专利名称：杠板归提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中医药领域,涉及以杠板归polygonum perfolatum L.的全草为原料，制备杠板归提取物，以及该提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术：
肝纤维化并不是独立的疾病，而是肝脏受到炎症损害的一种表现状态，是由肝炎发展为肝硬化的必经阶段。因此阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化和肝癌具有重要意义。肝纤维化的治疗方法有很多，比如西药，虽然西药治疗肝纤维化的速度快，但是容易给肝脏造成负担，治标不治本。近年来，国内外大量研究表明中药在治疗肝纤维化方面显示出显著疗效，因此采用从中药中提取开发抗肝纤维化的药物具有重要意义。中药杠板归系寥科寥属植物杠板归polygonum perfolatum L.的全草，又名贯叶寥、河白草、蛇见退等，全国均有分布。据古代中草药和民间药方记载，杠板归用途十分广泛，常用来治疗疖肿、乳腺炎、百日咳、湾痢、黄疸、肾炎水肿、跌打肿痛、吐血便血、慢性湿疹、毒蛇咬伤等疾病。现代药理学研究表明，杠板归具有抗菌、抗病毒、抗诱变、降血压、抗肿瘤、止血等作用。至今，已公开的与杠板归有关的文章有60多篇，但以中药杠板归提取物在制备抗肝纤维化的药物中的应用，以及对该药物进行抗肝纤维化动物实验的方法和结果，则未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供中药杠板归提取物在抗肝纤维化药物中的应用。实现本发明目的的技术方案是一种杠板归提取物的新用途，用于抗肝纤维化，即是将从杠板归中提取出的杠板归提取物制成片剂、颗粒剂或口服液等剂型以治疗肝纤维化疾病，其使用剂量为以60kg成人计，杠板归提取物每日总摄取量不少于0. 36g。本发明所述的杠板归提取物通过采用现有制备工艺制备将杠板归全草阴干粉碎，得到粗粉，用70 % 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，滤过，浓缩至无醇味的滤液，过AB-8大孔树脂柱，静置吸附，用70 %乙醇洗脱，收集流出液，减压浓缩至稀膏或稠
膏即可。本发明的积极效果是提供一种高效低毒、副作用小、药源广的治疗肝纤维化疾病的新药。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。实施例一、杠板归提取物的制备I、将新鲜采集的杠板归全草阴干粉碎，得到杠板归粗粉，用20倍量70%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小时，合并醇提液，滤过，浓缩至无醇味的滤液，过AB-8大孔树脂柱，静置吸附12h，用70%乙醇洗脱，收集流出液，减压浓缩至稀膏。稀膏中药材浓缩液=3:1，ff/Vo2、将新鲜采集的杠板归全草阴干粉碎，得到杠板归粗粉，用20倍量85%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小时，合并醇提液，滤过，浓缩至无醇味的滤液，过AB-8大孔树脂柱，静置吸附12h，用70 %乙醇洗脱，收集流出液，减压浓缩至稠膏，稠膏烘干，打成80目细粉。稠膏中药材浓缩液=5:1,W/V。二、将杠板归提取物制成片剂、颗粒剂或口服液剂型
I、按杠板归提取物的得率计算，取相当于IOOOg杠板归提取物干膏细粉，约重24g，加淀粉至总量133g，制粒，压成片剂，素片重0. 5g，每片含杠板归提取物0. 09g。成人每天I次，一次4片。所述片剂药物中每片杠板归提取物百分含量为0. 18%，余量为药剂成型辅料。2、按杠板归提取物的得率计算，取相当于IOOOg杠板归提取物干膏细粉，约重24g,加鹿糖粉与糊精的混合物至总量330g,制粒,得颗粒剂,分装,每小包5g,每小包含杠板归提取物0. 36g。成人每天I次，一次I包。所述颗粒剂药物中每粒杠板归提取物百分含量为0. 072%，余量为药剂成型辅料。3、按杠板归提取物的得率计算，取相当于IOOOg杠板归提取物稀膏，体积335ml，加白砂糖300g,食用白酒50mL,加热溶解,最后加水到660ml,过滤,得口服液,分装，每支10ml，每支含杠板归提取物0. 36g。成人每天I次，一次I支。所述口服液药物中每支杠板归提取物百分含量0. 036%，余量为药剂成型辅料。三、本发明的杠板归提取物抗肝纤维化药效学实验。I、材料I. I 动物SPF级SD大鼠80只，体重175_225g，雌雄各半，由桂林医学院SPF实验动物中心提供(许可证号SCXK2007-0001)。I. 2药品与试剂取5000g杠板归药材，加20倍量70%乙醇回流提取2次，浓缩提取液，加水溶解，SAB-S大孔树脂柱，得供试药品，得率2. 40%，由桂林医学院药物研究所提供；质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(IV-C)试剂盒购于北京北方生物技术研究所；二甲基亚硝胺(DMN，纯度99%)，购于天津市化学试剂研究所；秋水仙碱粉剂，serva公司产品；兔抗鼠TGF- P :多克隆抗体(1:100稀释)，购于武汉博士德有限公司。I. 3 仪器TLL-C台式冷冻离心机，北京四环科学仪器厂；TSN_695B型放免测量仪，上海日环仪器一厂；AU600全自动生化检测仪,奥林巴斯生产；752型分光光度计,上海第三分析仪器厂；01ymPus BX51显微镜,奥林巴斯生产；BS1105电子天平,德国sartorius公司。2、方法2. I分组和给药80只SD大鼠随机分为正常组、模型组、杠板归高剂量组、中、低剂量组和秋水仙碱组共6组，每组15只，雌雄各半。除正常对照组以外，其余各组大鼠均以0. 5% DMN溶液(I. 6mL. kg—1)腹腔注射，每周连续3天，每天I次，第I周用2/3剂量，以后用全量。秋水仙碱组剂量为0. lmg. kg'杠板归高、中、低剂量组分别为7. 5，5. 0，2. 5g. kg_\除空白对照组和模型组给予等体积生理盐水外，各组均灌胃给药，I次/d，连续4周。4周末摘大鼠眼球取血，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(IV-C);免疫组化检测转化生长因子(TGF-^1)02. 2检测指标严格按照试剂盒的要求规范操作，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(IV-C);取肝组织，做病理切片，HE染色，观察HF的形成；免疫组化检测转化生长因子P 以大鼠肝组织TG F-P1阳性表达密度(面积)计算。依据2000年西安全国肝病会议通过的标准，将肝炎病变依纤维化程度分为4期，见表I。表I纤维化程度分期标准
Im 纤维化程度
b0无
SI汇管区纤维化扩大，限局窦周及小叶内纤维化S2汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留
53纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化
54早期肝硬化2. 3数据处理各组实验数据均以T 土 s表示，采用统计软件SPSS 13. 0进行方差分析，P < 0. 05有统计学意义。3、结果3. I药物对肝纤维化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影响模型组大鼠血清中HA，LN, PC III，IV -C水平明显高于正常组，具有显著性差异(均p〈0. 01)，说明造模成功；杠板归高、中剂量组和秋水仙碱组大鼠血清中HA，LN, PCIII，IV -C水平均明显低于模型组，具有显著性差异(P〈0. 05或p〈0. 01);杠板归低剂量组大鼠血清中HA, PC III，IV -C水平与模型组比较，无显著性差异(p>0. 05)，见表2。表2杠板归对DMN诱导的肝纤维化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影响(7士s)组别 N 剂量/呵.kg '~HA/ng, L—1LNTTgT1PCIII/ u g, L—1 IV-C/ u g. L—1 ~
正常 15二97.55 + 12.89^ 70.99±77. W 50.23+15.35n 31.66+6.1121
模型 8- 389.37. ±1UU 0 281.25土45. 17 72.14±27.98 138.00±22. 38
75. 30 + 22. 87
IRIl 10 0.1 192. 35±98. 31 =) 128. 65± 87 . 792 ) 52. 13± 12. 11
2、
高剂量 11 7500 165. 69±81.01 —’ 123. M±44. 35 2; 53. 91±22. Ol2' 70. 54±65. 33中剂量 11 5000 188.96±65.25 :) 120.68±13.2,i58. 20±46.31° 80. 12±23.39::)低剂量 9 2500 368. 12±55.64 151. 29土 11. 35” 70. 56±61.54 118. 20土 17. 31注与模型组比较DpCO. 05，2)p〈0. 01。3. 2病理形态学观察(HE染色)与正常组相比，模型组肝小叶结构紊乱，小叶内肝细胞广泛水肿，可见大量脂质空泡形成；汇管区可见大量炎性细胞浸润，成纤维细胞大量增生，胶原纤维形成，形成粗大的纤维间隔，并将增生的肝细胞团分隔成大小不等的假小叶，提示造模成功。与模型组比较，杠板归高、中剂量组、秋水仙碱组大鼠肝脏炎症程度和纤维化程度均明显降低，尤其杠板归高、中剂量组肝组织病变改善效果更为明显，肝小叶结构基本完整，极少有假小叶形成，胶原沉积明显减少。3. 3肝组织TGF- ^ :表达正常组仅见于汇管区、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞且着色较浅，范围较窄；模型组中主要表达于汇管区周围细胞、窦内皮细胞、中央静脉周围细胞、部分肝细胞及纤维间隔内，呈棕黄色颗粒状，范围广；杠板归高、中剂量组、秋水仙碱组阳性表达明显下降，多见于中央静脉周围细胞、肝窦内皮细胞、汇管周围细胞；杠板归低剂量组中表达于汇管区周围细胞、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞、部分肝细胞及纤维间隔内，呈棕黄色颗粒状，范围广(p〈0. 05或p〈0. 01);杠板归低剂量组TGF-P丨表达无统计学意义(P>0. 05)。见表3。表3杠板归对大鼠肝纤维化模型TGF- ^ :表达的影响SDN 剂量/mg. kg'TGF-1面密度
正常组15二0.025 ±0.004 ~
模型组8-0.201 ±0.083
秋水仙碱组100. I0.059±0.0172)
杠板归高剂量组1175000. 055±30. 068
杠板归中剂量组1150000.088±0.052 a 杠板归低剂量组925000. 151 ±0.092注与模型组比较DpCO. 05,2)p<0. 01。将大鼠肝组织病理结果分级，经秩和检验，与模型对照组比较，秋水仙碱组和杠板归高、中剂量组均存在统计学意义(P < 0. 05或P < 0. 01)，见表4。表4肝纤维化大鼠病理检查结果
组别(n)剂量/mg. kg 1 b b^Fi5
正常(15)115~0 0 0 0 <0.01 ~
模型(8)-0 0 1 3 4 -
r^co1 秋水仙碱(10) 0. I2 7 I 0 0 <0.01
L0053」
杠扳归(11)7o0018200<0.01
CiI J5000154 I0<0.01
(y)250000234>0.05 综上所述，本发明首次对杠板归提取物进行了抗肝纤维化的研究，通过动物实验表明，杠板归提取物具有较好的的抗肝纤维化的药理作用，作用机制与杠板归通过保肝，降低TGF-P i表达从而抑制肝纤维化的启动密切相关。可用于制备片剂、口服液、颗粒剂等剂型的治疗肝纤维化的中药制剂。
权利要求
1.杠板归提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征是所述杠板归提取物是通过将杠板归全草阴干粉碎，得到粗粉，用70% 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，滤过，浓缩至无醇味的滤液，过AB-8大孔树脂柱，静置吸附，用70%乙醇洗脱，收集流出液，减压浓缩至稀膏或稠膏制备得到。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征是将杠板归提取物制成片剂、颗粒剂或口服液剂型。
全文摘要
本发明公开了杠板归提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用，通过动物实验表明，杠板归提取物具有较好的抗肝纤维化的药理作用，作用机制与杠板归通过保肝，降低TGF-β1表达从而抑制肝纤维化的启动密切相关，对肝纤维化有很好的抑制作用。本药高效低毒，副作用小，药源广，开发成本低。
文档编号A61P1/16GK102764306SQ20121029015
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者张可锋, 段小群, 高雅 申请人:桂林医学院