技术领域
本发明涉及从大豆中分离并制备小分子肽提取物及其化妆品组合物，具体地，涉及主要含有从大豆饼中分离的小分子肽提取物，从而具有抗氧化及抗老化功效的化妆品组合物。
背景技术：
活性氧是由于体内酶系统、还原代谢、化学药品、公害物质及光化学反应等各种物理、化学及环境因素而生成的，对细胞构成成分如脂质、蛋白质、糖及DNA等产生非选择性的、非可逆的破坏作用，引起细胞老化或癌症等各种疾病。而且这些活性氧导致的脂质过氧化产生的脂质过氧化物等多种体内过氧化物也对细胞产生氧化破坏而导致各种功能障碍，从而成为各种疾病的病因。因此，能够消除这些自由基的自由基清除剂（freeradicalscavengers）或过氧化生成抑制物等抗氧化剂被期待作为上述氧化物导致的老化及各种疾病的抑制剂或治疗剂。
人类的皮肤随着年龄的增长由于各种内在、外在因素而经历变化。即，内在因素有调节新陈代谢的各种荷尔蒙分泌减少、免疫细胞功能和细胞活性下降而导致人体必需的免疫蛋白及人体构成蛋白的生物合成减少，外在因素有由于臭氧层的破坏而导致太阳光线中到达地表的紫外线含量增加、环境污染越来越严重导致自由基及活性有害氧等增加，从而不仅导致皮肤厚度减少、皱纹增加、弹性减少，还导致皮肤气色灰暗、皮肤过敏经常发生、黑斑和雀斑及老年斑增加等变化。
随着老化的进行，由于自由基及活性有害氧引起的氧化应激的影响，出现构成皮肤的物质胶原蛋白、弹力蛋白、透明质酸及糖蛋白的含量及排列发生变化或减少等症状。此外，由于老化的进行或者紫外线，构成皮肤的大部分细胞中，生成已知为引起炎症的致炎细胞因子（proinflammatorycytokine）的环氧合酶-2（Cox-2,cyclooxygenase）的生物合成增加，由这些炎症因子引起的分解皮肤组织的基质金属蛋白酶（MMP，Mztrixmetalloproteinase）的生物合成增加，iNOS（诱生型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase））引起的NO（一氧化氮（nitricoxide））的生成增加。即，自然进行的内在老化引起的细胞活性减少及微炎症而导致基质物质的生物合成减少，多种有害环境引起的应激增加及太阳光线引起的活性氧簇增加等外在因素导致皮肤分解及变形加速而皮肤基质受到破坏变薄，出现皮肤老化的各种症状。从而，人们对能够防止、改善这些老化现象的活性成分进行很多研究。
肽是多种氨基酸通过肽键结合而形成的聚合物，通常由2-50个氨基酸结合，分子量为10000Da（道尔顿（dalton））以下。寡肽（oligopeptide）是指氨基酸数为10个以下的肽，其中，小分子大豆肽由于溶解度高、几乎没有酸碱引起的沉淀物、在水溶液中的粘度低而作为健康食品的材料得到应用。特别是分子量在1,000Da以上的寡肽被报道能够与小肠内的胆酸及胆固醇结合而排出，而具有降低血清胆固醇浓度的效果和抗肿瘤、抗高血压、免疫增强等生理活性功能，但是还没有有关皮肤抗氧化和抗老化的效果的报道。
技术实现要素：
发明目的
为了解决上述问题，本发明的发明人在为了制备含有从大豆中分离得到的对皮肤安全，抗氧化、抗老化效果优异，产品稳定性优异的小分子肽的抗氧化及抗老化的化妆品而进行研究的过程中，发现对大豆饼进行提取后进行过滤及热处理后通过离心分离而制备的提取物的小分子肽的含量高，且抗氧化效果及抗老化效果非常优异，从而完成了本发明。
从而，本发明的目的在于提供包括如下步骤的小分子肽含量增加的大豆肽提取物的制备方法，该方法包括大豆饼的提取步骤；对上述步骤的提取物进行过滤后进行热处理的步骤；对上述步骤的热处理的提取物进行离心分离的步骤。
本发明的另一目的在于，含有通过上述制备方法提取的源自大豆的小分子肽提取物的皮肤抗氧化及抗老化效果优异的化妆品组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包括如下步骤的小分子肽含量增加的大豆肽提取物的制备方法，该方法包括大豆饼的提取步骤；对上述步骤的提取物进行过滤后进行热处理的步骤；对上述步骤的热处理的提取物进行离心分离的步骤。此外，本发明还提供含有上述提取物作为有效成分的化妆品组合物。
有益效果
根据本发明的源自大豆饼的小分子肽提取物因DPPH氧化抑制能力优异而具有抗氧化效果，显示出促进原骨胶原的生成和抑制胶原酶表达的效果，通过这两种活性的复合上升作用，具有优异的皮肤皱纹改善效果及抗老化效果。
附图说明
图1是大豆提取物中含有的蛋白质的大小的图谱。
图2是大豆饼提取物中含有的蛋白质的大小的图谱。
图3是源自大豆饼的小分子肽提取物中含有的蛋白质的大小的图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种化妆品组合物，该化妆品组合物含有源自大豆饼的小分子肽提取物作为有效成分。
本发明中所述大豆饼由选自大豆、青仁黑豆（黑大豆）（Glycinemax(L.)Merr.）、鼠目太豆（RhynchosiaNulubilisLoureiro）、红豆（Phaseolusangularis(Willd.)W.Wight）、绿豆（Vignaradiata(L.)Wilczek）、豇豆（VignasinensisKing）、豌豆（PisumsativumL.）、龙牙豆（Phaseolusvulgarisvar.humilis）、蚕豆（ViciafabaL.）及刀豆（CanavaliagladiataDC.）组成的组中的一种以上的豆制备而成。
本发明的小分子肽可以使用分子量为100Da以上、3000Da以下的小分子肽，优选100Da以上、1000Da以下的小分子肽。
本发明的化妆品组合物，以组合物总重量为基准，含有0.0001-30重量%的源自大豆饼的小分子肽提取物。如果含量不足0.0001重量%，无法得到所述提取物带来的抗氧化及抗老化效果；如果含量超过30重量%，随含量增加的效果增加不明显。
本发明的源自大豆饼的小分子肽提取物，以提取物总重量为基准，含有10-30重量%的小分子肽。
本发明中的大豆饼可以通过本领域通常使用的方法制备，具体说明为，将大豆水洗后浸泡一晚泡发，然后边添加水边用石磨或粉碎机粉碎。粉碎的大豆中添加大豆体积3-4倍的水，在100-105℃加热15分钟后，过滤去除大豆油得到大豆饼。
本发明所使用的源自大豆饼的小分子肽提取物通过包括如下步骤的方法制备：
1）大豆饼中添加提取溶剂进行搅拌提取的步骤；
2）将上述步骤1）得到的大豆饼提取物过滤后进行热处理的步骤；及
3）将上述步骤2）得到的提取物进行离心分离的步骤。
本发明中步骤1）的提取溶剂可以使用水或有机溶剂，具体地，可以使用选自纯化水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷及己烷组成的组中的一种或两种以上。
步骤1）的提取温度优选10-80℃，提取6-24小时。超过所述提取温度及提取时间会导致提取效率降低或发生成分的变化。
步骤2）中的过滤可以使用精密过滤、超滤、纳米过滤、反渗透过滤膜过滤等本领域通常的方法，优选使用微孔过滤。
步骤2）中的热处理优选在80-120℃进行，低于80℃提取效率下降，高于120℃导致成分发生变化或破坏有效成分。
通过上述方法制备的含有源自大豆饼的小分子肽提取物的化妆品组合物可通过DPPH氧化抑制实验来确认具有抗氧化效果，具有促进原骨胶原生成和抑制胶原酶表达的效果，通过这两种活性的复合上升作用，提供优异的皮肤皱纹改善效果。
以下通过实施例及实验例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于这些例子。
实施例
实施例1源自大豆饼的小分子肽提取物的制备
将用大豆制备的大豆饼1kg和纯化水3L添加到容器中进行混合搅拌。然后将得到的混合物通过过滤布过滤分离残渣和滤液，分离的滤液进行减压浓缩。浓缩的提取物在100℃进行20分钟的热处理，将热处理后的产物通过离心分离残渣和滤液。将得到的滤液进行干燥，得到12g源自大豆饼的小分子肽提取物。
对比例1大豆提取物的制备
将大豆1kg和纯化水3L添加到容器中进行混合搅拌。然后将得到的混合物通过过滤布过滤将残渣和滤液进行分离，将分离的滤液进行干燥，从而得到大豆提取物112g。
对比例2大豆饼提取物的制备
将用大豆制造的大豆饼1kg和纯化水3L添加到容器中进行混合搅拌。然后将得到的混合物通过过滤布过滤将残渣和滤液进行分离，将分离的滤液进行干燥，从而得到大豆饼提取物60g。
实验例1实施例1、对比例1-2的提取物的蛋白质大小差异
利用Maldi-Tof分析上述实施例1和对比例1-2中制备的提取物的蛋白质大小差异，并将其结果在图1-3中示出。
如图1-3的结果所示，可以确认对比例1的大豆提取物中的蛋白质质量集中于6900-8380m/z，大豆饼提取物中的蛋白质质量大概集中于1459、5100及7800m/z，相比于此，源自大豆饼的小分子肽提取物中的蛋白质质量集中于500-100m/z，蛋白质质量小的小分子肽含量为10-30重量%。由此可以确认通过本发明的方法可以得到含量高的小分子肽提取物。
实验例2抗氧化效果实验（DPPH测试）
上述实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物及对比例1-2的天然物提取物的DPPH氧化抑制效果与水溶性维生素E进行比较而测定。
使用通过有机自由基DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)）的还原（抗氧化剂氧化）而发生的吸光度的变化来评价抗氧化能力的方法。测定上述获得的实施例1及对比例1-2的提取物的DPPH的氧化被抑制而吸光度相比对照组减少的程度，将相比对照组的吸光度显示出50%以下的吸光度的浓度作为有效抗氧化浓度来进行评价。
加入100μM（在乙醇中）DPPH溶液190μl和上述获得的实施例及对比例和对照样品各10μl制备反应液，在37℃下反应30分钟后，在540nm测定吸光度。对照样品使用了广泛使用的合成抗氧化剂水溶性维生素E（Trolox）。各物质的DPPH分析结果在下表1中示出，IC50表示添加的样品的吸光度减少50%时的样品浓度。
表1
DPPH分析结果（抑制％）
如上表1所示，本发明实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物相比对比例1的大豆提取物及对比例2的大豆饼提取物，抗氧化能力更优异。
实验例3胶原酶表达抑制效果测定
上述实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物及对比例1-2的天然物提取物的胶原酶表达抑制能通过与生育酚及EGCG进行比较测定。胶原酶的表达程度越低胶原酶的表达抑制能越高，皮肤内的胶原蛋白的分解少，因此生成的皱纹的量也变少。另外，生育酚及EGCG作为抗氧化物质，是已知为具有使皮肤表皮细胞再生而防止皮肤老化的功能的物质。
在含有2.5%胎牛血清的DMEM（密理博高糖培养基（Dulbecco’sModifiedEagle’sMedia））培养基的96孔微量滴定板（96-wellmicrotiterplate）中以5,000细胞/孔添加人成纤维细胞，培养至生长到90%。此后在无血清DMEM培养基中培养24小时后，使用溶解在无血清DMEM培养基中的所述对比例1-2及实施例1、生育酚及EGCG以10-4摩尔浓度处理24小时后，采集细胞培养液。
所采集的细胞培养液利用商业上可利用的胶原酶测定仪器（美国AmershamPharmacia公司）测定胶原酶生成程度。首先将均匀涂布有1代胶原酶抗体的96孔板（96-wellplate）中加入所采集的细胞培养液，在恒温槽中进行抗原-抗体反应3小时。
3小时后将结合有发色段的2代胶原蛋白抗体添加到96孔板中再反应15分钟。15分钟后，加入发色物质在室温下发色15分钟，再加入1M硫酸停止反应（发色），反应液呈黄色，根据反应进行的程度黄色的程度不同。
利用吸光机在405nm处测定呈黄色的96孔板的吸光度，通过下列数学式1计算出胶原酶的合成程度。此时，将组合物没有进行处理的组中所采集的细胞培养液的反应吸光度作为对照组。即，将未处理组的胶原酶表达程度设为100，求出相比于此的组合物处理组的胶原酶的表达程度，将其结果在表2中示出。
数学式1
胶原酶表达程度（%）=（上述物质处理的细胞组的吸光度/对照组的吸光度）×100
表2
如上表2所示，可以确认本发明实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物能够抑制离体（invitro）胶原酶的表达。此外，还可以确认本发明实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物的胶原酶表达抑制能力比已知为抗氧化物质的生育酚优异。
实验例4原骨胶原生成促进效能实验
将上述对比例1的大豆提取物、对比例2的大豆饼提取物及实施例1获得的源自大豆饼的小分子肽提取物的原骨胶原生成能力与维生素进行比较测定。原骨胶原是胶原蛋白生成诱导物质，是胶原蛋白生成和防老化中所必需的物质，原骨胶原的生成程度越高，胶原蛋白的生成程度越高，从而能够防止皮肤皱纹的生成。此外，维生素C已知为胶原蛋白合成中所必需的成分。
在含有2.5%胎牛血清的DMEM（Dulbecco’sModifiedEagle’sMedia）培养基的96孔微量滴定板中以5,000细胞/孔添加人成纤维细胞，培养至生长到90%。此后在无血清DMEM培养基中培养24小时后，使用溶解在无血清DMEM培养基中的所述对比例1-2及实施例1、维生素C以10-4摩尔浓度处理24小时后，采集细胞培养液。24小时后，使用原骨胶原1型C-肽诊断试剂盒（procollagentype-1C-peptideEIAkit）（MK101，Takara，Japan）测定培养基中的游离的原骨胶原的量。
测定结果通过下列数学式2来计算出原骨胶原的生成程度，此时组合物未处理的组中采集的原骨胶原生成程度作为对照组。即，未处理组的原骨胶原生成程度设为100，求出相对于此的组合物处理组的原骨胶原的生成程度，其结果在表3中示出。
数学式2
原骨胶原生成程度（%）=（上述物质处理的细胞组的原骨胶原的量/对照组的原骨胶原的量）×100
表3
如表3所示，可以确认实施例1的源自大豆饼的小分子肽提取物促进离体原骨胶原的生成。