新siRNA结构的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有新序列和结构基序的siRNA化合物，所述siRNA化合物下调特定人类基因的表达。本发明还涉及包含此类化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供了治疗和/或预防与所述基因相关的各种疾病或病症和/或与此类疾病或病症相关的症状的发病率或严重程度的方法，所述方法包括给需要治疗此类疾病或病症和/或症状的受试者施用治疗有效剂量的该化合物或所述药物组合物从而治疗受试者。
【专利说明】新siRNA结构
[0001]本申请是申请日为2008年9月4日，申请号为200880110087.0，发明名称为“新siRNA结构”的申请的分案申请。
[0002]贯穿本申请引用了各种专利和科学出版物。这些出版物的公开内容以其整体在此通过引用并入本申请，以更完整地描述本发明所属领域的现有技术。
发明领域
[0003]本发明涉及新化合物、包含该化合物的药物组合物以及使用其抑制某些哺乳动物基因包括 TP53BP2、LRDD, CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RACl、RHOA 和 DUOXl 的方法。所述化合物和组合物因此在治疗其中基因表达具有不良后果的疾病或病症和/或与该疾病或病症相关的症状的受试者时是有用的。在具体实施方案中，本发明提供包含该化合物的组合物及其使用方法。本发明还提供在制备化学修饰的siRNA寡核苷酸中有用的新结构基序、包含它的组合物及其使用方法。
[0004]发明背景
[0005]siRNA 和 RNA 干扰
[0006]RNA干扰(RNAi)是涉及双链(ds) RNA-依赖的基因特异性转录后沉默的现象。由于存在响应于长链dsRNA分子激活的主动的、非特异性抗病毒防御机制，研究该现象和实验性操作哺乳动物细胞的最初尝试均以失败告终(Gil等人ApOptOSiS，2000.5:107-114)。随后发现21个核苷酸RNA的合成双链体可在哺乳动物细胞中介导基因特异性RNAi，而不刺激通用抗病毒防御机制。(参见Elbashir等人Nature 2001,411:494-498和Caplen等人PNAS USA 2001,98:9742-9747)。因此，小干扰RNA (siRNA)已成为尝试理解基因功能的有力工具。
[0007]RNA干扰(RNAi)在哺乳动物中是由小干扰RNA(siRNA) (Fire等人Nature 1998，391:806)或微小 RNA(miRNA)(Ambros, Nature 2004,431(7006):350-355 ；Bartel, Cell2004,116(2):281-97)介导的。在植物中相应的过程通常称为特异性转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并在真菌中也可称为压抑(quelling)。
[0008]siRNA是下调或沉默(阻止)其内源性(细胞内)对应物(counterpart)的基因/mRNA表达的双链RNA或修饰的RNA分子。RNA干扰的机制在下文详述。
[0009]若干研究显示siRNA疗法在哺乳动物和人类二者中都是有效的。Bitko等人表明当鼻内施用时，针对呼吸道合胞病毒(RSV)核壳体N基因的特异性siRNA分子有效治疗小鼠(Nat.Med.2005，11 (1):50-55)。讨论siRNA疗法的近期综述是可获得的(Barik等人 J.Mol.Med 2005，83:764-773 ;Dallas 和 Vlassov，Med.Sc1.Monitor 2006,12(4):RA67-74 ；Chakraborty, Current Drug Targets 2007,8(3):469-82 ;Dykxhoorn 等人 GeneTherapy 2006.13:541-552)。
[0010]Mucke(IDrugs 200710 (I):37-41)发表了目前疗法用于治疗眼部疾病例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼的综述，包括针对各种靶的siRNA。
[0011] SiRNA 结构[0012]与已知基因对应的siRNA的选择和合成已经被广泛报道；(参见例如U1-Tei等人 J Biomed Biotech.2006 ；2006:65052 ；Chalk 等人 BBRC.2004，319 (I):264-74 ；Sioud和 Leirdal，Met.Mol Biol.;2004，252:457-69 ;Levenkova 等人 Bioinform.2004，20 (3):430-2 ；U1-Tei 等人 NAR.2004，32 (3):936-48)。
[0013]修饰的siRNA的利用和制备的实例，参考例如，Braasch等人Biochem.2003，42(26):7967-75, Chiu 等人 RNA,2003,9(9):1034-48 ；PCT 公布 W02004/015107(atugenAG)和WO 02/44321 (Tuschl等人)。美国专利号5，898，031和6，107，094，教导了化学合成低聚物。美国专利公布号2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有交替基序的低聚化合物和具有化学修饰的核苷间键合的dsRNA化合物。
[0014]其他修饰已经公开。结果表明5'-磷酸部分的并入增强siRNA在果蝇胚胎中的活性(Boutla 等人 Curr.Biol.2001，11:1776-1780)和是人类 HeLa 细胞中 siRNA 功能所必需的(Schwarz 等人 Mol.Cell，2002，10:537-48)。Amarzguioui 等人(NAR，2003，31 (2):589-95)显示siRNA活性取决于Y -O-甲基修饰的位置。Holen等人(NAR.2003,31 (9):2401-07)报道了具有少数2' -O-甲基修饰核苷的siRNA与野生型相比产生高活性，但随着2' -O-甲基修饰的核苷数量的增加其活性降低。Chiu和Rana(RNA.2003,9 =1034-48)教导了相对于未修饰的siRNA，在有义链或反义链(完全修饰链)中并入2' -O-甲基修饰核苷的siRNA活性严重降低。据报道在反义链5'-末端放置2' -O甲基将严重限制其活性，而在反义链3'-末端和有义链的两个末端的放置则是耐受的(Czauderna等人NAR.2003，31 (11):2705-16 ;W02004/015107)。本发明提供的分子的优势在于其无毒性和可用于制备用于治疗各种疾病的药物组合物。
[0015]促凋亡某闵
[0016]促凋亡基因通 常定义为在凋亡性细胞死亡中起作用的基因。本发明中有用的促凋亡基因的非限制性列表如下:肿瘤蛋白P53结合蛋白2(TP53BP2);含有富含亮氨酸重复序列和死亡结构域(leucine-rich repeats and death domain containing, LRDD);细胞色素b-245，α多肽(CYBA，p22phoX);激活转录因子3 (ATF3);半胱天冬酶2，凋亡相关半胱氨酸肽酶(CASP2) ;NADPH 氧化酶 3 (N0X3) ；harakiri, BCL2 相互作用蛋白(HRK, BID3);补体成分l，q子成分结合蛋白(ClQBP) ;BCL2/腺病毒ElB 19kDa相互作用蛋白3 (BNIP3);丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，JNKI);丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14，p38) ；ras相关C3肉毒杆菌毒素底物I (Rho家族小GTP结合蛋白RAC1);糖原合酶激酶3 β (GSK3B);嘌呤能受体Ρ2Χ，配体门控离子通道7(P2RX7);瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员2 (TRPM2);聚(ADP-核糖)糖原水解酶(poly (ADP-ribose) glycohydrolase, PARG) ;CD38 分子(CD38)；STEAP家族成员4(STEAP4);骨形态发生蛋白2 (BMP2);间隙连接蛋白，al，43kDa(连接蛋白43，GJA1) ;TYR0蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP);结缔组织生长因子(CTGF);分泌磷蛋白I (骨桥蛋白，SPP1) ；ras同源物基因家族，成员A(RHOA)和双氧化酶I (DU0X1)。
[0017]转让给本发明受让人的PCT专利申请号PCT/IL2007/001278 (PCT公布号WO2008/050329)和美国序列号11/978,089涉及上述基因的抑制剂，并通过引用以其整体并入。
[0018]听力损失
_9] 化学诱导的耳毒性[0020]各种治疗药物对听细胞和螺旋神经节神经元的耳毒性效应经常是限制它们治疗有用性的因素。常用的耳毒性药物包括广泛使用的化疗药物顺钼及其类似物、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、奎宁及其类似物、水杨酸及其类似物和环利尿剂(loop-diuretics)。
[0021]例如，已知抗细菌氨基糖苷类如庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布拉霉素等有严重的毒性副作用，特别是耳毒性和肾毒性，这降低了它们作为治疗剂的价值(参见Goodman和 Gilman 的 The Pharmacological Basis of Therapeutics (治疗剂的药理学基础)，第6 版，A.Goodman Gilman 等人编辑；Macmillan Publishing C0.，Inc., 1980.New York,第1169-71页)。因此，耳毒性是公认的抗生素施用的剂量限制性副作用。研究表明，每天接受I克超过I周后，4-15%患者发展可测量的听力损失，如果继续治疗，则逐渐恶化并可能导致永久性耳聋。
[0022]耳毒性也是顺钼的严重的剂量限制性副作用，顺钼是已证明对各种人类癌症包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌有效的钼配合物。已显示顺钼I Pkttindκ )损害听觉系统和前庭系统。水杨酸类，例如阿斯匹林，由于其抗炎、镇痛、解热和抗血栓效应而成为最常用的治疗药物。不幸的是，它们也有耳毒性的副作用，并可导致耳鸣(“耳中鸣响”)和暂时性听力损失。此外，如果长期高剂量使用该药物，可出现慢性的和不可逆转的听力损伤。
[0023]不限于理论，顺钼药物和其他潜在的耳毒性药物通过内耳组织中细胞凋亡诱导耳毒性效应，尤其是内耳毛细胞(Zhang等人Neuroscience 2003,120(1): 191-205 ;Wang等人2003，J.Neuroscience, 23 (24):8596-8607)。长期高剂量使用耳毒性药物会导致持久性和不可逆转的听力损伤。哺乳动物的听毛细胞的只在胚胎发育时产生并如果在出生后损失则不可再生。因此，毛细胞的损失将导致完全的和不可逆转的耳聋。
[0024]不幸的是，目前没有有效治疗耳蜗使耳聋好转的疗法。因此，防止听毛细胞死亡的有效治疗会有很大的治疗价值。转让给本发明 申请人:的美国序列号11/655，610涉及治疗受试者听力损伤的方法，所述方法包括给受试者施用包含有效量P53多核苷酸抑制剂和任选地促凋亡基因抑制剂的组合物。
[0025]老年件耳聋
[0026]另一种类型的听力损失是老年性耳聋，它是老年人逐渐发生的听力损失。约30-35 %年龄介于65-75岁之间的成年人和40-50 %年龄在75岁和以上的人经历听力损失。因此，存在对预防、降低或治疗牵涉内耳组织特别是内耳毛细胞的内耳疾患和听力损伤的发病率和/或严重程度的措施的需要。
[0027]声损伤
[0028]声损伤是长期暴露于高噪音所导致的听力损失类型。不希望限于理论，暴露于高噪音导致耳蜗上的毛细胞敏感性降低。对于更加严重的暴露，损伤可从相邻支持细胞的损失发展到柯替器(organ of Corti)的完全破坏。感觉细胞死亡可导致渐进性沃勒变性(ffallerian degeneration)和初级听神经纤维的损失。
[0029]因此，存在对预防、降低或治疗化学毒性导致的疾病或疾患包括内耳疾患及听力损伤、肾损害(肾毒性)和神经损伤(神经毒性)的发病率和/或严重程度的措施的需要。
[0030]急性肾功能衰竭
[0031]急性肾功能衰竭(ARF)是特征为在数天内发生肾功能的快速恶化的临床综合征。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)突然下降，导致含氮废物(尿素、肌酐)滞留。在世界范围内，每年每I百万人中约170-200人发生严重的ARF。现今，还没有对确定的ARF的特异疗法。已发现一些药物在动物模型中改善毒性和缺血性实验性ARF，如降低的血清肌酐水平，减少的组织学损害和更快恢复肾功能所表现的。这些药物包括抗氧化剂、钙通道阻滞剂、利尿剂、血管活性物质、生长因子、抗炎剂等。然而，当这些药物进行临床试验时则表现出没有益处，并且未批准其对治疗ARF有用。
[0032]大多数住院的ARF患者中，ARF是由急性肾小管坏死(ATN)引起的，性肾小管坏死由缺血和/或肾毒性损害引起。肾灌注不足是由低血容量休克、心源性休克和感染性休克，由施用血管收缩药物或肾损伤造成的。肾毒素包括外源性毒素如造影剂和氨基糖苷类以及内源性毒素如肌红蛋白。最近的研究表明，肾组织细胞凋亡在大多数人类ARF病例中是突出的。凋亡性细胞死亡的主要位点是远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的完整性丧失导致上皮扁平，和刷状缘丧失，焦点细胞接触丧失，以及随后细胞从深层基底脱离。已经建议，凋亡性肾小管细胞死亡可能比坏死性细胞死亡更多地预测功能变化(Komarov 等人 1999, Science.285(5434): 1733-7 ；Supavekin 等人 2003, KidneyInt.63(5):1714-24)。综上所述，目前还没有预防和/或治疗急性肾功能衰竭的理想治疗模式，而且显然需要为此研发新化合物。
[0033]肾移棺
[0034]移棺物功能延识.[0035]移植物功能延迟(Delayed graft function, DGF)是肾移植中手术后早期最常见的并发症，并且导致不理想的移植结果(Moreso等人N印hiOl.Dial.Transplant.1999.14(4):930-35)。虽然移植物功能延迟的发生率和定义在移植中心之间不同，但结果是不变的并包括延长的住院、其他侵入性程序以及对患者和医疗保健系统的额外成本。
[0036]急性移植排斥反应
[0037]急性移植排斥反应可分为三类，取决于移植物破坏(graft destruction)的发作。超急性排斥是应用于极早期移植物破坏通常在最初的48小时内的术语。急性排斥反应在移植后几天到几个月或甚至几年发作，并可涉及体液和/或细胞的机制。慢性排斥反应与慢性同种异体免疫反应有关。
[0038]青光眼
[0039]青光眼是世界上引起失明的主要原因之一。它影响了全世界大约6680万人。每年至少有12，000美国人因这种疾病所致盲(Kahn和Mi I ton，Am J Epidemiol.1980，111 (6):769-76)。青光眼的特征是视神经头部的轴突变性，主要是由于升高的眼压(IOP)。原发性开角型青光眼(POAG)是青光眼最常见的形式之一，由于小梁网(TM)中房水外流的阻力增加，造成IOP升高和最终的视神经损伤。Mucke (IDrugs 2007,10(1):37-41)综述了目前的疗法，包括用于治疗眼部疾病例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼的针对各种靶的SiRNA0
[0040]急件呼吸窘迫综合征
[0041]急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，也称为呼吸窘迫综合征(RDS)或成人呼吸窘迫综合征(相对于婴儿呼吸窘迫综合征，IRDS)是对各种形式肺损伤的严重反应。其为造成增加通透性的肺水肿的最严重的疾患。[0042]ARDS是各种直接和间接损害引起的严重肺部疾病。其特征是肺实质炎症，该肺实质炎症导致气体交换受损与伴随的炎症介质的全身释放，所述炎症介质引起炎症、缺氧，并经常导致多器官功能衰竭。这种情况会危及生命而且往往致命的，通常需要机械通气并进入加护病房。急性呼吸窘迫综合征不太严重的形式称为急性肺损伤(ALI)。
[0043]器官移植后缺血再灌注损伤
[0044]缺血再灌注损伤(IRI)是器官同种异体移植物接受者死亡的主要原因之一。重大IRI发生在从死亡捐赠者的每个器官移植病例和在从活体捐赠者的一些器官移植病例。它导致急性排斥反应增加和长期同种异体移植功能损害。肺移植是终末期肺部疾病病人的唯一最终治疗(definitive therapy),在所有固体同种异体移植接受者中存活率差。
[0045]急性肺移植排斥反应
[0046]急性同种异体移植排斥反应仍然是肺移植中严重的问题，尽管免疫抑制药物有所进展。缺血再灌注(I/R)损伤和缺氧损伤可造成排斥反应和最终早期发病和死亡。
[0047]脊髓损伤
[0048]脊髓损伤，是导致感觉和/或运动丧失的脊髓障碍，也称为脊髓病。两种最常见的类型是创伤引起的脊髓损伤和疾病引起的脊髓损伤。创伤常常是由车祸、跌倒、枪击、潜水事故等引起的。可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤、弗里德赖希共济失调(Friedreich， s ataxia)。
[0049]压疮
[0050]压疮(Pressure sore)，通常称为褥疮或压迫性溃疡，为损坏的皮肤和组织部位。随着长期受压，可发展组织缺血，造成间质组织中代谢废物的积累，造成缺氧和细胞死亡。这种压力引起的缺血还导致过度组织缺氧，进一步促使细菌繁殖和组织破坏。
[0051]年龄相关性黄斑变性
[0052]超过65岁的美国人中最佳矫正视力下降的最常见的原因是称为年龄相关性黄斑变性(AMD)的视网膜疾患。受AMD影响的眼部区域是黄斑区，为视网膜中心的一个小区域，主要是感光细胞组成。随着AMD的进展，该病的特征是尖锐的中央视力的丧失。所谓的“干性” AMD占AMD患者的约85-90%并涉及由于细胞的整体萎缩所致的眼色素分布改变、光感受器损失和视网膜功能减弱。“湿性”AMD涉及异常脉络膜血管增殖导致视网膜下空间形成凝块或伤痕。因此，“湿性”AMD的发作是由于神经视网膜下方异常脉络膜新生血管网络的形成(脉络膜新生血管形成，CNV)。新形成的血管过度泄漏，导致视网膜下积液和血液积聚导致视敏度损失。最终，随着包括脉络膜和视网膜的大盘状疤痕的形成，有关区域功能性视网膜完全丧失。干性AMD患者可以维持质量下降的视力，而湿性AMD常常导致失明(Hamdi和 Kenney, Frontiers in Bioscience, e305_314, May2003)。
[0053]糖尿病性视网膜病
[0054]糖尿病性视网膜病变(DR)被认为是表现过度的毛细血管通透性、血管闭合和新血管增殖的视网膜血管病。DR以两个阶段发生:非增殖阶段和增殖阶段。在非增殖阶段该疾病的特征是视网膜毛细血管周细胞丧失、基底膜增厚和微动脉瘤的发展、圆点状和污点状出血和硬性渗出物。在增殖阶段该疾病的特征是大量新生血管发生、血管侵入到玻璃体、出血和纤维化随后的视网膜牵引，视网膜牵引导致视力严重损伤。转让给本发明的受让人的美国专利号6740738和相关专利和申请涉及抑制RTP801基因和蛋白质用于治疗视网膜病变以及其他病变的方法。
[0055]口腔粘膜炎
[0056]口腔黏膜炎，也称为口腔炎，是化学治疗和放射线疗法常见和衰弱副作用，其表现为红斑和口腔和咽喉溃疡性病变部位疼痛。口腔粘膜炎患者日常活动如吃饭、喝水、吞咽和说话都可能困难或难以做到。姑息性疗法包括施用止痛药和局部清洗。
[0057]干眼综合征
[0058]干眼综合征是由于润滑眼睛的泪膜减少所致的常见问题。大多数干眼病患者会有不适感，和没有视力损失；尽管在严重的情况下，角膜可能受到损伤或感染。润湿滴液(人工眼泪)可用于治疗干眼综合征，润滑膏可用于更严重的情况。
[0059]缺血件眼病
[0060]缺血性视神经病变(ION)包括各种视神经缺血产生的疾病。根据定义，ION定义为眼前病变如果存在急性视神经盘水肿，表明最接近眼球的一部分视神经梗死。缺血性视神经病变也可是眼后，位于眼球的背后几厘米。缺血性视神经病变通常只发生在60岁以上的人。多数病例是非动脉炎性和可归因于视神经灌注动脉粥样硬化、糖尿病或高血压的影响。颞动脉炎导致约有5%的病例(动脉性Ι0Ν)。
[0061]症状和体征是突然、部分或完全丧失视力，伴随着视盘肿胀，而且往往出血。视野缺损可能表现为丧失一半的横向划分视野或有中央或中心外(环绕生理盲点)盲点。视力下降紧接着视盘苍白。 更有效治疗上述疾病和病症的疗法，将有很大的治疗价值。
[0062]发明概述
[0063]本发明提供新TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、N0X3、HRK、RAC1、RH0A 和 DUOXlsiRNA，以及新的化学和/或结构修饰的siRNA化合物，以抑制一般基因表达和特别是哺乳动物基因 TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、N0X3、HRK、ClQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF、SPPl、RHOA 和 DUOXl 的表达。(关于基因的详情参见以下表A)。
[0064]进一步提供具有有利性质并可应用于任何靶序列的siRNA，特别是在此公开的siRNA寡核苷酸，的新双链寡核苷酸结构。本发明所公开的化学修饰的siRNA基序在制备用于RNA干扰(RNAi)的稳定和活性化合物中是有用的。
[0065]本发明还提供包括一种或多种所述寡核苷酸的药物组合物。本发明进一步涉及在需要其的受试者中治疗或预防疾病或病症的发病率或严重程度的方法，其中所述疾病或病症和/或与之相关的症状与靶基因的表达相关。在一些实施方案中所述疾病或病症选自由听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，眼缺血病症，器官移植包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植，肾毒性和神经毒性，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干眼综合征，口腔粘膜炎，缺血性眼神经病变(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)组成的组。该方法涉及给需要所述治疗的哺乳动物施用预防或治疗有效量的一种或多种所述化合物，其抑制或降低至少一种所述基因的表达或活性。
[0066]因此，本发明一方面提供新寡核苷酸序列用于抑制选自LRDD、CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RAC1、RHOA和DUOXl的基因，所述基因的mRNA多核苷酸序列分别如SEQ ID NOS:1_2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46 和 47-48 所示。表 D (D1-D34)提供本发明的 19、21 和 23-mer有义寡核苷酸和相应的反义寡核苷酸。本发明的另一方面提供用于抑制一般基因表达或选自 TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、N0X3、HRK、ClQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG, CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP, CTGF, SPPl、RHOA 或 DUOXl 的基因的基因表达的化学和/或结构修饰的核酸化合物。在不同实施方案中修饰的化合物包含存在于表B(B1-B74)和C(C1-C3)的如SEQ ID NOS:97-68654所示的寡核苷酸序列(在美国序列号11/978，089和PCT专利申请号PCT/IL 2007/001278中公开，在此通过引用整体并入)。
[0067]在某些实施方案中，化学和/或结构修饰的SiRNA化合物包含存在于表D(D1_D34 ；SEQ ID NOS:68，655-87，088)的寡核苷酸序列。
[0068]本发明一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(A):
[0069](A) 5' (N)x-Z3'(反义链)
[0070]3' V -(N' )y 5'(有义链)
[0071]其中N和K中的每一个是选自以下的核苷酸:未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
[0072]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0073]其中X和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
[0074]其中Z和V中的每一个可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到其所存在的链的3'末端的1-5个连续核苷酸；
[0075]其中(N)X的序列包括存在于表D(D1_D34)中的一个或多个反义序列。
[0076]在某些实施方案中，(N) X和(N' )y完全互补。在其他实施方案中(N) X和(N')y基本上互补。在某些实施方案中(N) X与靶序列完全互补，在其他实施方案中(N) X与靶序列基本上互补。根据某些优选实施方案本发明提供siRNA化合物，该siRNA化合物包含一个或多个修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸在糖基部分、碱基部分或核苷酸间键合部分具有修饰。
[0077]本发明一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(IX):
[0078](IX) 5' (N)x-Z 3'(反义链)
[0079]3' V -(N' )y_z" 5'(有义链)
[0080]其中N和K中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
[0081]其中(N) X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0082]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3'末端的1-5个连续核苷酸；
[0083]其中z "可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0084]其中X = 18 到 27 ;
[0085]其中y = 18 到 27 ;
[0086]其中(N)X包含修饰 的和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2' -O-甲基，其中在(N)X的3'末端的N是修饰的核糖核苷酸，(N) X包含从3'末端开始的至少5个交替的修饰的核糖核苷酸和共计至少9个修饰的核糖核苷酸，并且每个剩余的N是未修饰的核糖核苷酸；
[0087]其中在(N' )y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可能是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和通过2/ -5'核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
[0088]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
[0089]在一些实施方案中X = y = 19。在其他实施方案中x = y = 23。在一些实施方案中至少一个非常规部分存在于(N' )y中的位置15、16、17或18。在一些实施方案中所述非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些优选实施方案中所述非常规部分是镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中L-DNA部分位于位置17,位置18或位置17和18。
[0090]在其他实施方案中所述非常规部分是脱碱基部分。在不同实施方案中(N' )y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
[0091]在又其他实施方案中(N' )y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分，并且至少I个K是LNA。
[0092]在结构(IX)的一些实施方案中，(N)X包含9个交替的修饰的核糖核苷酸。在结构(IX)的其他实施方案中(N) X包含9个交替的修饰的核糖核苷酸，还包含位于位置2的2' O修饰的核苷酸。在一些实施方案中(N)X包含位于奇数位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的W O Me修饰的核糖 核苷酸。在其他实施方案中(N)X还包含位于位置2和18中一个或两个位置的2' O Me修饰的核糖核苷酸。在又其他实施方案中(N)X包含位于位置2、
4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修饰的核糖核苷酸。
[0093]在一些实施方案中z "存在。在不同实施方案中z "存在，并且选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-P1、镜像核苷酸。
[0094]在结构(IX)的一些实施方案中，(N)y包含在位置17、位置18或两个位置17和18的镜像核苷酸；其中(N' )y包含在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的2' O-Me修饰的核糖核苷酸；且其中所述靶基因是CASP2。
[0095]本发明另一方面提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(X):
[0096](X) 5' (N)x-Z3'(反义链)
[0097]3' V -(N' )y_z" 5'(有义链)
[0098]其中N和K中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
[0099]其中(N) X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0100]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3'末端的1-5个连续核苷酸；
[0101]其中Z"可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0102]其中X = 18 到 27 ；
[0103]其中y = 18 到 27 ；[0104]其中(N) X包括修饰的或未修饰的核糖核苷酸，和任选地至少一个非常规部分；
[0105]其中在(N' )y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可以是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸，和非碱基配对的核苷酸类似物或通过2' -5'核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和
[0106]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
[0107]在一些实施方案中X = y = 19。在其他实施方案中x = y = 23。在一些优选实施方案中(N)X包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸,和至少一个非常规部分。在不同实施方案中(N)X包含与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
[0108]在一些实施方案中，位于(N)X的:V末端的N是修饰的核糖核苷酸，并且(N) X包括至少8个修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中所述至少8个修饰的核糖核苷酸中的至少5个交替开始于3,端。在一些实施方案中(N)X包含位于位置5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15之一的脱碱基部分。
[0109]在一些实施方案中，(N' )y中的所述至少一个非常规部分位于位置15、16、17或18。在一些优选实施方案中所述非常规部分选自镜像核苷酸,优选L-DNA部分。在一些实施方案中L-DNA部分位于位置17，位置18或位置17和18。在其他实施方案中，(N' )y中的所述至少一个非常规部分是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。在某些实施方案中，(N) X和(N' ) y之间有少于15个碱基对。
[0110]在结构⑴的一些实施方案中z"存在。在结构⑴的不同实施方案中z"存在，并且选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-P1、镜像核苷酸。
[0111]在另一方面本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(XI):
[0112](XI) 5' (N)x-Z3'(反义链)
[0113]3' I' -(N' )y_z" 5'(有义链)
[0114]其中N和K中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
[0115]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0116]其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的3'末端的1-5个连续核苷酸；
[0117]其中z "可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(K )y的Y末端的加帽部分；
[0118]其中X = 18 到 27;
[0119]其中y = 18 到 27;
[0120]其中(N)X包含修饰的或者未修饰的核糖核苷酸和非常规部分的组合，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2, -O-甲基；
[0121]其中(K )y包含修饰的或者未修饰的核糖核苷酸和任选地非常规部分，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2’ OMe ；
[0122]其中(N)X的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N’)y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同；其中存在与所述 mRNA互补的少于15个连续核苷酸。[0123]在一些实施方案中X = y = 19。在其他实施方案中x = y = 23。在一些优选实施方案中所述至少一个优选的非常规部分存在于(N)X中，并且是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。在其他实施方案中，所述至少一个非常规部分存在于(N) X,并且是非碱基配对的核苷酸类似物。在不同实施方案中(N) X包含与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。在不同实施方案中(N' )y包含未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)X包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分或其组合。在某些实施方案中(N) X和/或W ) y包含不与W ) y和/或(N) X中相应的修饰的或未修饰的核糖核苷酸碱基配对的修饰的核糖核苷酸。
[0124]结构(IX)，(X)和(XI)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA如SEQ ID NOS:1_41，46-48之一所示。在一些实施方案中(N)X和(N' )y的寡核苷酸序列如表 B(B1-74)、C(C1-C4)和 D(D1_D34) (SEQ ID NO:97-87,178)所示。
[0125]在一些实施方案中结构(IX)、(X)和(XI)基序与表B(B1-B74)，C(C1_C3C4)和表D(D1-D34) (SEQ ID NOS:97-87,178)所示的寡核苷酸对组合使用。
[0126]在另一方面本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述任一种化合物和药学上可接受的载体。
[0127]在又一方面本发明提供了一种在需要其的受试者中治疗或预防疾病或病症的发病率或严重程度的方法，其中所述疾病或病症和/或与之相关的症状选自由听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，眼缺血病症包括前部缺血性视神经病变，器官移植包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植 和包括DGF，肾毒性和神经毒性，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AMD)，干眼综合征，Ι0Ν，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)组成的组，所述方法包括给受试者施用有效预防或治疗所述疾病或病症的量的包含上述任一种化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0128]在不同实施方案中本发明提供有结构(IV)所列的siRNA:
[0129](IV) 5' (N)x-Z3'(反义链)
[0130]3' V -(N' )y 5'(有义链)
[0131]其中N和K中的每一个是选自以下的核苷酸:未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸，未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
[0132]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0133]其中Z和Z'不存在；
[0134]其中X = y = 19 ;
[0135]其中在(N' )y中位置15、16、17、18和19的至少一个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸:脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸和通过2' -5'核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸；
[0136]其中(N)X包含交替的修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸经修饰使得在其糖基上具有2' -O-甲基，并且位于(N)X的中间位置的核糖核苷酸是修饰的或未修饰的，优选地未修饰的；和[0137]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与祀基因的mRNA基本上相同。
[0138]在结构(IV)的一些实施方案中，位于(N' )y的位置17和18中一个或两个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸:脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸和通过2' -5'核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA。在不同实施方案中镜像核苷酸是L-DNA。
[0139]在不同实施方案中(K )y包含位于位置15的修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
[0140]在某些实施方案中(N' )y还包含位于位置2的修饰的核苷酸或者假核苷酸，其中假核苷酸可能是脱碱基假核苷酸类似物，并且修饰的核苷酸任选地是镜像核苷酸。
[0141]在不同实施方案中反义链(N)X包含位于奇数位置(从5'到3';位置1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19)的Y O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)X还包含位于位置2和18中一个或两个位置的W O-Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N) X包含在位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修饰的核糖核苷酸。
[0142]考虑了结构(IV)、(IX)和⑴的其他实施方案,其中X = y = 21或其中x = y =23 ;在这些实施方案中，对上文论述过的(N' )y修饰不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22 ;类似地，在位置15、16、17、18或者19的修饰为在21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23_mer寡核苷酸的位置
19、20、21、22、或23。反义链上的W O Me修饰做出类似的调整。在一些实施方案中(N)X包含在奇数位置(5'到3'，21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 [位置12的核苷酸未修饰])的W O Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施中(N) X包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 [位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰]的2' O Me修饰的核糖核苷酸。
[0143]在一些实施方案中(N' )y还包含5'末端加帽核苷酸。在不同实施方案中末端加帽部分选自脱碱基假核苷酸类似物、反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。
[0144]结构(IV)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA 如 SEQ ID NOS:1-41,46-48 之一所示。
[0145]在一些实施方案中结构(IV)基序与表B(B1-B74)、C(C1_3C4)和表D(D1_D34) (SEQID NOS:97-87,178)所示的寡核苷酸对组合使用。
[0146]在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构V:
[0147]5' (N)x-Z3'(反义链)
[0148]3' V -(N' )y 5'(有义链)
[0149]其中N和N'中的每一个选 自假核苷酸和核苷酸；
[0150]其中每个核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；[0151]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0152]其中Z和t不存在；
[0153]其中X = 18 到 27;
[0154]其中y = 18 到 27;
[0155]其中(N)X的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因的mRNA基本上相同；
[0156]其中至少一个N选自脱碱基假核苷酸、非配对的核苷酸类似物和(N)X的位置中与靶基因mRNA错配的核苷酸，而使(N) X包含与靶基因mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
[0157]在其他实施方案中本发明提供双链化合物，该双链化合物具有如下所列的结构(VI):
[0158](VI) 5' (N)x-Z 3'(反义链)
[0159]3' V -(N' )y 5'(有义链)
[0160]其中N和K中的每一个是选自以下的核苷酸:未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸； [0161]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0162]其中Z和t不存在；
[0163]其中X和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
[0164]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因的mRNA基本上相同；
[0165]其中(N)x、(N' )y或(N)x和(N' )y包含非碱基配对的修饰的核苷酸，而使(N)X和(K )y在双链化合物中形成小于15个碱基对。
[0166]在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(VII):
[0167](VII) 5' (N)x-Z 3'(反义链)
[0168]3' V -(N' )y 5'(有义链)
[0169]其中每个N是选自以下的核苷酸:未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
[0170]其中每个N'是选自六元糖核苷酸、七元糖核苷酸、吗啉代部分、肽核酸及其组合的核苷酸类似物；
[0171]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0172]其中Z和t不存在；
[0173]其中X和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
[0174]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因的mRNA基本上相同。
[0175]在其他实施方案中本发明提供化合物，该化合物具有如下所列的结构(VIII):
[0176](VIII) 5' (N)x-Z 3'(反义链)
[0177]3' V -(N' )y 5'(有义链)[0178]其中N和K中的每一个是选自以下的核苷酸:未修饰的核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和修饰的脱氧核糖核苷酸；
[0179]其中(N)X和(N' )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸；
[0180]其中Z和Z'不存在；
[0181]其中X和y中的每一个是介于18和40之间的整数；
[0182]其中(N)X或(N' )y内部位置的一个N或N'，或位于(N)X或(N' )y的末端位置的一个或多个N或K包含脱碱基部分或W修饰的核苷酸；
[0183]其中(N)x的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因的mRNA基本上相同。
[0184]在结构(V)-(VIII)的一些实施方案中，(N)X包含交替的修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸；每个修饰的核糖核苷酸经修饰使得其糖基上具有2, -O-甲基。在一些实施方案中位于(N)X中间位置的N是未修饰的。
[0185]在结构(IV)的一些实施方案中，(N' )y的位置17和18中的一个或两个位置的核苷酸包含选自以下的核苷酸:脱碱基假核苷酸、镜像核苷酸和通过2' -5'核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA。在不同实施方案中镜像核苷酸是L-DNA。
[0186]在不同实施方案中(K )y包含位于位置15的修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
[0187]在某些实施方案中(K )y还包含位于位置2的修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱碱基假核苷酸类似物。
[0188]在不同实施方案中反义链(N)X包括位于奇数位置(5'到3';位置1、3，5、7、9、
11、13、15、17、19)的W O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中(N)X还包含位于位置2和18中的一个或两个位置的W O-Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N) X包括位于位置2、4、6、8、11、13、15、17、19的2' O Me修饰的核糖核苷酸。
[0189]考虑了结构(IV)的其他实施方案,其中X = y = 21或其中x = y = 23 ;在这些实施方案中，对上文论述过的(N' )y修饰不是在位置17和18而是在21-mer寡核苷酸的位置19和20以及23-mer寡核苷酸的位置21和22 ;类似地位置15、16、17、18或19的修饰为21-mer寡核苷酸的位置17、18、19、20或21和23-mer寡核苷酸的位置19、20、21、22或23。反义链上的W O Me修饰做类似调整。在一些实施方案中(N)X包含在奇数位置(5'到3' ;21-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、12、14、16、18、20[位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 [位置12的核苷酸未修饰]的2! O Me修饰的核糖核苷酸。在其他实施方案中(N)X包含在21-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 [位置11的核苷酸未修饰]和23-mer寡核苷酸的位置2、4、6、8、
10、13、15、17、19、21、23[位置12的核苷酸未修饰]的2' O Me修饰的核糖核苷酸。
[0190] 在一些实施方案中(N' )y还包含Y末端加帽核苷酸。在不同实施方案中末端加帽部分选自脱碱基假核苷酸类似物、反向脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。
[0191]结构(IV)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义和反义链)。在一些实施方案中哺乳动物基因是人类基因。在不同实施方案中人类基因的mRNA 如 SEQ ID NOS:1-41,46-48 之一所示。
[0192]在一些实施方案中结构(IV)基序与表B(B1-B74)、C(C1-C4)和表D(D1_D34)中所示的寡核苷酸对组合使用。
[0193]本发明的第二方面提供基于本文公开的结构(C)-(H)以及相关结构(I)-(XI)的化学和/或结构修饰的siRNA化合物。在不同实施方案中siRNA化合物基于表B (B1-B74)、表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所不的有义寡核苷酸和相应的反义寡核苷酸中的一个。
[0194]本发明的另一方面提供药物组合物，其包含有效抑制人类基因表达的量的本发明的修饰的或未修饰的化合物和药学上可接受的载体，其中该化合物包含存在于表D(D1-D34)的反义序列，(N)X0
[0195]本发明又一方面提供药物组合物，其包含有效抑制人类基因表达的量一种或多种本发明的修饰的化合物和药学上可接受的载体，其中该化合物包含表B(B1-B74)或表C(C1-C4)和/或表D(D1-D34)所示的反义序列，(N)X0
[0196]本发明另一个方面涉及给需要治疗的受试者治疗与基因表达相关的疾病或病症和/或与该疾病或病症相关的症状的方法，其中所述基因的miRNA多核苷酸序列如SEQ IDNOS =1-41,46-48中的任一个所示，所述方法包括给受试者施用治疗有效剂量的量的根据本发明的siRNA从而 治疗受试者。
[0197]更具体地，本发明提供用于治疗患有急性肾功能衰竭(ARF)，听力损失，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，器官移植包括肺、肾、骨髓、心脏、胰腺、角膜或肝脏移植损伤(例如缺血再灌注损伤)和包括移植物功能延迟(DGF)肾毒性，脊髓损伤，压疮，干眼综合征，口腔粘膜炎，缺血性视神经病变(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者的方法和组合物。
[0198]本发明的方法包含给受试者施用抑制基因表达的一种或多种siRNA化合物，其中所述基因的mRNA多核苷酸序列如SEQ ID NOS:1_41，46-48中的任一个所示。在此公开的新结构，当整合到任何靶基因的反义和相应有义核酸序列时提供siRNA化合物，所述siRNA化合物用于降低靶基因表达。靶基因是哺乳动物或者非哺乳动物基因。在特定实施方案中，靶基因是具有选自SEQ ID NOS:1-41，或46-48中的任一个的mRNA的哺乳动物基因。
[0199]转让给本发明的受让人的PCT公布号W02008/050329中公开了如表B和C所示的有义和相应反义核苷酸序列，该公布在此通过引用整体并入。
[0200]本发明排除序列和修饰均已知的s iRNA化合物。
[0201]附图简述
[0202]图1A和IB呈现了 19-mer siRNA结构和用本发明的2' _0_甲基化化合物得到的
实验结果；
[0203]图2显示了在有义链和反义(AS)链上都具有交替甲基化模式的23-mer siRNA化合物的实例；
[0204]图3A和3B呈现了包含2' -O甲基化单体的23_mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
[0205]图4A和4B呈现了包含2' -O甲基化单体的23_mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；[0206]图5A和5B呈现了包含2' -O甲基化单体的23_mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
[0207]图6A和6B呈现了包含2' 5'桥接核苷酸的19_mer QM5 (靶向p53) siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
[0208]图7A和7B呈现了包含Y 5^桥接核苷酸的19_mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
[0209]图8A和8B分别呈现了包含2' 5'桥接核苷酸的19_mer REDD2和QM5siRNA结构。
[0210]图9A和9B呈现了包含2' 5'桥接核苷酸(星号)和2' -O甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的19-mer QM5siRNA结构，和图9C-9E显示了这些化合物的活性。
[0211]图1OA和IOB呈现了包含2' 5'桥接核苷酸(星号)和2' _0甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的19-mer QM5siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果。图1OC和IOD显示了血清稳定性结果；
[0212]图1lA和IlB呈现了包含2' 5'桥接核苷酸(星号)和2' _0甲氧基核糖核苷酸(粗体，下划线)的组合的23-mer CASP2siRNA结构，及用这些化合物得到的实验结果；
[0213]图12 A和12B呈现了包含2' 5'桥接核苷酸(星号)的23-mer CASP2siRNA结构和用这些化合物得到的实验结果；
[0214]图13A显示了包含L-DNA核苷酸的QM5siRNA结构；和图13B显示了用这些化合物得到的实验结果；图13C显示了血清稳定性，和图13D显示了包含L-DNA核苷酸的siRNA与包含交替2'甲氧基模式的siRNA相比的IC50值；
[0215]图14A显示了包含LNA核苷酸的QM5siRNA结构；而图14B显示了用这些化合物得到的实验结果；
[0216]图15显示了串联siRNA化合物的实例及其血清稳定性结果；
[0217]图16显示了星形(star) siRNA化合物的实例及其血清稳定性结果；
[0218]图17A-17C显示了包含修饰组合的siRNA化合物的实例；
[0219]图18描述了 RNA/DNA嵌合寡核苷酸；
[0220]图19A-19D显示了包含单独的或与附加修饰组合的L-DNA基序的寡核苷酸的实例；
[0221]图20描述了在制备根据本发明的双链体化合物中有用的另外的寡核苷酸结构；
[0222]图21举例说明了用于本文详述的各种结构的非碱基配对的核苷酸单体的实例；
[0223]图22提供了本发明中用作Y加帽结构的C6-氨基-磷酸(C6-氨基-Pi)部分的化学结构的图像；
[0224]图23提供了用于RNAi的包含根据本发明序列和结构基序的化合物表。
[0225]发明详述
[0226]本发明总体上涉及下调各种基因的表达的化合物，特别地涉及新的小干扰RNA(siRNA)以及这些新siRNA在治疗遭受各种医学病症的受试者中的应用。
[0227]因此，本发明一方面提供用于抑制选自LRDD、CYBA, CASP2、N0X3、HRK、RACK RHOA和DUOXl的基因的新寡核苷酸序列，所述基因的mRNA多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1_2、3-5、6、10-11、12、13、24-26、46和47-48所示。寡核苷酸序列呈现于表D (D1-D34)，其中有义链与互补的反义链配对。还提供了在针对任何靶基因的siRNA的制备中有用的新结构基序。表B(B1-B74)、C(C1-C4)和D(D1_D34)提供了本发明使用的优选siRNA的列表。对于每个基因有19-mer, 21-mer和23-mer序列的独立表,所述序列基于它们在专有性算法中作为靶向人类基因表达的最佳序列的得分按优先次序列出。
[0228]在此详细讨论了抑制本发明基因的分子和组合物，并且所述分子和/或组合物的任一个可有益地用于遭受所述病症的任一种的受试者的治疗。
[0229]本发明的siRNA化合物具有可例如增强活性，增加稳定性，和/或最小化毒性的结构和修饰；本发明的新修饰SiRNAs有益地应用于在预防或削弱靶基因表达中有用的双链RNA,特别地是此处论述的靶基因。
[0230]在下面的表A中呈现了某些靶基因和优选的适应症的详情。
[0231]表A:本发明的靶基因
[0232]
【权利要求】
1.一种化合物，该化合物具有如下所列的结构(X): (X)5' (N)X-Z 3'(反义链) 3' V -(N' )y-z" 5'(有义链) 其中N和K中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分； 其中(N)X和(K )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸； 其中Z和V可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的 末端的1-5个连续核苷酸； 其中z"可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N' )y的5'末端的加帽部分； 其中X = 18到27 ； 其中y = 18到27 ； 其中(N) X包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸，和任选地至少一个非常规部分； 其中在(N' )y中存在至少一个非常规部分，该非常规部分可能是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对的核苷酸类似物或通过2' -5'核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸连接的核苷酸；和 其中(N)X的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X= y = 23。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中(N)X包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，和至少一个非常规部分。
4.一种化合物，该化合物具有如下所列的结构(XI): (XI)5' (N)x-Z 3'(反义链) 3' V -(N' )y-z" 5'(有义链) 其中N和K中的每一个为可以是未修饰的或修饰的核糖核苷酸或非常规部分； 其中(N)X和(K )y中的每一个是其中每个连续的N或K通过共价键与下一个N或N'连接的寡核苷酸； 其中Z和Z'可存在或不存在，但是如果存在，则独立地是共价连接到其所存在的链的 末端的1-5个连续核苷酸； 其中z"可存在或不存在，但是如果存在，则是共价连接到(N' )y的5'末端的加帽部分； 其中X = 18到27 ； 其中y = 18到27 ； 其中(N)X包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸和非常规部分的组合，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2, -O-甲基； 其中W )y包含修饰的或未修饰的核糖核苷酸和任选地非常规部分，任何修饰的核糖核苷酸在其糖基上具有2’ OMe ； 其中(N)X的序列与(N' )y的序列基本上互补；并且(N' )y的序列与靶基因编码的mRNA的序列基本上相同；和其中存在与所述mRNA互补的少于15个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的化合物,其中X= y = 23。
6.权利要求4所述的化合物，其中至少一个非常规部分存在于(N)X，并且是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述靶基因选自哺乳动物和非哺乳动物基因。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中所述哺乳动物基因是人类基因，其中该基因编码的 mRNA 如 SEQ ID NO:1_41 或 46-48 之一所示。
9.一种药物组合物,该药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物用于制备在需要其的受试者中治疗或预防疾病或病症的发病率或严重程度的药物的用途，其中所述疾病或病症和/或与之相关的症状选自由听力损失，急性肾功能衰竭(ARF)，青光眼，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其他急性肺和呼吸损伤，肺移植后缺血再灌注损伤，眼缺血病症包括前部缺血性视神经病变，器官移植包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植和包括DGF，肾毒性和神经毒性，脊髓损伤，压疮，年龄相关性黄斑变性(AM D)，干眼综合征，ION，口腔粘膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)组成的组。
【文档编号】A61P9/10GK103898110SQ201210369167
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2008年9月4日 优先权日:2007年10月3日
【发明者】埃莱娜·范斯坦, 侯赛因·阿依古恩, R·斯卡里特, 夏甲·卡林斯基, 伊戈·迈特, 詹姆士·麦克斯威根, 列昂尼德·拜格尔曼 申请人:夸克制药公司