmM DTTU. Ou I IOmM dNTPMixU. Ou I SMARTer V Oligonucleotide、0. 25 u I RNase Inhibitor 和 I. Ou I SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm,30s),在42°C保温90min,然后68°C保温lOmin。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 Ul所合成的cDNA第一链备用。(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)①将2 ul cDNA 第一链(mRNA 反转录)、80 U I 去离子水、10 U I IOXAdvantage2PCR 缓冲液、2iil 50 XdNTP 混合物、2 ii I 5’PCR 引物、2yl CDS III/3’PCR 引物以及 2 y I50 X Advantage 2 Polymerase Mix 在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。②在PCR 仪中按以下程序扩增95°C，lmin ; 18 个循环95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链ー 80°C保存。(3)昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆筛选
根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为 5’ -CCAAAGATGITCACCTTGAAG-3’，PCR 另ー扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列为5’ -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR 反应在如下条件下进行94°C 4min，94°C 30sec,57 °C 30sec和72°C lmin,30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到PMD19-T载体(Takara，大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5 a感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落,摇菌提取质粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABIPRISM 377 进行核苷酸测序。测定结果编码昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No. I所示atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60·ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120
gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表为序列长度为279个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源昆嵛林蛙皮肤。昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化学合成I、昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化学合成方法根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通过HPLC反相柱层析脱盐。II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)。III、纯化的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin是昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因编码的一种环状多肽，含有十四个氨基酸残基，分子量1584. 97Da，等电点8. 96。昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列为苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸ー丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー异亮氨酸一苏氨酸一精氨酸ー赖氨酸一半胱氨酸，其中两个半胱氨酸残基之间形成ー对分子内ニ硫键，且C末端酰胺化。制备Kunyuenin-3 I、Kunyuenin-3的制备方法根据上述Kunyuenin的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,利用HPLC反相柱层析脱盐。II、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)。III、纯化的Kunyuenin-I用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。测定结果为
Kunyuenin-3是昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的一种改造体。Kunyuenin-3是一种直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587. 97Da，等电点8. 96。Kunyuen in-3全序列为苯丙氨酸一売氨酸ー脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸ー丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸ー异亮氨酸一苏氨酸一精氨酸ー赖氨酸一半胱氨酸。实施例2Kunyuenin_3药理实验I. Kunyuenin-3抗氧化活性测定DPPH (2, 2-diphenyl-l-picrylhydrazyl hydrate) (.2,2' - ニ苯代苦味酸基苯肼)用甲醇溶解配成6X KT5M的溶液。将48 ill DPPH溶液分别与上述2 ill不同浓度的Kunyuenin-3样品混合,分别室温下避光静置30min,并分别于517nm处测定吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行(表I )，紫外分光光度计调零时使用甲醇。DPPH 清除率) = (AB — AA)/ABX 100 (AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸·
光值)。表I. Kunyuenin-3 抗氧化活性
抗菌肽最终浓度DPPH清除率1%
(|Lig/ml )
40065.2
200 61.1 10063.3
50J60.7结果如表I所示，Kunyuenin-3具有极强的抗氧化活性，且其活性随着浓度的升高而逐步增强。在样品浓度为400ii g/ml时，其DPPH清除率1%达到65. 2°ん2. Kunyuenin-3 抗菌活性检测分别挑取保存于斜面上的试验菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌090223+和星形诺卡菌090312+)均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0. 5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Kunyuenin-3样品溶液10 yl，于37°C倒置培养18 — 20小吋，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。3. Kunyuenin-3 最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定试验菌株分别接种到MH液体培养基中(购自青岛海博生物技术有限公司)，370C振荡培养到对数生长期，而后将培养至对数生长期的培养液用新鮮MH液体培养基稀释到2X105cfu/ml。取I. 9mL上述稀释的细菌培养液，加入经0. 22m孔径膜过滤的2mg/ml的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin-3样品溶液0. ImL作为第一管，第一管混勻后取出ImL加入第2管中，依次倍比稀释(參见表2)，自第9管吸出ImL弃去，第10管系对照管。表2稀释方法
权利要求
1.一种昆箭林娃改造体抗菌肽，其特征在于改造体抗菌肽为昆箭林娃(Ranakunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3,其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587. 97Da，等电点8. 96。
2.按权利要求I所述的昆嵛林蛙改造体抗菌肽，其特征在于所述改造体抗菌肽为苯丙氨酸一売氨酸一脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸一异亮氨酸一苏氨酸一精氨酸一赖氨酸一半胱氨酸。
3.—种权利要求I所述的昆嵛林蛙改造体抗菌肽的应用，其特征在于所述的改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。
全文摘要
本发明属于生物医学技术领域，具体地说是一种昆嵛林蛙(Rana kunyuensis抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-3及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为昆嵛林蛙(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-3，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1587.97Da，等电点8.96。本发明改造抗菌肽Kunyuenin-3具有极强的抗氧化活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。
文档编号A61K8/64GK102786583SQ20121028750
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者于海宁, 王义鹏, 秦松 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所