专利名称：一种叶酸受体靶向肿瘤的ct成像分子探针的制备方法
技术领域：
本发明属于CT分子成像技术领域，涉及一种叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤是一种常见的严重危害人类健康的疾病，目前已成为人类死亡的主要原因之一。近年来，随着经济和科技的发展，人们的生存环境和生活习惯日益改变，肿瘤已经成为世界范围内危害人类健康的难题并且其发病率呈上升趋势。与发达国家相比，我国的恶性肿瘤死亡率要高于世界平均水平。诊断的早晚决定了病人治愈的几率，据大量临床数据统计，早期发现的恶性肿瘤的五年生存率可达90%以上，而晚期发现的只有20%左右。大部分恶性肿瘤在早期没有任何症状，等出现了典型症状与体征时，往往已属中晚期而贻误·了治疗的时机。因此如果能够实现恶性肿瘤的早期诊断，精确了解恶性肿瘤的位置、大小和有无转移对于肿瘤的准确分期和治疗是十分必要的，将在很大程度上提高肿瘤的治愈率。因此，肿瘤的早期检测和治疗已成为各国科学家关注的热点。要实现肿瘤的早期诊断和治疗，首先要寻找活细胞内的肿瘤标志物，通过对肿瘤标记物进行标记，再进行成像获得相关信息。由于叶酸受体(FolicAcid Receptor FR)在多数肿瘤细胞膜表面，比如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌和鼻咽癌等，过度表达，通常比正常细胞高出20-200倍。而且，由于叶酸靶向的肿瘤诊断和治疗有对肿瘤细胞亲和力高，在体内循环时间长(5-20h)，在正常组织中可以很快被清除等优点，叶酸受体通常被作为叶酸药物复合物的靶目标实现对过表达FR的肿瘤的显像和治疗。近年来，随着纳米技术的飞速发展，纳米材料在生物医学工程领域的应用研究已成为一个很有生命力的新方向。由于纳米微粒尤其是纳米金具有易控的表面化学能力，独特的光学性质以及局域场增强效应等特性，其在生物组织成像、癌症的诊断和治疗方面受到了广泛重视。CT成像图像采集时间短、空间分辨率高(50-200 μ m)，可整体成像、费用低廉，就可用性、效率和成本等多方面考虑，CT是临床上最有效的诊断工具之一。现有的含碘CT造影剂能够有效吸收X射线，但在体内仅有很短的留存时间即被肾脏清除，成像时间短(15分钟以内)。而且本身可修饰性差，很难与肿瘤标记物耦合，不具备靶向性。此外，含碘造影剂对肾脏存在毒性，血管渗透压高。纳米金与之相比，具有更高的X射线衰减能力，体内循环时间长，并且很容易和生物分子结合，可以靶向肿瘤细胞。目前制备叶酸包被的纳米金也有一些方法，比如，Wang等(Li GP, Li D, ZhangLXj Zhai JFj Wang EKj one-stop synthesis of Folic Acid protected GoldNanoparticlesand Their Receptor-Mediated Intracellular Uptake,Chem. Eur. J. , 200915:9868-9873)报道了一种在温和条件下，以叶酸为还原剂制备纳米金颗粒，并具有一定的优点。但这种方法制备使用时较长。孙莉萍等人(孙莉萍，赖友群，张召武，马燕燕，贾静，叶酸受体靶向型纳米金颗粒的合成方法，发明专利CN: 102029401)利用微波加热法制备叶酸包裹的纳米金颗粒。但这种方法需要特殊的微波设备。上述的两种方法所制备的粒径都不均匀，而且没有验证是否可以应用于CT成像。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针的制备方法，制备出作为靶向肿瘤探针的叶酸包裹的纳米金粒子。本发明是通过以下技术方案来实现一种叶酸包被的纳米金的制备方法，包括以下步骤I)以叶酸为包裹剂，将叶酸溶解于用于制备纳米金的含有金离子的溶液中，并调节其pH为7. O 7. 5，得到混合溶液，其中叶酸与金离子的摩尔比为1:5 10 ; 2)向混合溶液中加入还原剂，然后快速搅拌反应至少lh，反应结束后自然冷却，透析去除未反应的部分，得到叶酸包被的纳米金。所述的用于制备纳米金的含有金离子的溶液为氯金酸溶液。将叶酸溶于水，加热搅拌，使叶酸溶解之后，再加入到含有金离子的溶液中。所述的混合溶液中叶酸的浓度为O. 08 O. 24mmol/L,金离子的浓度为O. 4 1.5mmol/L。所述的还原剂为硼氢化钠，硼氢化钠与金离子的摩尔比为520:4 15。所述向混合溶液中加入还原剂,然后快速搅拌反应2 3h,搅拌速度为1000 1500转/分。所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所述的透析其透析截流分子量大于50(Tl000D的物质，透析6 12小时。所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所制备的叶酸包被的纳米金的粒径为3 5nm，在质量浓度为3. 5%NaCl溶液中和25000r/min离心下均不会发生聚沉。所述的叶酸包被的纳米金的制备方法在制备叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针中的应用。所制备的叶酸包被的纳米金作为叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的叶酸包被的纳米金的制备方法，以叶酸为稳定剂和包裹剂，以硼氢化钠为还原剂，简单快捷地制备出叶酸包裹的纳米金粒子(folic acidcoatd goldnanoparticles, FA-GNPs)作为祀向肿瘤探针。这种纳米探针粒径分布在3_5nm之间,体系均一、稳定，而且在高盐环境(3. 5%NaCl溶液)和高速离心(25000rpm)下均不会发生聚沉，而且对X射线具有强吸收，能够靶向肿瘤细胞并且可以对肿瘤进行清晰成像。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs，通过FA-FR特异性结合到!fepG2细胞表面，而GNPs在30min内未能结合到MR-90细胞表面。HepG2细胞表面大量表达FR，而IMR-90细胞表面基本不表达FR，表明所制备的FR-GNPs对肿瘤细胞表面表达的FR存在靶向性。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs，对X射线具有较高的衰减能力，可以作为CT成像造影剂；FA-GNPs能够为肿瘤提供高对比度的CT成像。
图1-1为FA-GNPs TEM照片，图1-2为FA-GNPs的粒径分布图；图2-1 为 FA-GNPs 的 XPs 全谱图；图2-2为FA-GNPs中各元素的XPS分谱，其中A为Au4f、B为Cls、C为Nls、D为Ols ；图3-1为FA-GNPs和H印G2细胞培养30分钟后的电镜照片；图3-2为GNPs和H印G2细胞培养30分钟后的电镜照片；图4为添加有FA-GNPs的培养液在HepG2细胞培养前后吸光度值变化图； 图5-1为图5-2中各FA-GNPs的不同浓度分布；图5-2为对应的FA-GNP不同浓度的FA-GNPs CT成像(反色处理)；图5-3为不同浓度FA-GNPs的CT值曲线；图6为裸鼠背部大腿两侧分别种植宫颈癌肿瘤的照片；图7为裸鼠从尾到头不同横截面的CT成像，视图左侧为R，右侧为L，裸鼠摆放时左倾；箭头所指处为注射过FA-GNPs的H印G2肿瘤组织。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1一种叶酸包被的纳米金的制备方法，包括以下步骤称取FA O. 0018g,溶于50mL超纯水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此时FA与HAuCl4的摩尔比为1:6，放置在加热搅拌器上，搅拌5min以上(具体时间不要求，混匀即可)采用浓度为IM和O.1M的NaOH溶液调节体系pH值至7. 4左右，此时溶液恰好呈现亮黄色，FA全部溶解。称取O.1g NaBH4,溶于2mL超纯水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈现出深酒红色，并快速搅拌2小时，搅拌速度为1200转/分左右。自然冷却后，将获得的样品在超纯水中(透析截流分子量大于500D的物质)12小时，去除未反应的分子，即获得叶酸包被的纳米金探针，把制备好的样品放入4°C冰箱保存。实施例2一种叶酸包被的纳米金的制备方法，包括以下步骤称取FA O. 0026g,溶于50mL超纯水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此时FA与HAuCl4的摩尔比为1:4，放置在加热搅拌器上，搅拌5min以上(具体时间不要求，混匀即可)采用浓度为IM和O.1M的NaOH溶液调节体系pH值至7. 2左右，此时溶液恰好呈现亮黄色，FA全部溶解。称取O. 12g NaBH4,溶于2mL超纯水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈现出深酒红色，并快速搅拌2小时，搅拌速度为1500转/分左右。自然冷却后，将获得的样品透析12小时，去除未反应的分子，即获得叶酸包被的纳米金探针，把制备好的样品放入4°C冰箱保存。实施例3
一种叶酸包被的纳米金的制备方法，包括以下步骤称取FA O. 0053g,溶于50mL超纯水中，滴加ImL 1%的HAuC14溶液，此时FA与HAuCl4的摩尔比为1:2，放置在加热搅拌器上，搅拌5min以上(具体时间不要求，混匀即可)采用浓度为IM和O.1M的NaOH溶液调节体系pH值至7. 5左右，此时溶液恰好呈现亮黄色，FA全部溶解。称取O. 13g NaBH4,溶于2mL超纯水中，冷置于冰水混合物中。FA和HAuCl4混合液中快速滴加NaBH4溶液，溶液均呈现出深酒红色，并快速搅拌3小时，搅拌速度为1000转/分左右。自然冷却后，将获得的样品透析12小时，去除未反应的分子，即获得叶酸包被的纳米金探针，把制备好的样品放入4°C冰箱保存。本发明所制备的纳米粒子通过电子显微镜观测，发现其粒径分布均一，在3 5nm之间，如图1所示。 通过X射线电子能谱测量了纳米金与叶酸的结合情况，如图2-1、2_2所示。图2-1为FA-GNPs的XPS全谱，结合能在80-90、280-290、395-405和530_540eV处的波峰分别由Au 4f、C Is、N Is 和 O Is 产生的。图2-2 (B)中C-H键的结合能实际测得为283. 15，与标准值相差1. 65，因此整个能谱的结合能按+1. 65进行校准。图2-2 (A)中结合能在84. 09和87. 09eV有两个峰，均由AuO产生，分别为Au 4f7/2和Au 4f5/2，表明体系中存在Au3+被还原；图2_2 (C)中结合能在399. 12和400. 82eV的波峰由Nls产生，分别为-NH2和-OCONH中的N元素，均由FA提供；图2-2 (D)中结合能在531. 78,533. 00和534. 61eV处的波峰可能分别由-0H、_C00H和-OCNH-产生。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs具有肿瘤细胞靶向特性。将FA-GNPs和GNPs分别与HepG2细胞共同培养，为了防止出现FA与FR发生竞争性结合，细胞培养体系(尤其是细胞培养液)均未带入FA。30min以后，用PBS洗去多余的FA-GNPs，通过银染增强使结合在HepG2表面的FA-GNPs表面形成银壳。将银染后的细胞经戊二醛固定后送扫描电镜观察，如图3-1、3-2所示。图3-1、3-2为分别与FA-GNPs和GNPs培养30min后的H印G2细胞的电镜照片，图3-1中细胞上吸附着大量的白色物质，而图3-2的细胞上基本没有，认为这些白色物质为包被银壳的FA-GNPs。同时样本做电镜前处理前已经过PBS溶液多次清洗，基本去除未结合的FA-GNPs和GNPs，而视野的干净整洁，排除银颗粒吸附的可能性。因此可以得出结论=FA-GNPs通过FA-FR特异性结合到!fepG2细胞表面，而GNPs在30min内未能结合到IfepG2细胞表面。HepG2细胞表面大量表达FR，而MR-90细胞表面基本不表达FR，证明本发明制备的FR-GNPs对肿瘤细胞表面表达的FR确实存在靶向性。FA-GNPs添加到细胞培养液一段时间后，FA-GNPs通过FA-FR的特异性结合结合到HepG细胞表面，细胞培养液中的FA-GNPs含量减少，524nm处的吸光度值较培养前大幅降低(见图4)。吸光度值的降低在此称之为相对吸光度值(Λ A)，可以间接、定性的表示FA-GNPs与H印G2细胞结合的数量多寡。其中，524nm处H印G2细胞培养前吸光度值为O. 63508 ;细胞培养后为O. 40961，Λ A=O. 22647，从侧面说明大量FA-GNPs已与!fepG2细胞结合。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs对X射线具有较高的衰减能力，可以用其作为CT成像造影剂。图5-1 5-3直观反映FA-GNPs对X射线的衰减能力随着浓度的增大而增强，而纯水的CT值为O，故图5-2中未现纯水对应的黑点。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs可以进行在体肿瘤CT成像。首先建立动物肿瘤模型，在小鼠的尾部左右侧均种植宫颈癌肿瘤，待肿瘤长大Icm左右进行在体实验，如图6所示。实验中在裸鼠的一侧肿瘤注射200 μ L260mg Au/mL的FA-GNPs，另一侧注射200 μ L PBS溶液(见图7)，进行CT扫描成像。图7 (Α L)为裸鼠从尾到头不同横截面的CT成像，左右方向与裸鼠照片镜像。图7 (D F)中箭头所指处为注射有FA-GNPs的!fepG2肿瘤区域，可见该区域高对比度，与骨骼亮度无异，而对侧对照组与软组织无法区分。两者 对比显而易见FA-GNPs能够为肿瘤提供高对比度的CT成像。
权利要求
1.一种叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)以叶酸为包裹剂，将叶酸溶解于用于制备纳米金的含有金离子的溶液中，并调节其 pH为7. O 7. 5，得到混合溶液，其中叶酸与金离子的摩尔比为1:2 6 ;2)向混合溶液中加入还原剂，然后快速搅拌反应至少lh，反应结束后自然冷却，透析去除未反应的部分，得到叶酸包被的纳米金。
2.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所述的用于制备纳米金的含有金离子的溶液为氯金酸溶液。
3.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，将叶酸溶于水，加热搅拌，等叶酸完全溶解之后，再加入到含有金离子的溶液中。
4.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所述的混合溶液中叶酸的浓度为O. 08 O. 24mmol/L,金离子的浓度为O. 4 1. 5mmol/L。
5.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所述的还原剂为硼氢化钠，硼氢化钠与金离子的摩尔比为520:4 15。
6.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，向混合溶液中加入还原剂，然后快速搅拌反应2 3h，搅拌速度为1000 1500转/分。
7.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所述的透析其透析截流分子量大于50(Tl000D的物质，透析6 12小时。
8.如权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法，其特征在于，所制备的叶酸包被的纳米金的粒径为3 5nm，在质量浓度为3. 5%NaCl溶液中和25000r/min离心下均不会发生聚沉。
9.权利要求1所述的叶酸包被的纳米金的制备方法在制备叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针中的应用。
10.权利要求1所制备的叶酸包被的纳米金作为叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针的应用。
全文摘要
本发明公开了一种叶酸受体靶向肿瘤的CT成像分子探针的制备方法，以叶酸为包裹剂，将叶酸溶解于用于制备纳米金的含有金离子的溶液中，并调节其pH为7.0～7.5，得到混合溶液，其中叶酸与金离子的摩尔比为1:2～6；向混合溶液中加入还原剂，然后快速搅拌反应至少1h，反应结束后自然冷却，透析去除未反应的部分，得到叶酸包被的纳米金。本发明所制备的叶酸包被的纳米金FA-GNPs，对X射线具有较高的衰减能力，可以作为CT成像造影剂；FA-GNPs能够为肿瘤提供高对比度的CT成像。
文档编号A61K49/04GK102989015SQ20121052841
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者姚翠萍, 张镇西, 杨洋, 郭佑民, 张少娟, 董艳花, 王晶, 梅建生 申请人:西安交通大学