技术领域
本发明涉及一种基因药物，尤其涉及人类DCX基因在制备胶质瘤放疗增敏剂中的应用。
背景技术：
胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。胶质瘤在发生之初，通常没有典型的症状。随着肿瘤的不断增大，会表现出如下症状：一是颅内压增高和其他一般症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等。另一是脑组织受肿瘤的压迫、浸润、破坏所产生的局部症状，局部症状依肿瘤生长位置不同而异。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发。
基因治疗的研究已经走过了10年余的历程，其研究发展迅速，但大多数的研究均集中于对缺陷基因的修正和导入，如：抑癌基因治疗、抗血管生成基因治疗、自杀基因治疗、免疫基因治疗、修饰基因治疗等。由于基因导入技术尚未突破，以及肿瘤为复杂的多基因疾病，仅依靠某一种基因治疗方法似难于奏效等原因，肿瘤的基因治疗一直未能成为临床常规的治疗手段。
近年来，人们开始探索如何利用肿瘤细胞与正常细胞内基因状态的不同，通过对某些病毒的改造，使其能特异性地在某些基因异常的肿瘤细胞中生长，研究较多的病毒即是腺病毒。目前对腺病毒的基因结构与功能研究得比较清楚，腺病毒具有可装入基因的容量较大；转染范围广、转染率较高，所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力；不整合到靶细胞基因组，无插入突变，无致癌性，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害；可以复制出滴度高、稳定性好、基因转移效率高的病毒；很容易进行临床应用规模的商业化生产，其病毒储藏及运送条件均十分清楚等优点。
因此，寻求利用腺病毒装载基因对胶质瘤的放疗进行增敏，是本发明希望解决的问题。
技术实现要素：
本发明的发明目的是提供一种人类DCX基因的新用途，解决胶质瘤对放疗不敏感的问题。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：人类DCX基因在制备胶质瘤放疗增敏剂中的应用。
具体地，通过构建DCX基因表达重组腺病毒载体，由重组腺病毒对胶质瘤细胞进行感染，增加G2期细胞的比例，以提高胶质瘤细胞的放射敏感性。
所述重组腺病毒载体的构建方法是：
(1)针对人类DCX基因序列，制备PCR引物，所述PCR引物由
正义引物GCAAGATCTATGAAAACACTCCCCCTTC和
反义引物TAAGGTACCTTACATGGAATCACCAAGCG构成，在DCX两端分别引入BglII和KpnI酶切位点，扩增得到DCX目的片段；
(2)双酶切DCX目的片段和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜,连接产物转化DH5α大肠杆菌,构建单基因重组转移质粒载体pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter；
(3)将构建的单基因重组转移质粒载体用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用PacI单酶切鉴定并转化DH5α大肠杆菌；
(4)将成功重组的pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter在DH5α大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用脂质体2000（lipofectamine2000）转染293A细胞；
(5)在半数细胞脱壁后，收获细胞和上清液，反复冻融3次，获得腺病毒Ad-GFP,Ad-DCX。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明提供了人类DCX基因的新应用，能够有效提高胶质瘤的放射敏感性。
附图说明
图1是本发明实施例中的单基因连接方式示意图；
图2是腺病毒构建及包装示意图；
图3是实施例中PCR产物琼脂糖电泳图；
图4是实施例中PacI单酶切鉴定pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter；
图5是实施例中RT-PCR鉴定Ad-DCX的表达；
图6是实施例中重组腺病毒体外感染U251细胞荧光表达情况；
图7是实施例中腺病毒感染后GFP阳性细胞的比例；
图8是实施例中重组腺病毒对U251生长的影响；
图9是实施例中重组腺病毒感染后照射对U251生长的影响；
图10是实施例中重组腺病毒对U251细胞周期的影响；
图11实施例中重组腺病毒感染后照射对U251细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：
一、DCX单基因表达重组腺病毒载体的构建
1.技术流程
(1)针对DCX设计引物（表1），在DCX两端分别引入BglII和KpnI酶切位点，以人cDNA文库为模板，在Phusion高保真DNA聚合酶的作用下扩增得到DCX目的片段，并进行琼脂糖电泳鉴定。
表1.PCR引物
(2)双酶切目的基因PCR产物和pAdTrack-CMV-polyA-promoter空载体转移质粒，用T4DNA连接酶将其4℃连接过夜（连接方式见图1）。连接产物转化DH5α大肠杆菌，用LB琼脂平板（含50μg/ml卡那霉素）筛选抗性克隆。在DNA序列测定后，将阳性克隆保种备用。构建的单基因重组转移质粒载体为pAdTrack-CMV-DCX-polyA+promoter。
(3)将构建的单基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒共转化BJ5183大肠杆菌，用LB琼脂平板（含50μg/ml卡那霉素）筛选抗性克隆。用PacI单酶切鉴定并转化DH5α大肠杆菌。
(4)将成功重组的pAd-polyA+promoter、pAd-DCX-polyA+promoter在DH5α大肠杆菌扩增抽提，PacI酶切线性化后用lipofectamine2000（脂质体2000）转染293A细胞，2周后观察细胞形态变化，腺病毒构建及包装总体步骤如图2所示，所得腺病毒命名为Ad-GFP,Ad-DCX。
(5)在半数细胞脱壁后，收获细胞和上清液，反复冻融3次，释放腺病毒Ad-GFP,Ad-DCX。将获得的病毒再感染293A细胞，抽提总RNA进行RT-PCR鉴定DCX基因的表达。
2.实验结果
(1)引入限制性酶切位点的PCR产物的琼脂糖电泳如图3所示，DCX为1326bp。
(2)重组Ad-GFP,Ad-DCX用PacI单酶切后，琼脂糖电泳鉴定抗卡那霉素小片段（4.5kb）的释放，如图4所示。
(3)转染293A细胞2周后出现细胞空斑，收获腺病毒Ad-GFP、Ad-DCX，再次感染293A细胞，观察细胞病变情况，RT-PCR检测DCX基因的表达，PCR产物如图5所示，可见Ad-DCX感染的细胞中DCX的表达水平显著提高。
实验结果表明成功构建了DCX单基因表达的重组腺病毒，获得的腺病毒Ad-DCX具有感染细胞的能力，并且显著提高了感染细胞中DCX的表达水平。
二、构建的DCX单基因功能
（一）实验方法
1重组腺病毒的大量扩增
将第一部分构建获得的pAd-polyA+promoter(以下简称为Ad-GFP)、pAd-DCX-polyA+promoter(以下简称Ad-DCX)腺病毒再分别多轮感染QBI-293A细胞中进行大量繁殖，待出现细胞病变效应明显，荧光显著增强时，收集细胞并反复冻融3次，2000r/min离心5min，取病毒上清，于-80℃保存。
2.重组腺病毒的效价检测
将对数生长期的QBI-293A细胞胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105个/mL，在96孔板上按每孔100μL接种细胞，培养24h后，将上述获得的Ad-GFP、Ad-DCX重组腺病毒作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11稀释后，每个稀释度按每孔100μL接种3孔，37℃，5%CO2细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，按病毒效价(pfu/mL)=（每孔荧光数×10）/稀释度公式计算腺病毒效价。
3.重组腺病毒对胶质瘤细胞的感染效率
将经0.25%胰酶消化分散的人脑胶质瘤细胞U251用10%FBSDMEM完全培养基悬浮，计数后调整细胞浓度为1×105个/ml，每孔100μL接种于96孔培养板，37℃，5%CO2培养过夜。次日Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒体外分别以1、5、10、25、50、75、100MOI不同剂量感染胶质瘤细胞，各分为3组：细胞对照组、空载体Ad-GFP组、单基因Ad-DCX组感染24h后在荧光显微镜下观察细胞中GFP绿色荧光表达情况，以判断重组腺病毒不同感染剂量对胶质瘤细胞的感染效率，旨在筛选最佳感染剂量进行重组腺病毒感染。
4.流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例
将U251脑胶质瘤细胞每孔100万接种于六孔板中，37℃，5%CO2培养过夜。次日Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒体外分别以20MOI不同剂量感染胶质瘤细胞，感染24h后，收集细胞后上流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。
5.重组腺病毒对胶质瘤细胞生长的影响
将处于对数生长期的U251细胞用0.25%胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数调整细胞浓度为3×104个/ml，每孔100μL接种于96孔板，待细胞贴壁后，将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI剂量感染细胞，每组均设5个平行孔。37℃，5%CO2培养箱中培养，培养若干天，每孔加入20μLMTT（5mg/mL），37℃继续培养4h后在加入DMSO150μL/孔，于37℃充分溶解后，在酶标仪570nm下测定吸光值（OD值），以OD值为纵坐标，天数为横坐标绘制细胞生长活力图。
6.重组腺病毒感染后对照射后U251细胞生长的影响
将处于对数生长期的U251细胞用0.25%胰酶消化后，用完全培养基悬浮制成单细胞悬液，计数调整细胞浓度为5×104个/ml，每孔100μL接种于96孔板，待细胞贴壁后，将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI剂量感染U251细胞后48h进行X射线照射（4、8Gy），MTT检测2天后细胞的生长活力。
7.细胞周期分析
取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每组三个平行样，60mm培养皿中培养过夜，隔日将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI剂量感染细胞，继续培养48h后检测细胞周期分布。各组细胞用胰酶消化，制备单细胞悬液，1000rpm，5min离心，弃上清，PBS洗2次以去除细胞碎片，200μLPBS重悬细胞，缓慢加入70％冷乙醇2mL，吹打均匀，4℃固定过夜，1000rpm，5min离心，弃上清，PBS洗2遍，加20μg/mLRNase37℃水浴消化30min，再以20μg/mL的PI（碘化丙啶）染色液置4℃避光染30min，上机检测。
8、照射后细胞凋亡检测
取对数生长期细胞制成单细胞悬液，每组三个平行样，隔日将Ad-GFP空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI剂量感染细胞，48h后对各组细胞进行X射线照射（8Gy）。继续培养48h后细胞用0.25%胰酶消化并收集，制备单细胞悬液，1000rpm，5min离心，弃上清，预冷的PBS洗2次，重悬细胞于1×BindingBuffer中，调整细胞浓度为1×106/mL,取100μL的细胞悬液分别加入5μLPEAnnexinV和5μL7-AAD.室温避光作用15min,加入400μL1×BindingBuffer,1h内上机检测细胞凋亡率。
（二）实验结果
1高效价腺病毒的获得
Ad-GFP、Ad-DCX腺病毒粗提液经过多轮感染293A细胞和扩增后，获得了高滴度和高纯度的Ad-GFP、Ad-DCX腺病毒，其效价分别为：109；109（pfu/ml）。
2.激光共聚焦显微镜观察重组腺病毒体外感染U251细胞荧光表达情况
将Ad-GFP、Ad-DCX腺病毒分别以1，5，10，20，50，100，200MOI不同剂量感染U251细胞。感染24h后，在激光共聚焦显微镜下观察空载腺病毒和不同剂量Ad-DCX腺病毒对U251细胞的感染情况。结果显示（图6）在20MOI时，U251细胞中GFP表达的细胞可达95%以上，故20MOI为这几种腺病毒的最佳感染剂量。
3.流式细胞仪检测腺病毒感染后GFP阳性细胞的比例
流式细胞仪检测显示空白对照组、空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI的剂量感染U251细胞后，表达GFP的细胞比例分别为1.49%，98.81%，99.52%。如图7所示。
4.重组腺病毒对U251细胞生长的影响
空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI的剂量感染U251细胞后，MTT检测0-6天细胞的生长活力，并绘制细胞生长曲线，由图8可见，Ad-DCX在20MOI有明显的抑制作用，与空白对照组和Ad-GFP组比较呈显著性差异（P<0.05）。
5.重组腺病毒感染后对照射后U251细胞生长的影响
空载体腺病毒和Ad-DCX单基因重组腺病毒以20MOI的剂量感染U251细胞后48h进行X射线照射（4、8Gy），MTT检测2天后细胞的生长活力，由图9可见，Ad-DCX组在照射后对细胞的抑制作用随照射剂量增加而更为明显，并且Ad-DCX组与空白对照组和Ad-GFP组比较呈显著性差异（P<0.05）。
6.重组腺病毒对U251细胞周期的影响
用流式细胞仪分析了重组腺病毒感染后细胞周期分布的变化。结果显示（图10）：Ad-DCX感染U251细胞后出现了G2期细胞比例的增加（即G2期阻滞的出现）（p<0.05），G2期细胞的比例达到19.043%，与空白对照（G2期细胞比例10.984%）和Ad-GFP组（G2期细胞比例11.296%）相比有显著差异，具有统计学意义（p<0.05），G2-M期放射敏感性最高，故增加DCX基因的表达能够显著增加胶质瘤细胞的放射敏感性，提高治疗效果。
7.重组腺病毒感染后照射对U251细胞凋亡的影响
检测重组腺病毒感染后细胞辐照前后细胞凋亡的情况。结果表明（图11），8Gy照后48h时细胞的凋亡率均较0Gy组增加。而且，感染了Ad-DCX重组腺病毒的细胞凋亡率显著高于空白对照组和空载腺病毒组（p<0.01），表明增加DCX表达可提高辐射诱导的U-87MG细胞凋亡。
本实施例应用人脑胶质瘤U251细胞，通过增加DCX基因表达联合放疗的体外实验，探讨对脑胶质瘤生长转移、细胞周期的影响及作用机制。
用流式细胞仪分析了重组腺病毒感染后细胞周期分布的变化。结果显示：Ad-DCX感染U251细胞后出现了G2期细胞比例的增加（p<0.05），G2期细胞的比例达到19.043%，与空白对照（G2期细胞比例10.984%）和Ad-GFP组（G2期细胞比例11.296%）相比有显著差异，具有统计学意义（p<0.05），G2-M期放射敏感性最高，故增加DCX基因的表达能够显著增加胶质瘤细胞的放射敏感性，提高治疗效果。