专利名称：磺酸化丝素蛋白材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种可用于韧带、血管及骨组织工程材料的磺酸化丝素蛋白材料的制备方法。
背景技术：
生物材料是一类应用于治疗、诊 断、修复或替换人体组织、器官或增进其功能的新型高技术材料，涉及亿万人的健康，是保障人类健康的必需品，其成功应用挽救了危重病人的生命，同时也提高了病人的生活质量和健康水平。天然聚合物材料与生物大分子物质极为相似，能够被生物体内酶降解，比人工合成材料组织相容性好，具有较小的免疫原性，但其也存在不足，如生物活性偏低。为了保持生物材料优点的同时又提高其生物活性，对天然聚合物进行化学修饰是解决此问题的有效途径。我国是产丝大国，具有几千年应用蚕丝的历史，但都局限于初级的使用。丝素蛋白作为天然生物蛋白由蚕茧经脱胶、溶解、透析和冷冻干燥获得，具有较好的生物相容性、低免疫源性、良好的机械性能以及物理化学性质。近年来，丝素蛋白在眼角膜、血管、人造皮肤、韧带及骨等组织工程，药物缓控释，酶固定化等领域都有较广泛的应用，但其生物学活性较低。本发明在天然丝素蛋白材料的基础上采用偶氮盐方法进行化学修饰，获得磺酸化丝素蛋白，提高丝素蛋白的生物学活性。目前，国内专利CN 1608683A公开了一种抗凝血不溶性丝素蛋白的制备方法，采用的是将肝素和丝素蛋白共混方法制备不同形貌和结构的抗凝血不溶性丝素蛋白材料，在一定程度上达到目的。为了提高丝素蛋白的生物活性，CN 101029079A公开了硫酸化丝素蛋白的制备方法及其在抗凝血药物上的应用，采用氯磺酸为原料结丝素蛋白进行修饰。在溶液中硫酸基团化学性质稳定，能很好地模拟肝素性质，起到抗凝血作用。采用偶氮盐方法对丝素蛋白进行磺酸化修饰，可得到有生物活性的磺酸化丝素蛋白，并且制备方法方便，可行。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种磺酸化丝素蛋白材料的制备方法，该磺酸化丝素蛋白材料在起到抗凝血作用的同时还可以提高材料对细胞或生长因子的粘附、扩散和增殖能力。技术方案磺酸化丝素蛋白材料的制备方法，步骤为a.偶氮盐储备液的配制将ImM O. 4M对氨基苯磺酸溶液滴加到O. OlM 4M对甲基苯磺酸溶液，使对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I : (2 8)，保持温度在O 5°C ；b.向步骤a混合液中滴加冰浴冷却的
O.OlM 6M亚硝酸钠水溶液，混匀，使亚硝酸钠与对氨基苯磺酸的物质的量之比为(O. 01 2) :1，冰浴10 30min，得偶氮盐储备液，储存待用；c.将丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液中，获得质量体积比浓度为I 20%的丝素蛋白溶液，添加上述偶氮盐储备液O. 01 2mL/100mg丝素蛋白，用柠檬酸缓冲液维持pH在7. 5 10，冰浴反应10 20min，透析、冷
冻干燥得磺酸化丝素蛋白。所述柠檬酸盐缓冲溶液为O. 05 O. 2M, pH 8 10。有益效果I.本发明首次采用偶氮盐法对丝素蛋白进行磺酸化修饰，反应迅速，反应效率高，鉴别容易且手段多样，对生物材料的开发利用具有十分重要的意义。2.本发明的制备产物不仅是一种具有较好抗凝血的材料，而且具有较少的免疫原性，可以明显改善丝素蛋白与细胞和生长因子的粘附、扩散和增殖能力的生物活性材料，丰富生物材料的种类，为其在血管、韧带、骨等组织工程应用提供依据。
图I丝素蛋白磺酸化修饰原理图；图2丝素蛋白溶液(a)和磺酸化丝素蛋白溶液(b)；图3磺酸化丝素蛋白紫外全波长扫描；图4丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白FTIR比较；图5丝素蛋白修饰前后免疫原性比较。
具体实施例方式实施例I将2mL O. 4M对氨基苯磺酸水溶液与ImL I. 6M对甲苯磺酸水溶液混合并，对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :2，保持温度在5°C。向步骤I混合液中添加ImL O. 8M冰浴亚硝酸钠水溶液，混匀，维持冰浴15min，得到偶氮盐反应液。将O. 8g丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液(O. 05M pH 8)中，获得浓度为10%(w/V, g/mL)的丝素蛋白溶液8mL,添加16mL的偶氮盐反应液(2mL/100mg丝素蛋白)，用朽1檬酸缓冲液维持pH在8，冰浴反应20min，利用截留分子量为3500的透析袋透析2 3d，冷冻干燥，得磺酸化丝素蛋白。实施例2将IOmL O. 08M对氨基苯磺酸水溶液与4mL I. 6M对甲苯磺酸水溶液混合并，对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :8，保持温度在0°C。向步骤I混合液中添加1. 6mL IM冰浴亚硝酸钠水溶液，混匀，冰浴维持30min，得到偶氮盐反应液。将O. 8g丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液(O. 05M pH 8)中，获得浓度为20%(w/v, g/mL)的丝素蛋白溶液4mL,添加O. 08mL的偶氮盐反应液(O. OImL/1OOmg丝素蛋白)，用柠檬酸缓冲液维持pH在10，冰浴反应15min，利用截留分子量为3500的透析袋透析2 3d，冷冻干燥，得磺酸化丝素蛋白。实施例3将IOOmL ImM对氨基苯磺酸水溶液与40mL O. OlM对甲苯磺酸水溶液混合并冰浴冷却，对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :4，保持温度在2°C。
向步骤I混合液中添加0.0017mL 6M冰浴亚硝酸钠水溶液，混匀，冰浴维持20min，
得到偶氮盐反应液。将O. Ig丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液(O. 05M pH 8)中，获得浓度为1% (w/V, g/mL)的丝素蛋白溶液IOmL,添加ImL的偶氮盐反应液(lmL/100mg丝素蛋白)，用朽1檬酸缓冲液维持pH在9，冰浴反应lOmin，利用截留分子量为3500的透析袋透析2 3d，冷冻干燥，得磺酸化丝素蛋白。实施例4
本实施例产率高于其它实施例，将4mL O. 125M对氨基苯磺酸水溶液与4mL O. 5M对甲苯磺酸水溶液混合并，对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :4，保持温度在(TC。 向步骤I混合液中添加O. 125mL 2M冰浴亚硝酸钠水溶液，混匀，冰浴维持30min，
得到偶氮盐反应液。将O. 5g丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液(O. 05M pH 8)中，获得浓度为15%(w/V, g/mL)的丝素蛋白溶液IOmL,添加2. 5mL的偶氮盐反应液(O. 5mL/100mg丝素蛋白),用朽1檬酸缓冲液维持PH在10，冰浴反应15min，利用截留分子量为3500的透析袋透析2 3d，冷冻干燥，得磺酸化丝素蛋白。丝素蛋白中酪氨酸修饰百分率在实施例5将4mL O. 333M对氨基苯磺酸水溶液与ImL 4M对甲苯磺酸水溶液混合，对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :3，保持温度在4°C。向步骤I混合液中添加O. 5mL 4M冰浴亚硝酸钠水溶液，混匀，冰浴维持25min，得到偶氮盐反应液。将I. 8g丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液(O. 05M pH 10)中，获得浓度为15%(w/v, g/mL)的丝素蛋白溶液12mL,添加27mL的偶氮盐反应液(I. 5mL/100mg丝素蛋白)，用柠檬酸缓冲液维持PH在8，冰浴反应lOmin，利用截留分子量为3500的透析袋透析2 3d，冷冻干燥，得磺酸化丝素蛋白。丝素蛋白的修饰原理如图I。修饰前后丝素蛋白溶液由无色变成紫红色，这是由于在反应过程中形成偶氮盐，偶氮盐显色产生的，如图2 ;经紫外分光光度计全波长扫描发现，丝素蛋白仅在275nm处有蛋白吸收峰，而磺酸化丝素蛋白不仅具有蛋白吸收峰，在325nm存在偶氮盐吸收峰，同时在395nm处还存在一个肩峰，如图3 ;红外比较修饰先后发现丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白都具备典型的酰胺I、酰胺II和酰胺III的蛋白二级结构特征吸收峰，说明对丝素蛋白进行磺酸化修饰未影响蛋白质的二级结构。进一步研究发现磺酸化丝素蛋白的谱图在lC^OcnT1和lOlOcnT1为苯磺酸中SO2对称吸收峰，在IHOcnT1出为SO2反对称吸收峰，结果，如图4。通过上述三种方法均可以鉴别磺酸化丝素蛋白的生成，检测方法快速便捷。比较丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白的免疫原性。(I)颈椎脱臼法处死小鼠，置于75%的酒精中对其表面进行消毒，取出置于托盘中，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，找到脾脏，另取一无菌剪刀和镊子，剪下脾脏，放入无菌培养皿中。(2)在另一培养皿中加入Hank’s液3mL，用镊子取一块铜网，将脾脏置于铜网上，取一支无菌试管用底部研磨，制成细胞悬液，倒入离心管中。加适量Tris-NH4Cl (O. 17mol/L Tris,O. 16mol/L NH4Cl,两者的水溶液按体积I 9混匀，10% HCl调pH为7. 2)溶解红细胞，离心1500rpm，7min,弃去上清，加入培养液，混匀。移取20 μ L细胞悬液置于EP管中，再加入20 μ L台盼蓝染液，混匀，吸取部分混合液用血球计数板计数，并调其浓度为I X IOVmL的脾细胞悬液。(3)取EP管4支,将丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白液稀释至500 μ g/mL, 250 μ g/mL,125 μ g/mL, 67. 5 μ g/mL,分别置于上述管中，每管O. lmL。(4)细胞悬液与蛋白溶液混合向上述管中各加入细胞悬液O. 9mL，使得混合液中的蛋白浓度为50 μ g/mL,25 μ g/mL, 12. 5 μ g/mL, 6. 75 μ g/mL,细胞浓度为9 X 105/mL。另取一管将细胞悬液与培养液以9 1的体积比例混合，作阴性对照。(5)将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中，每孔O. ImL,每个浓度4个平行孔。 (6)将培养板放入含有5% CO2的37°C培养箱中培养44小时后取出，吸出培养液，向每孔中加入MTT溶液10 μ L，继续培养6小时。(7)各孔内加入二甲亚砜IOOuL/孔,振荡5min后,用酶标测定仪测OD值,测定波长 578nm。结果如图5所示，表明丝素蛋白经磺酸化修饰后，免疫原性仍很低，与丝素蛋白相近，可以作为生物材料的原料使用。
权利要求
1.磺酸化丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于步骤为a.偶氮盐储备液的配制将ImM O. 4M对氨基苯磺酸溶液滴加到O. OlM 4M对甲基苯磺酸溶液，使对氨基苯磺酸与对甲基苯磺酸的摩尔比为I :(2 8)，保持温度在O 5°C;b.向步骤a混合液中滴加冰浴冷却的O. OlM 6M亚硝酸钠水溶液，混匀，使亚硝酸钠与对氨基苯磺酸的物质的量之比为(O. 01 2) :1，冰浴10 30min，得偶氮盐储备液，储存待用；c.将丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液中，获得质量体积比浓度为I 20%的丝素蛋白溶液，添加上述偶氮盐储备液O. 01 2mL/100mg丝素蛋白，用柠檬酸缓冲液维持pH在7. 5 10，冰浴反应10 20min，透析、冷冻干燥得磺酸化丝素蛋白。
2.根据权利要求I所述的磺酸化丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于所述柠檬酸盐缓冲溶液为O. 05 O. 2M, pH 8 10。
全文摘要
磺酸化丝素蛋白材料的制备方法，步骤为a.偶氮盐储备液的配制；b.向步骤a混合液中滴加冰浴冷却的亚硝酸钠水溶液，混匀冰浴，得偶氮盐储备液；c.将丝素蛋白溶解在柠檬酸盐缓冲溶液中，获得丝素蛋白溶液，添加上述偶氮盐储备液，用柠檬酸缓冲液维持pH在7.5～10，冰浴反应，透析、冷冻干燥得磺酸化丝素蛋白。本发明的制备产物不仅是一种具有较好抗凝血的材料，而且具有较少的免疫原性，可以明显改善丝素蛋白与细胞和生长因子的粘附、扩散和增殖能力的生物活性材料，丰富生物材料的种类，为其在血管、韧带、骨等组织工程应用提供依据。
文档编号A61L33/12GK102827376SQ201210330440
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者颜辉, 李绍群, 唐玉斌, 江明珠, 贾俊强, 吴琼英 申请人:江苏科技大学