专利名称：用于基因传递的具有增强内吞作用的表面的全氟化碳纳米乳液的制作方法
技术领域：
本发明在于提供稳定的适合用于基因传递的全氟化碳纳米乳液、其制备和应用。
背景技术：
常规的寡核苷酸和近年来的短干扰RNA是有希望用于基因传递的并被广泛使用的物质。至今，将该遗传物质应用于活体动物的可能性是非常有限的。对于遗传物质的递送，全氟化碳(PFC)乳液成功地用作氧转运体，因此这些乳液是一种有前途的工具(Daugherty, W. P.,等，Neurosurgery54:1223-1230 (2004) ; Ries s, J. G. , Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 33:47-63 (2005))。在气管内应用后，常规的全氟化碳乳液可以将药物运输至肺(Dickson, E. W.等，Acad. Emerg.Med. 10:1019-1023(2003)) ο此外，PFC乳液具有通过呼气安全清除的优势(Putyatina，T.K.等，Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 22:1281-1285(1994))。因此，全氟化碳可以作为用于将遗传物质递送至活体动物的有效和安全的工具而发挥作用。由于其作为氧转运体的功能，常规的PFC-乳液具有的尺寸阻止其离开血管床并且因此上述乳液将不能够将物质转运至活生物体的细胞中。过去几年中，已经提出了几种不太有效的转运系统，例如，结合胆固醇或由载脂蛋白 A 介导至肝内的转运体(Kim, S. I.等，A-I. Mol. Ther. 15:1145-1152(2007))。EP-B-0788347公开了平均直径为至多IOnm的含有水滴的油包水氟碳化合物乳液的制备。将氟化的表面活性剂或含有至少一种氟化的表面活性剂的表面活性剂混合物用作乳化剂。EP-A-1844772公开了一种用于以寡核苷酸转染细胞的组合物，其中乳化剂是具有C10-C36烃或氟碳链的咪唑鎗衍生物。EP-B-00831770公开了含有携带药物活性化合物的不连续相的氟化化合物的连续微分散体。US 2004/0115159公开了一种水包油纳米乳液，其由表面活性物质的三元体系组成，适合作为用于化妆品和药剂的转运剂。此三元体系含有阴离子、阳离子和两亲性表面活性剂。US 7211248公开了用DNA转染肝细胞的方法，其中超声造影剂补充以带有质粒DNA的蛋白稳定微粒。转染通过肝细胞的超声作用来实现。US 2007/0184076公开了一种纳米液滴混合物，其由氟碳化合物和例如抗癌剂的治疗活性物质的生物学可接受的油混合物组成。US 2006/0013820公开了一种组合物，其含有多种氟碳化合物、适合作为治疗剂的抗原和任选地含有其他的药物载体。该组合物据说适合作为疫苗，尤其用于治疗HIV。
WO 96/40057、WO 96/40053和EP-A-1306083公开了作为治疗活性物质的载体的
稳定的全氟化碳(纳米)乳液。US 6071890公开了在体内负载DNA和RNA的转运体和还负载生物学活性化合物的两亲性阳离子物质。这些物质与类固醇结合。WO 01/722812公开了一种作为转染剂的微粒，其含有聚合物质、生物学活性治疗因子和脂蛋白。仍然需要用于在生物体中基因传递的可靠的转运载体。发明的概述·目前发现具有增强内吞作用的表面的全氟化碳纳米乳液、特别是含有作为乳化剂的磷脂的具有增强内吞作用的表面的全氟化碳纳米乳液，适合于在体内施用遗传物质。添加为纳米乳液提供增强内吞作用的表面的分子，显著地增加细胞对全氟化碳纳米乳液的摄取。因此，本发明在于提供(I) 一种稳定的具有增强内吞作用的表面的全氟化碳纳米乳液；(2)上述(I)的优选实施方式，其中上述纳米乳液具有连续的全氟化碳相和缓冲的不连续水相，并且含有(a)全氟化碳组分，其含有至少一种全氟化碳化合物；(b)乳化组分；和(C)增强内吞作用的组分，其含有至少一种通过内吞作用诱导细胞摄取上述纳米乳液的化合物；(3) 一种含有上述⑴或(2)中所定义的纳米乳液的基因传递剂或药物组合物，(4) 一种制备上述(I)或(2)上述的纳米乳液或上述(3)上述的基因传递剂或药物组合物的方法,上述方法包括如下步骤(a)制备含有上述乳化组分的缓冲的水溶液，(b)加入上述全氟化碳组分，和(c)随后通过高压匀化机混合和匀化步骤(b)的反应产物；(5)上述(I)或(2)中所定义的纳米乳液在制备用于将遗传物质传递至患者的药物中的应用；(6) 一种将遗传物质传递至患者的方法，该方法包括向上述患者施用上述(I)或
(2)中所定义的纳米乳液或上述(3)中所定义的基因传递剂或药物组合物；以及(7) 一种用于在体外将亲水化合物传递至细胞的方法，该方法包括将上述细胞与上述(I)或(2)中所定义的纳米乳液接触或与上述(3)中所定义的基因传递剂接触。
图I表示加热装置的温度廓线和以5只麻醉小鼠的标准差作出的平均体温。图2表示在冷却过程(对照)中的以5只麻醉小鼠的标准差作出的平均动脉血压。图3表示在施用ACE抑制剂卡托普利(n=5，10mg/kg卡托普利)后6 7小时的平均动脉血压(土SD)(灰点=对照值，黑点=实际值)。图4表示在施用带有血管紧张素原siRNA的纳米载体(n=5, 300 μ I纳米载体，60 μ g Agt siRNA,表面由Fortecortin保护的转铁蛋白)后24小时的平均动脉血压(土SD)，灰点=对照值，黑点=实际值。图5表示在2秒“流体动力学转染”内注射施用不含纳米载体血管紧张素原siRNA(n=5,60y g Agt siRNA)后24小时的平均动脉血压(土SD)，灰点=对照值，黑点=实际值。图6表示使用不完全纳米载体施用血管紧张素原siRNA后24小时的平均动脉血压(土SD)，上述纳米载体的表面不含增强内吞作用的蛋白转铁蛋白(η=5，300μ1纳米载体，60yg Agt siRNA,表面无转铁蛋白，加入Fortecortin),灰点=对照值,黑点=实际值。图7表示使用纳米载体施用非编码siRNA后24小时的平均动脉血压(土SD) (n=5,300 μ I纳米载体,60 μ gAgt siRNA,表面由Fortecortin保护的转铁蛋白)，灰点=对照
值，黑点=实际值。图8表示在仅施用纳米载体后24小时的平均动脉血压(土 SD) (n=5, 300 μ I纳米载体，60 μ gAgt siRNA,表面由Fortecortin保护的转铁蛋白)，灰点=对照值，黑点=实际值。图9表示纳米载体的粒子的电子显微镜图像。该粒子具有约50纳米的大小。图10显示处于46. 000倍放大下的肝细胞。在静脉内注射含有siRNA的纳米载体后30分钟将肝脏切除。箭头标记了在受体介导的内吞作用后含有负载有siRNA的纳米载体的粒子的内涵体。膜和细胞表面旁粒子周围的自由空间表明摄取通过受体介导的内吞作用发生。图11显示处于50. 000倍放大下的肝细胞的电子显微镜图像。在静脉内施用纳米载体和siRNA后2小时，将肝脏切除。可以看到含有深色结构的纳米载体的圆形囊泡，其周围没有膜。不像图10的图像中的纳米载体囊泡，这些粒子没有被膜覆盖。很显然，所有可看见的纳米载体均释放至细胞液中。图12表示图10中显示的电子显微镜切片的放大细节。在175. 000倍放大倍数下，显示释放至细胞质中的负载有siRNA的纳米载体的粒子。在图10和11中也可以看到的粒子内的深色结构对应于含有的siRNA。图13显示处于50. 000倍放大下的肝细胞的电子显微镜图像。在静脉内注射后4小时，将动物处死并提取肝脏。在此时间点，纳米载体不再含有图10 12中可见到的深色结构。非常有可能由上述纳米载体递送的siRNA释放至细胞质中。
具体实施例方式本发明的方面⑴或⑵的稳定的全氟化碳纳米乳液(此后简称为“本发明的纳米乳液”)具有连续的全氟化碳相和缓冲的不连续的水相。优选缓冲的水相占纳米乳液的25 60重量％。用于水相的适当的缓冲液包括磷酸盐缓冲液,例如磷酸二氢钠。本发明的纳米乳液是指其具有低于IOOnm的粒度的纳米乳液。优选本发明的纳米乳液由具有约50nm的平均粒度的粒子组成。本发明的纳米乳液包括含有至少一种全氟化碳化合物的全氟化碳组分(a)、优选地含有磷脂作为基本乳化化合物并且还含有辅助脂质的乳化组分(b)、和含有至少一种诱导细胞摄取纳米乳液的化合物的增强内吞作用的组分(C)。组分(a)的至少一种全氟化碳化合物优选选自具有结构CmF2m+1X、XCmF2mX,XCnF2n0CoF2oX> N(C0F20X) 3和N(C0F2o+i) 3的化合物(其中m是3 10的整数，η和ο是I 5的整数，并且X每次出现独立地选自Cl、Br和I)。组分(a)可以含有上述全氟化碳化合物的混合物。特别优选全氟化碳化合物是全氟溴辛烷、全氟三丁胺和它们的混合物。乳化组分(b )可以包括本领域中已知的多种乳化化合物，特别是在介绍中引用的参考文献中公开的乳化化合物。优选的乳化化合物是磷脂，甚至如上面所给出的，特别优选磷脂是乳化组分(b)的基本乳化化合物。因此，乳化组分(b)优选包括至少一种通式I所示的磷脂化合物或其药理学可接受的盐
权利要求
1.一种稳定的具有增强内吞作用的表面的全氟化碳纳米乳液，含有 (i)全氟化碳组分，其含有至少一种全氟化碳化合物； (ii)乳化组分；和 (iii)转铁蛋白或其片段或衍生物作为增强内吞作用的组分，其诱导细胞通过内吞作用摄取所述纳米乳液， 并且所述全氟化碳纳米乳液通过包括以下步骤的方法获得 (a)制备含有乳化组分的缓冲的水溶液， (b)加入所述全氟化碳组分， (C)随后混合、高压匀化步骤(b)的反应产物，和 (d)向步骤(C)的反应产物中加入增强内吞作用的组分，并匀化所得的混合物。
2.如权利要求I所述的纳米乳液，其特征在于 具有小于IOOnm的粒度,优选所述纳米乳液由具有约50nm的平均粒度的粒子组成。
3.如权利要求I或2所述的纳米乳液，其特征在于 所述缓冲的水相占所述纳米乳液的25 60重量％。
4.如权利要求I 3中任一项所述的纳米乳液，其特征在于 所述增强内吞作用的组分为转铁蛋白。
5.如权利要求I 4中任一项所述的纳米乳液，其特征在于 所述至少一种全氟化碳化合物选自CmF2m+1X、XCmF2mX, XCnF2nOC0F20X, N (C0F20X) 3和N(CtjF2M)3，其中，m是3 10的整数，11和O是I 5的整数，并且X每次出现独立地选自CUBr和I，优选所述全氟化碳选自全氟溴辛烷、全氟三丁胺和它们的混合物。
6.如权利要求I 5中任一项所述的纳米乳液，其特征在于 所述乳化组分含有作为基本乳化组分的至少一种磷脂和一种或多种辅助脂质。
7.如权利要求6所述的纳米乳液，其特征在于 所述至少一种磷脂选自通式I所示的化合物或其药理学可接受的盐，
8.如权利要求7所述的纳米乳液，其特征在于 所述磷脂组分选自磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及其混合物。
9.如权利要求6 8中任一项所述的纳米乳液，其特征在于所述辅助脂质选自脂肪酸、类固醇、维生素及其混合物。
10.如权利要求I 9中任一项所述的纳米乳液，其特征在于 含有作为全氟化碳组分(a)的全氟溴辛烷、包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂、胆固醇和溶血磷脂酰胆碱作为磷脂的乳化组分(b)和作为所述增强内吞作用的组分(C)的转铁蛋白。
11.如权利要求I 10中任一项所述的纳米乳液，其特征在于 适合于在体内和体外将包括药物和遗传物质的亲水化合物传递至细胞，优选所述纳米乳液适合于传递选自RNAjP DNA序列以及它们的组合和衍生物的遗传物质，最优选传递miRNA、siRNA 或 dsRNA。
12.—种基因传递剂或药物组合物，其特征在干 含有权利要求I 11中任一项所述的纳米乳液。
13.如权利要求12所述的基因传递剂或药物组合物，其特征在于 还含有在体内和体外传递至细胞的药物和遗传物质，优选所述基因传递剂或药物组合物包括选自RNAdP DNA序列以及它们的组合和衍生物的遗传物质，最优选包括miRNA、siRNA 或 dsRNA。
14.ー种制备权利要求I 11所述的纳米乳液或权利要求12或13所述的基因传递剂或药物组合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (a)制备含有乳化组分的缓冲的水溶液， (b)加入所述全氟化碳组分，和 (c)随后混合、高压匀化步骤(b)的反应产物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括 (d)向步骤(C)的反应产物中加入用于传递的增强内吞作用的组分和/或亲水化合物，并匀化所得的混合物。
16.一种用于在体外将亲水化合物传递至细胞的方法，其特征在于包括将所述细胞与权利要求I 11所述的纳米乳液接触或与权利要求12或13所述的基因传递剂接触。
17.权利要求I 11所述的纳米乳液在制备用于将药物和遗传物质传递至患者的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供稳定的适合用于基因传递的全氟化碳纳米乳液、其制备和应用，该全氟化碳纳米乳液具有增强内吞作用的表面。
文档编号A61K48/00GK102847170SQ201210345209
公开日2013年1月2日 申请日期2009年5月13日 优先权日2008年5月19日
发明者S.施赖伯 申请人:塞尔闻缇斯集团