一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法
【专利摘要】本发明属生物医学领域，具体涉及诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法。本方法中，将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞在含有N2的培养基中诱导后，转入含有神经基础培养基、敲除的血清替代物和烟酰胺的视网膜诱导培养基，获得视网膜前体细胞，本发明方法可明显提高人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的分化率；所分化的视网膜前体细胞可用于移植治疗视网膜神经元不可逆性变性疾病，如：年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性；还用于来源于患者的iPS细胞上作为细胞模型用于药物筛选和基因干扰实验。与现有技术比较，本方法所用的小分子化合物少，能有效地避免非人源性因素的影响，而获得的视杯样细胞球的率却明显高于现有技术的诱导分化方法。
【专利说明】一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物医学领域，涉及细胞诱导方法，具体涉及诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法。尤其诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞包括神经视网膜前体细胞和色素上皮前体细胞的方法。
【背景技术】
[0002]在各种临床疾病中，中枢神经系统疾病一直是人们关注的焦点。本领域共识，胚胎干细胞的研究对治疗中枢神经系统疾病具有极为重要的意义。视网膜是中枢神经系统位于眼眶内的一部分，鉴于其易于获取，并且随着影像学技术的发展以及对视网膜结构与功能的深入了解，人们在探讨细胞疗法治疗中枢神经系统疾病的过程中，使得视网膜成为研究的首选。近年来，人们通常利用视网膜来研究神经祖细胞的发育过程，因此对视网膜的研究成为了新的热点。 [0003]据报道，许多目前尚无治疗方法的眼科患者，如:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、色素性视网膜炎(retinitispigmentosa, RP)等，均可受益于基于胚胎干细胞的视网膜细胞移植疗法。据报道，AMD是发达国家的主要致盲因素，全世界大约有2500万至3000万人受到这种疾病的影响。在英国，大约有1%的人口受到这种疾病的困扰。(数据来自皇家盲人师范学院和黄斑疾病学会)。
[0004]研究显示，AMD患者和RP患者的视力丧失是由视网膜色素上皮细胞的不可逆性损伤所造成的。然而，在这种情况下，视网膜节细胞大多还可能保留下来，因此使得感光细胞和RPE细胞的移植替换疗法成为恢复患者视觉功能的一种很好的选择。
[0005]RPE细胞移植治疗AMD的效果已经在自体移植中得到了证实，这种自体移植是将RPE层或脉胳膜层从周边移植到黄斑区。但是，由于视网膜患者的数量众多、自体移植手术比较复杂以及自体来源细胞的数目有限，使得人胚胎干细胞来源的视网膜细胞在视网膜修复中发挥极其重要的作用。
[0006]越来越多的研究数据表明，人胚胎干细胞在特定的诱导环境下可以定向分化成视网膜细胞。随着人胚胎干细胞诱导技术的快速发展，由人胚胎干细胞向视网膜细胞的诱导分化已经有了较为完善的技术，但仍存在分化率比较低等缺陷。国际上有报道称，人胚胎干细胞经过一系列诱导分化，可以得到20%左右的视网膜神经球，其余大约80%为前脑神经球，其诱导分化方案得到的视网膜神经球的总体效率偏低。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种诱导干细胞分化为视网膜前体细胞的方法，尤其涉及诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞包括神经视网膜前体细胞和色素上皮前体细胞的方法，更具体的涉及一种用神经基础培养基(Neurobasal)、敲除的血清替代物(Knockout-Serum replacement, K0SR)和烟酸胺(Nicotinamide, NIC)将人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法。该方法能有效解决视网膜细胞移植治疗中因细胞分化效率低、细胞分化周期长等缺陷造成的难题。
[0008]本发明的进一步目的是提供所述方法制得的细胞在用于治疗视网膜神经细胞退行性变等疾病中的用途。
[0009]本发明方法，将人多能干细胞经过悬浮、贴壁、再悬浮、消化等一系列诱导分化过程获得阳性率比较高的视网膜前体细胞，具体是将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞在含有N2的培养基中诱导后，转入含有神经基础培养基(Neurobasal)、敲除的血清替代物(Knockout serum replacement, K0SR)和烟酸胺(Nicotinamide, NIC)的视网膜诱导培养基，获得所需的视网膜前体细胞。
[0010]所述的人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞由美国威斯康辛大学张素春教授实验室提供，也可通过市购的渠道获得(如:购自上海同济大学医学院华东干细胞库和中南大学生殖与干细胞工程研究所的人类胚胎干细胞库)。
[0011]本发明方法中，首先将人多能干细胞在神经诱导培液中进行分化，当其开始出现类神经管的结构时，更换为视网膜细胞诱导分化培液。该方法中利用Neurobasal培养基、Knockout血清和NIC诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞，能有效解决视网膜细胞移植治疗中因细胞分化效率低、细胞分化周期长等缺陷造成的难题。
[0012]具体而言，本发明的诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法，其特征在于，其包括步骤:
[0013](1)将人多能干细胞消化后，制成细胞球，第3天更换培养基为神经诱导分化培液；
[0014](2)第7天进行贴壁，第14天更换培养基为视网膜细胞诱导分化培液；
[0015](3)第16天将形 成的类神经管样结构吹下来，第17天将大的细胞球吹成稍小一点的细胞球，不可过于用力吹打，否则太小的细胞球将不会形成典型的视杯样细胞球；
[0016](4)第21天可以获得形态结构典型的视杯样细胞球。
[0017]本发明所述的神经诱导分化培液中，含有Dulbecco’ s modified Eagle’smedium:Nutrient mixture F-121:1 (DMEM:F12)、5ml 非必须氨基酸(MEM non-essentialamino acids solution, NEAA)、2mM L_谷氨酰胺(L_glu)和N2复合物，将所有成份加入DMEM:F12培养基后定溶至500ml，过滤后备用。
[0018]本发明中，所述的视网膜细胞诱导分化培液中，含有Neurobasal培养基、14%血清替代物(K0SR)、5ml 非必须氨基酸(MEM non-essential amino acids solution, NEAA)、2mML_谷氨酰氨(L-glu)以及lOmM烟酰胺(NIC) JfNIC用去离子水溶解后过滤除菌，制成终浓度为1M的NIC溶液，例如:100ml NIC溶液中含NIC粉12.212克，将NIC溶液分装成5ml/支，以便使用。如果每次配液是500ml的体积，贝U加入70ml K0SR、5ml NEAA、5ml L_glu、5mlNIC,最后用Neurobasal神经基础培养基补足500ml,过滤除菌后使用。
[0019]本发明中，将人多能干细胞在37°C培养箱用Dispase酶消化2分钟后，迅速吸除消化液，加入新鲜预热的干细胞培液，用黄枪头将细胞克隆全部刮下，尽量不要用枪或吸管吹下，以保证刮下的细胞克隆大小基本一致。将刮下的细胞小片轻轻移入15ml离心管中，待其自然沉降(大约需要5~10分钟)后，吸除上清液，加入新鲜预热的干细胞培液，用吸管轻轻吹散后，移入10cm培养皿中。前面一定要使其细胞小片自然沉降，千万不可离心，否则细胞小片会积压在一起，重悬时需要较大的力度才可将其吹散，会造成大小非常不一致的细胞球，影响后续的分化效率。
[0020]本发明中，以人多能干细胞悬浮制成细胞球的当天作为第0天，在第3天将干细胞培液更换为神经诱导分化培液，使细胞球在神经诱导分化培液中生长4天，能保证细胞球充分变亮后再进行贴壁，从而可以提高贴壁效率和神经元的分化率。
[0021 ] 本发明中，将分化至第7天左右的细胞球进行贴壁，为了促进贴壁，需要在神经诱导培液中加入10%的胎牛血清，贴壁的时间要达到16个小时，以便获得更高纯度的视网膜细胞球，而以往的神经诱导分化方案要求贴壁时间不得超过12小时。在贴壁时间达到16个小时以后，将含有血清的神经诱导培液更换为不含血清的神经诱导培液，以防止干细胞向其它胚层的细胞过度分化。
[0022]本发明中，将细胞球贴壁后，在第14天将神经诱导分化培液更换为视网膜细胞诱导分化培液，因为此时开始出现玫瑰花环样结构(rosette)，即类神经管样的结构。视网膜细胞诱导分化培液可以促使神经元前体细胞向视网膜前体细胞的方向分化。
[0023]本发明中，在第16天左右，将形成的类神经管样的结构轻轻吹下，此时的细胞碎片比较大。吹下后的第2天，将细胞碎片移入离心管中，待其自然沉降后，吸除上清液，加入新鲜预热的视网膜细胞诱导分化培液2ml左右，用1ml蓝枪头将细胞碎片吹小。可以采取分步吹小法，即用蓝枪头吹5次左右，将离心管稍微静置，将上清移入培养皿中，将沉淀下来较大的细胞碎片再次用蓝枪头吹小。经过数次，可以分步将较大的细胞碎片吹成较小的细胞球。但是要注意不可将细胞球吹得太小，否则会影响视杯样细胞球的获得率。经过这种吹吸的过程，可以将非神经元细胞分散成单细胞，经过几次换液之后，可以将悬浮的非神经元单细胞完全清除，从而获得比较纯的视网膜细胞球。 [0024]实验结果证实，本发明所述的诱导分化方法(即Neurobasal+Knockoutseurm+NIC)可明显提高人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的分化率。所分化的视网膜前体细胞可用于移植治疗视网膜细胞不可逆性变性疾病，尤其是年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性；本方法进一步可应用于来源于患者的iPS细胞上，可作为细胞模型用于药物筛选和基因干扰实验。
[0025]本发明的方法的有益效果有:
[0026]在诱导分化的第4周可以获得80.75 ±1.54%的视杯样细胞球，而现有技术的诱导分化方案仅可获得20.4±4.3%的视杯样细胞球。与现有技术的诱导分化方案比较，本诱导分化方案所用的小分子化合物少(如:DKK_1和Lefty-A等)，有效地避免了非人源性因素的影响，而获得的视杯样细胞球的率却明显高于现有技术的诱导分化方法。
[0027]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施方式对本发明的诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法及用途进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是人多能干细胞来源的视网膜细胞的诱导分化示意图，其中显示了在没有外源性生长因子的条件下，将干细胞在神经诱导培液里悬浮培养14天，然后更换为视网膜细胞诱导培液。在诱导分化的第3周末，分别在培液中加入bFGF和Activin A，可以分别获得高纯度的视网膜神经球和较高纯度的色素上皮细胞球；(B)在诱导分化的第4周，分别用神经诱导培液和视网膜细胞诱导培液所获得的视杯样细胞球的比值，在神经诱导培液中获得的视杯样细胞球仅为9.09±1.19%,而在视网膜诱导培液中获得的视杯样细胞球高达80.75±1.54%，百分比代表视杯样细胞球数目占全部细胞球数目的比值，*P=2.37X10_16 ；(C)在加入bFGF和Activin A以及两者都不加的条件下，Chxl0\ Mitf+、ChxlO+/Mitf+以及ChX10_/Mitf_细胞球占全部细胞球的比值；图中可见，加入bFGF后，Chxl0+的细胞球从52.66±6.18%增加到 82.01 ±5.87%，当加入 Activin A后，Mitf+的细胞球从 13.86±1.39%增加到 26.6±3.84%。
[0029]图2是细胞球贴壁后第15天形成典型的类神经管样结构，圈中可见类神经管样结构的细胞呈柱状并围绕中心呈放射状排列，Bar=50 μ m。
[0030]图3是4w的视网膜细胞球，可见很多典型的周围比较亮中央类似有凹陷的视杯样细胞球，这种细胞球称之为视网膜前体细胞球(赢)；在某些细胞球上还出现了色素的形成，
其将可分化发育成为色素上皮细胞;(*)所示为半色素化的视网膜细胞球；Bar=50ym。
[0031]图4是6w的视网膜神经球转录因子ChxlO的免疫荧光染色，其中，A、B:人胚胎干细胞诱导分化的6w视网膜细胞球；C:7w人胚胎视网膜组织切片染色；D:8w人胚胎视网膜组织切片染色，图中显示，人胚胎视网膜ChxlO的表达位于神经视网膜的外侧半部分，而诱导的视网膜细胞ChxlO的表达也是位于细胞球靠近外表面的部位，说明诱导的视网膜神经球不仅有ChxlO的表达,而且其表达的位置特征也与体内相一致，Bar=50 μ m0
[0032]图5是6w的视网膜神经球转录因子NeuroD的免疫荧光染色，其中，A、B:人胚胎干细胞诱导分化的6w视网膜细胞球；C:7w人胚胎视网膜组织切片染色；D:8w人胚胎视网膜组织切片染色，图中显示，NeuroD在诱导的视网膜神经球以及人胚胎视网膜内的表达特征是一致的，均为散在分布，Bar=50 μ m0
[0033]图6是6w的视网膜色素上皮细胞球转录因子Mitf和0tx2的免疫荧光染色，其中，A、D:8w人胚胎视网膜组织切片染色；B、C、E、F:人胚胎干细胞诱导分化的6w视网膜色素上皮细胞球，图中显示，Mitf和0tx2在诱导的色素上皮细胞球和人胚胎的色素上皮层均呈密
集排列的单层表达，所指为色素上皮细胞所在部位，Bar=50 μ m。
[0034]图7是iPSCs的诱导分化:应用同样的诱导分化方案，可以将iPSCs IMR90细胞系定向诱导分化为视网膜细胞球；所指为视网膜神经球，而所指为视网膜色素上皮细胞球，同时也有 ChxlO (C)和 0tx2/Mitf (D)的表达，Bar=50 μ m。
【具体实施方式】
[0035]实施例1
[0036]( 1)人多能干细胞的维持与传代:[0037]每天更换人多能干细胞的培液，每5~7天传代一次；传代前需要提前在6孔板中铺一层小鼠成纤维细胞滋养层，用以维持干细胞的多能分化特性。传代时，吸除孔板里的培液，用DMEM/F12培液洗一次，吸除培液后加入Dispase (lU/ml)消化液1ml/孔，37°C培养箱中消化2分钟，迅速吸除消化液，加入干细胞培液2ml/孔，用黄枪头将孔板里的细胞克隆刮下，以保证细胞碎片的大小基本一致，将1孔和5孔细胞碎片悬液分别移入2个15ml离心管中，待其自然沉降后，吸除上清液，加入新鲜预热的干细胞培液，1孔的细胞碎片悬液用以传代一个6孔板，所用干细胞培液中含4ng/ml的bFGF，5孔的细胞碎片悬液用以形成细胞球，所用干细胞培液中不含bFGF ；
[0038](2)形成细胞球:
[0039]消化制作过程同干细胞传代；将5孔的细胞碎片悬液移入10cm培养皿中，以消化的当天为第0天，第3天更换培液为神经诱导分化培液，至第7天可见细胞球几乎全部变亮后，可以进行贴壁；
[0040](3)形成类神经管样结构:
[0041]诱导的第7天左右，细胞球几乎全部变亮后，在神经诱导分化培液中加入10%胎牛血清，将细胞球移入用以贴壁生长的培养皿中，待其贴壁后，更换新鲜预热的不含胎牛血清的神经诱导分化培液；本实施例中，在含血清培液中的时间不低于16小时，以保证视杯样细胞球的形成率，达到16小时之后，更换为不含血清的神经诱导培液，以后隔天换液；第14天，更换培液为视网膜细胞诱导分化培液，以后隔天换液；第16天左右，贴壁的细胞球几乎全部形成典型的类神经管样rosette结构；
[0042](4)形成视网膜细胞球:
[0043]第16天，将形成的类神经管结构(rosette)吹下，吸除培液，用DMEM/F12洗一次，然后将细胞片吹打下来，移入15ml离心管中；待其自然沉降后，吸除上清液，加入新鲜预热的视网膜细胞诱导分化培液洗一次，然后再次加入培液2.5ml左右，将大的细胞片稍微吹小，移入10cm悬浮培养皿中进行培养，补足培液；吹下后的第2天，将细胞碎片移入离心管中，待其自然沉降后，吸除上清液，加入新鲜预热的视网膜细胞诱导分化培液2ml左右，用lml蓝枪头将细胞碎片吹小；本实施例中，采取分步吹小法，即用蓝枪头吹5次左右，将离心管稍微静置，然后将上清移入培养皿中，沉淀下来较大的细胞碎片再次用蓝枪头吹小；经过数次，可以分步将较大的细胞碎片吹成较小的细胞球，；经吹吸后，将非神经元细胞分散成单细胞，经过几次换液之后，可以将悬浮的非神经元单细胞完全清除，从而获得较纯且较亮的视网膜细胞球；
[0044](5)免疫荧光检测视网膜细胞球:
[0045]以观察到细胞诱导3w时，出现约80%左右且较亮的视杯样细胞球；取材3w、4w、5w、6w 和 7w 的细胞球进行 Chxl0、NeuroD、Pax6、0tx2、Sox2、Mashl、Mitf、Rx 等视网膜早期发育相关转录因子的免疫荧光染色；
[0046]实验结果证实，本发明所述的诱导分化方法(即Neurobasal+Knockoutseurm+NIC)可明显提高人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的分化率。
【权利要求】
1.一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法，其特征在于，将人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞在含有N2的培养基中诱导后，转入含有神经基础培养基、敲除的血清替代物和烟酰胺的视网膜诱导培养基，获得视网膜前体细胞，其包括步骤:(1)将人多能干细胞消化后，制成细胞球，第3天更换培养基为神经诱导分化培液；(2)第7天进行贴壁，第14天更换培养基为视网膜细胞诱导分化培液，得神经管样的细胞结构；(3)第16天将形成的类神经管样结构吹下来，第17天将大的细胞球吹成稍小的细胞球，形成典型的视杯样细胞球；(4)第21天获得形态结构典型的视杯样细胞球。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)第3天更换培养基为含有1%N2、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰氨的神经诱导分化培液。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)第7天贴壁时，用10%胎牛血清促进细胞球贴壁，且使用时间16个小时。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的视网膜细胞诱导分化培液中，含有Neurobasal培养基、14%血清替代物、5ml非必须氨基酸、2mM L-谷氨酰氨以及10mM烟酰胺。
5.权利要求1的诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法制得的视网膜前体细胞在制备移植治疗视网膜细胞不可逆性变性疾病药物中的用途。
6.按权利要求5所述的用 途，其特征在于，所述的视网膜细胞不可逆性变性疾病是年龄相关性黄斑变性或视网膜色素变性。
7.权利要求1的诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法制得的视网膜前体细胞在制备iPS细胞药物筛模型中的用途。
【文档编号】A61K35/44GK103627669SQ201210301765
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月22日 优先权日:2012年8月22日
【发明者】王晓冰, 周国民, 张素春 申请人:复旦大学