一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物及其用途的制作方法

专利名称：一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短干扰核糖核酸(short interfering RNA, siRNA)药物,尤其是一种在体内RNA及蛋白水平上对Epo表达沉默以及对脉络膜新生血管产生抑制作用的基因治疗药物。
背景技术：
脉络膜新生血管是指来自脉络膜的血管内皮细胞增殖、迁移，穿过Bruch’ s膜进入视网膜下腔或者视网膜色素上皮下，形成新生血管组织，引起出血，最后形成疤痕。这种病变尤其容易发生于黄斑区，也就是人眼视力最敏锐的部位，因此严重影响视力。脉络膜新生血管可见于年龄相关性黄斑变性(Age related macular degeneration, AMD)、特发性脉络膜新生血管、病理性近视、血管样条纹等疾病，其中AMD是最常见的原因。在发达国家，AMD是老年人最常见的不可逆性致盲原因。据美国的流行病学统计，早期和晚期AMD的5年 发病率在60-70岁人群中分别为6. 9%和O. 6%, 70-80岁人群中为12. 2%和2. 9%,80-90岁人群中为22. 4%和6. 8%，90岁以上人群中为50%和22. 2%。在我国，随着社会经济的发展，人口结构老龄化，AMD的发病率也越来越高，成为日益严重的公共卫生问题。据上海的流行病学调查显示，50-59岁人群中AMD患病率为5. 7%, 60-69岁人群中为13. 5%, 70-79岁人群中为20. 2%，80岁以上人群中为23. 5%。在临床上，脉络膜新生血管是非常棘手的疾病，没有理想的治疗方法，常常引起严重的视力下降甚至失明，严重影响患者的生活质量和工作能力，给患者及其家庭和社会带来沉重的负担。目前，脉络膜新生血管的发病机制尚未完全清楚，现有的多种学说认为缺氧、遗传、炎症反应、光氧化产物、玻璃体黄斑牵引、骨髓血管内皮前体细胞等可能在脉络膜新生血管的发生发展中起作用。事实上，任何一种单一的学说都不能解释全部的病理生理变化。因此，脉络膜新生血管是由多种机制的协同作用所引发的。新生血管刺激因子和抑制因子的失衡是一个关键的过程，但是其中的具体机制非常复杂，涉及到多种细胞因子的参与和相互作用。临床上，脉络膜新生血管疾病的治疗相当棘手。手术和激光治疗已经被证实效果不佳，以新生血管形成刺激因子和抑制因子为治疗靶的治疗策略为脉络膜新生血管疾病的治疗带来新的希望。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是其中一个重要的新生血管刺激因子，抗VEGF治疗可以抑制脉络膜新生血管。但是，仍然存在以下几个问题I. VEGF仅仅是多种新生血管形成刺激因子中的一种，单纯的抗VEGF治疗并不能完全抑制脉络I吴新生血管。2.抗VEGF治疗需要反复进行眼内注射，增加了眼内炎的发生机会。3.抗VEGF药物都是由美国的药厂研发的，我国缺乏自主知识产权的药物。因此，对其他新生血管刺激因子或抑制因子的研究可以使我们更好地理解脉络膜新生血管疾病的发病机制，并且找到更多的治疗靶，也可能通过联合用药获得更好的疗效和更高的安全性。同时，也可以通过我国自主知识产权的药物降低患者的经济负担。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一个“古老”的细胞因子，一开始人们认识到的主要作用是刺激红细胞生成。近年来，随着研究的深入，发现EPO也参与新生血管形成。EPO及其受体在血管内皮细胞和平滑肌细胞中有表达。EPO可以刺激鸡胚和体外培养的主动脉弓模型中新生血管形成。在动物模型中，外源性EPO可以促进伤口愈合，缺血性心肌损伤和脑损伤的修复，以及促进肿瘤生长，其作用机制是促进这些模型中的新生血管形成。EPO也参与视网膜新生血管性疾病的发病。增殖性糖尿病视网膜病变(Proliferative diabetic retinopathy, PDR)患者玻璃体中EPO的浓度显著高于对照组，在手术取出的PDR患者的视网膜前膜的血管内皮细胞和基质细胞上有EPO受体强表达。在氧诱导的视网膜新生血管小鼠模型中，EPO、EPO受体和VEGF的基因表达均显著升高，在缺氧期采用EPO可溶性受体和siRNA阻断EPO信号可以抑制视网膜新生血管形成。在临床上，重组EPO蛋白已经用于治疗贫血，在糖尿病肾病患者中尤为常见，也用于早产儿的支持治疗，但是有报道EPO可能会加速增殖性糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变的进展。去年，我们的研究发现位于EPO基因启动子的一个单核苷酸多态性rsl617640中T等位基因在I型和2型糖尿病并发PDR患者中的频率显著高于对照组，而且T等位基因增加了 EPO的表达，用Luciferase报告基因法测到的T等位基因可使EPO的表达升高25倍，而在TT基 因型个体玻璃体中的EPO蛋白浓度比GG基因型的个体高出了 7. 5倍。EPO参与新生血管形成的机制可能涉及全身和局部两方面。EPO具有全身的生物效应，可以促进红细胞生成，也可以动员骨髓干细胞进入循环系统，外源性EPO治疗可以增加血循环中血管内皮前体细胞的数量，并且增强了这些细胞的增殖、迁移能力，并此促进缺血性心肌病变的新生血管形成，改善心肌缺血。我们的前期结果表明，EPO可以促进体外培养的人脐静脉血管内皮细胞迁移和套管形成，其效应与相同摩尔浓度的VEGF相当，也有文献报道EPO可以促进培养的视网膜血管内皮细胞增殖。EPO参与新生血管的其他机制还可能包括调节VEGF等细胞因子的表达、抑制多种原因引起的血管内皮细胞凋亡等。EPO信号系统与眼部新生血管疾病中的研究主要集中在视网膜新生血管性疾病上。也有报道EPO和EPO受体在翼状胬肉组织中表达增加，高于健康结膜组织。但是EPO信号系统与脉络膜新生血管之间的关系尚未见报道。脉络膜新生血管与视网膜新生血管可能有一些共同的发病机制。缺氧在脉络膜新生血管形成中同样起重要作用，缺氧诱导因子(Hypoxia induciblefactor, HIF)在脉络膜新生血管中的表达也增加，而HIF可以上调EPO的表达。我们的前期研究也发现了 EPO在激光诱导的脉络膜新生血管中表达增加。另一方面，骨髓源性的血管内皮前体细胞也参与了脉络膜新生血管的形成，阻断前体细胞与新生血管的黏附可以减少脉络膜新生血管的面积。综上所述，EPO信号系统可能在脉络膜新生血管疾病中起作用；其机制可能通过局部对血管内皮细胞的直接刺激作用和全身促进血管内皮前体细胞释放等途径；因此，从理论上讲，阻断EPO信号通路的治疗也能抑制脉络膜新生血管。而1998年发现的RNA干扰(RNAi)现象，是从低等生物到高等生物都普遍存在的一种防御外源性核酸侵扰的生理机制，它是由siRNA介导的高度特异的转录后基因沉默效应。通过siRNA发挥导向作用来激活RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex, RISC)，由其中的RNase III来高度特异地切割靶mRNA o RNA干扰技术已发展成为抑制靶基因表达的一个有效工具。
虽然RNAi的研究尚处于不完善阶段，但它己被认为是一种生物体固有的基因组“免疫系统”，使得它具有许多反义核酸不可比的优势。siRNA具有如下一些特点前者是由双链RNA分子在细胞内发挥作用，由于细胞内可能存在某种稳定机制，使得siRNA的稳定性较高；siRNA的正义链和反义链正是由于这些特点，使RNAi与传统的反义技术相比具有高效性，高特异性的特点。目前己有大量报道表明，向哺乳动物和人类的细胞中导入siRNA可以引起靶mRNA分子高效特异的降解。因此，以这种生物体本身存在的RNA干扰机制为基础，人工设计并合成针对Epo基因的特异siRNA作为诱发RNA干扰的前体，高效特异地降解Epo基因的mRNA，降低Epo蛋白水平，减少脉络膜新生血管的发生，可以为AMD等脉络膜新生血管疾病的基因治疗提供更为有效的药物。

发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够对Epo的表达起到
沉默作用、高效特异地降低靶mRNA和靶蛋白水平的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA;同时，本发明还提供了所述药物Epo-siRNA在用于制备治疗脉络膜新生血管疾病的药物中的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，所述药物Epo-siRNA是以RNA干扰技术为基础，从GenBank中获得Epo基因的cDNA序列、根据siRNA靶序列选择的基本原则、针对Epo基因设计的长度为21个核苷酸的siRNA，所述药物Epo-siRNA的5’端有两个脱氧核糖核苷酸为单链悬挂状态，所述药物Epo-siRNA进行了甲基化修饰。本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank中获得Epo基因的cDNA序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对Epo基因设计了长度为21个核苷酸的siRNA，siRNA的3’端有两个脱氧核糖核昔酸(dTdT)呈单链悬挂状态，并对siRNA进行了甲基化修饰，以此增强siRNA在体内和体外对核酸酶(RNase)的耐受性。本发明中所使用的siRNA系由本发明人自行设计、委托武汉Biomi c公司通过化学法合成的。作为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA的优选实施方式，所述药物Epo-siRNA的反义链的5’端为A/U，所述反义链的5’端的7个碱基中至少有5个A/U，所述药物Epo-siRNA的正义链的5’端为G/C，所述siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段。作为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA的优选实施方式，所述药物Epo siRNA的寡核苷酸序列为正义链5’GACCCUUCAGCUUCAUAUATT3’；反义链5’UAUAUGAAGCUGAAGGGUCTT3’。作为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA的优选实施方式，所述药物Epo-siRNA能够起到对Epo表达的沉默作用。利用5g/l的siRNA对激光诱导脉络膜新生血管小鼠进行玻璃体腔内注射。首先对视网膜铺片进行新生血管分析，结果表明，不对任何基因产生沉默作用的阴性对照-siRNA对小鼠激光诱导的脉络膜新生血管无明显抑制作用，而Epo-siRNA可以对其产生十分明显的抑制作用，说明Epo-siRNA能够起到对Epo表达的沉默作用，从而抑制Epo信号通路并进一步减少脉络膜新生血管的发生。作为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA的优选实施方式，所述药物Epo-s iRNA对Epo基因的mRNA表达具有抑制作用。采用实时定量PCR(realtime-PCR)法检测Epo-siRNA对Epo mRNA的影响。用siRNA对激光诱导脉络膜新生血管小鼠进行玻璃体腔内注射后，提取脉络膜组织的mRNA，并进一步进行逆转录和realtime-PCR。结果显示，经Epo-siRNA注射后激光诱导新生血管的小鼠其脉络膜组织Epo基因的mRNA表达上升的趋势被明显抑制，而经阴性对照siRNA处理的则Epo基因的mRNA水平明显上升。作为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA的优选实施方式，所述药物Epo-siRNA对Epo蛋白水平具有抑制作用。用Western Blotting法检测Epo-siRNA的沉默作用。Western Blotting结果显示,经Epo-siRNA注射后激光诱导新生血管的小鼠其脉络膜组织Epo-siRNA对Epo蛋白水平的影响呈现明显的沉默作用。实验中对照组和给药组裸鼠的体重接近，且各组均无动物死亡。 另外，本发明还提供一种上述所述脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA在用于制备治疗脉络膜新生血管疾病的药物中的用途。优选地，所述脉络膜新生血管疾病包括黄斑变性、特发性脉络膜新生血管、病理性近视和血管样条纹。本发明所述脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA以RNA干扰为技术平台，提供了一种全新的脉络膜新生血管基因治疗药物，包括siRNA设计、脉络膜新生血管形态检测、mRNA和蛋白水平沉默效果检测等。所得的Epo-siRNA能够高效特异地降低靶mRNA和靶蛋白水平，抑制率达40%，有效抑制脉络膜新生血管的形成。因此，所述Epo-siRNA对AMD等脉络膜新生血管疾病的基因治疗有着广泛的应用前景。


图I为采用Western blot检测本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA对EPO蛋白的沉默作用时，三个激光诱导脉络膜新生血管的小鼠中左右眼分别注射Epo siRNA和阴性对照一周后Epo表达的情况。图2为对Epo siRNA和阴性对照Western blot定量分析的结果图。图3为本发明所述新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA对激光诱导的脉络膜/视网膜新生血管的抑制作用时，激光诱导脉络膜新生血管的小鼠中左右眼注射分别Epo siRNA和阴性对照一周后视网膜新生血管的情况。图4为对Epo siRNA和阴性对照视网膜新生血管面积定量分析的结果图。
具体实施例方式实施例IsiRNA设计从GenBank 中获得 Epo 基因序列，它在 GenBank 中的 AccessionNumber Epo (Acc.No. NM_007942. 2)。Epo siRNA设计同时满足以下四点设计原则，以便能够达到较高的基因沉默效果I. antisense 的 5，端为 A/U ；2. sense 的 5，端为 G/C ；
3. antisense的5’端的7个喊基中至少有5个A/U ；4. siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段。设计的Epo-siRNA寡核苷酸序列如下正义链5’GACCCUUCAGCUUCAUAUATT3’；反义链j’UAUAUGAAGCUGAAGGGUCTTS'，实验中采用的阴性对照siRNA序列为正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3’ ；
反义链 5’ ACGUGACACGUUCGGAGAATT3’。实施例2实验构建激光诱导的脉络膜新生血管小鼠模型取2-3月龄的C57BL/6小鼠，用复方托品酰胺滴眼液散瞳，全身麻醉，用532nm激光机(Quantel medical，VITRA，法国)和裂隙灯显微镜(Haag-Streit，BQ900，德国)进行光凝，用盖玻片将角膜压平片，就可以在裂隙灯下观察到小鼠眼底。在视乳头周围2个视盘直径处，3、6、9点钟位进行3个光凝，参数如下能量120mW，曝光时间O. ls，光斑直径75nm，以光凝时有气泡产生作为成功的标志。实施例3脉络膜铺片和新生血管面积的测量激光诱导一周后，断颈处死小鼠，摘除眼球，用30G针头前房穿刺降低眼内压，用显微剪剪除一小块角膜组织，置于4%多聚甲醛中固定2小时。在立体显微镜(Leica，MZ9. 5)下剪除眼前段，取出晶体，钝性分离视网膜和脉络膜，弃去脉络膜/巩膜，得完整视网膜。将视网膜进行Isolectin GS_IB4Alexa Flour488conjugate免疫荧光染色。荧光免疫体系总体积 25ul (O. 2mM MgC12 溶液 +0. 2%Triton X-IOO 溶液 +10ullug/ul IsolectinGS-IB4Alexa Flour488conjugate)于4°C摇床过夜。铺片操作在显微镜下载玻片上将视网膜成四个放射状切开，滴上适量封片剂盖上盖玻片。在荧光显微镜(Nikon，E80I，日本)下观察，照相，用图像分析软件Image J (NIH，美国)测量新生血管面积。实施例4玻璃体腔内注射siRNA:常规消毒，用左手协助打开小鼠眼睑，用30G针头在角巩缘穿刺后向视神经方向进针，退出后用显微注射器(Hamilton，美国)向玻璃体腔内注射Iul含0.5 5ug siRNA。处理眼注射EPO-siRNA，对侧眼注射等量的阴性对照siRNA。实施例5Real Time PCR 检测 siRNA 沉默从视网膜、脉络膜组织中使用Nucleo Spin试剂盒(Clontech)提取总RNA,使用 SuperScript III First Strand Synthesize System (Invitrogen)逆转录为 cDNA,用 Qiagen QuantiTect SYBR Green 试剂盒进行 Real Time PCR 反应，所用的 RT-PCR 仪为Bio-Rad iQ5。以β-actin(Actb)采用的引物如下表。RT-PCR反应的参数如下第一个循环 50°C 2min,95°C 15min,随后进行 35 个循环，94°C 15 秒，58°C 30 秒，72°C 30 秒。反应结束后所得Epo siRNA和对阴性对照siRNA组数据的cycle threshold(CT)值，采用Λ ACT
相对定量方法，按照以下公式计算Epo表达量的改变。
权利要求
1.一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物Ep0-SiRNA,其特征在于，所述药物Epo-siRNA是以RNA干扰技术为基础，从GenBank中获得Epo基因的cDNA序列、根据siRNA靶序列选择的基本原则、针对Epo基因设计的长度为21个核苷酸的siRNA，所述药物Epo-siRNA的5’端有两个脱氧核糖核苷酸为单链悬挂状态，所述药物Epo-siRNA进行了甲基化修饰。
2.如权利要求I所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，其特征在于，所述药物Epo-siRNA的反义链的5’端为A/U，所述反义链的5’端的7个碱基中至少有5个A/U，所述药物Epo-siRNA的正义链的5’端为G/C，所述siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段。
3.如权利要求2所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，其特征在于，所述药物Epo siRNA的寡核苷酸序列为正义链5’ GACCCUUCAGCUUCAUAUATT3’ ； 反义链5’ UAUAUGAAGCUGAAGGGUCTT3’。
4.如权利要求I所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，其特征在于，所述药物Epo-siRNA能够起到对Epo表达的沉默作用。
5.如权利要求I所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，其特征在于，所述药物Epo-siRNA对Epo基因的mRNA表达具有抑制作用。
6.如权利要求I所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，其特征在于，所述药物Epo-siRNA对Epo蛋白水平具有抑制作用。
7.如权利要求I所述的新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA在用于制备治疗脉络膜新生血管疾病的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述脉络膜新生血管疾病包括黄斑变性、特发性脉络膜新生血管、病理性近视和血管样条纹。
全文摘要
本发明公开一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA，所述药物Epo-siRNA是以RNA干扰技术为基础，从GenBank中获得Epo基因的cDNA序列、根据siRNA靶序列选择的基本原则、针对Epo基因设计的长度为21个核苷酸的siRNA，所述药物Epo-siRNA的5’端有两个脱氧核糖核苷酸为单链悬挂状态，所述药物Epo-siRNA进行了甲基化修饰。本发明所述Epo-siRNA能够高效特异地降低靶mRNA和靶蛋白水平，抑制率达40%，有效抑制脉络膜新生血管的形成。另外，本发明还公开了所述脉络膜新生血管基因治疗药物Epo-siRNA在用于制备治疗脉络膜新生血管疾病的药物中的用途。
文档编号A61P27/02GK102872464SQ201210396470
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者陈浩宇, 陈建欢, 张铭志, 彭智培 申请人:汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心