一种治疗癌症的复合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种治疗癌症的复合物，由钙盐和化疗药物阿霉素混合而成，钙盐与阿霉素重量比为5000∶1～20000∶1，优选为10000∶1，所述的钙盐可以是氯化钙。该复合药能增加化疗药物的抗癌效果，增强化疗药物对癌细胞抑制以及促凋亡坏死作用，但不会增加化疗药物对正常细胞的杀伤。
【专利说明】一种治疗癌症的复合物
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，涉及治疗癌症的药物。
【背景技术】
[0002]肝癌发病率高、进展快、恶性程度高[1]，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率在全世界范围内位居第五[2’3]。目前在中国，肝癌是第2大常见恶性肿瘤，位于癌症死因顺位的第二位，每年约有36万新发癌症患者，而每年有大约35万患者死于肝癌，严重威胁人们的健康[4]。据2000年世界卫生组织的统计数据，全世界每年新发肝癌病例约56万例，其中大部分为亚洲患者，而我国的发病数占亚洲总数的2/3以上，为肝癌高发区。肝癌患者若未能接受治疗，预后很差，I年生存率仅为29%，因此肝癌被称为“癌中之王”。
[0003]最近二三十年，肝癌的诊治取得了较大的进展，涌现许多新的治疗技术，包括外科采用的肝切除术、肝移植术和肝动脉栓塞化疗术等。对于可以手术治疗的患者，应优先选用手术治疗，然而在临床工作中，80%原发性肝癌在确诊是已存在肝内播散、远处转移或伴严重的肝硬化，不能手术治疗，此时，系统性化疗在内的非手术疗法可以提高患者的生活质量或延长生存期。全身性化疗由于其副作用大，效果不理想，临床应用受限，目前以局部化疗常用，包括经导管肝动脉栓塞化疗(TACE)，手术肝动脉置管(HAI)和/或门静脉置管(PVI)化疗，腹腔化疗等。
[0004]化疗是肝癌治疗的重要手段之一，单药化疗包括蒽环类抗瘤药、氟尿嘧啶类、喜树碱、钼类、吉西他滨等，但自上世纪50年代以来，单药治疗有效率不高于20 %，目前肝癌化学治疗还没有很有效的方法[5]，现在一般不提倡单独应用。如阿霉素(ADM)为最早开发的蒽环类药物，是目前临床应用最多的肝癌化疗药物之一，其治疗HCC的有效率仅为16%，且毒副反应相当的严重[6]。目前多采用联合化疗方案，如以ADM(E-ADM)和/或PDD为基础的联合方案；以E-ADM PDD和5-FU组成的ECF方案；还有以L-OHP为主的联合方案如XELOX方案m及GDMOX方案M等。但是一些破坏性更大的联合化疗不仅不能提高疗效，反而会降低患者生存率[9]。化疗药物的低疗效一直是肝癌和其它癌症治疗的瓶颈。这主要是由于化疗药物的耐药性强和选择性差，化疗效果一直不理想[1°]。化疗药在杀死癌细胞的同时也杀死了正常细胞，导致病人难以忍受的副作用，预后也较差，严重影响病人的生活质量。目前对于肝癌的联合化疗效果依然没有很好的药物组合，寻找合适的药物组合在不增加药物对正常细胞毒副作用的情况下，提高化疗药物的治疗剂量是我们研究的目标。
[0005]研究报道阿霉素作用机制与钙离子有关，阿霉素扰乱钙离子稳态，引起线粒体钙离子超载[11]。钙离子是细胞内普遍存在的一种物质，参与调控细胞内许多的过程。细胞内静息状态的钙离子浓度为1ΟΟηΜ，细胞内外钙离子浓度相差大约20000倍[12]。在细胞膜上存在钙离子通道和钙泵，钙离子通过钙离子通道进入细胞，钙泵则是将胞内钙离子泵出细胞外。在细胞内部细胞质和细胞器之间也存在一个钙离子浓度梯度，如肌浆/内膜内质网，一个细胞内钙库，钙离子含量在100μΜ~500μΜ之间。内质网膜上含有丰富的钙离子转运蛋白将钙离子运进或运出内质网，内质网钙离子排空与细胞死亡有关。而线粒体，不同于内质网另一个钙离子承载体，钙离子容量要小的多，是个更敏感的钙离子调节体，线粒体钙离子的超载是细胞坏死和凋亡的启动子。钙离子信号产生于钙离子通道的释放或钙离子转运体的激活[13]。胞内外钙离子的平衡由胞内缓冲体系，泵和交换器共同维持着[14]。
[0006]过去几十年的研究，对于体外培养的单个细胞和细胞系不同条件下钙离子信号机制的研究已经很明确[15]。钙离子与肿瘤的关系越来越清晰，肿瘤细胞的转移、翻译、分化、细胞周期及细胞凋亡都受到钙离子的调控[16]。我们知道，即使是相对轻微的扰乱钙离子稳态，可以导致致命的后果，其调节是十分复杂且精密的，由细胞膜三个主要的膜相关蛋白钙离子通道、钙泵和交换器共同调控[17]，这些膜相关蛋白的同工酶负责胞内钙离子的降低和升高[18]，维持胞内外钙离子交流。
[0007]钙离子是细胞内重要的信号分子，在细胞增殖、分化、死亡过程中起着非常重要的作用[19]，研究表明，胞质及胞内细胞器钙离子浓度的改变会诱导细胞凋亡的发生[2°]。有研究报道，调控钙离子信号的通路和受体在癌细胞和正常细胞表达是有差异的，大量癌细胞表达改变的钙离子转运蛋白已经被发现，如典型的癌细胞转运蛋白PMCAs、SERCAs和一些钙离子通道等[21]，这方面的研究也日益广泛。这种差异性如果能有效利用到临床上，很可能为癌症的治疗开启新的篇章。某些癌细胞特异性通道和泵表达改变已经有报道，乳腺癌、结肠癌、肺癌这方面研究较多[22]。但是对于肝癌细胞的钙通道或钙泵是否改变少见报道，钙离子与阿霉素等化疗药物联和作用于肝癌细胞也没有人研究报道过。我们把氯化钙与阿霉素以特定比例混合而成的复合药物作用于两种细胞，看能否起到增效减毒作用。
【发明内容】
[0008]本发明的任务是提供一种治疗癌症的复合物，使其具有能增加化疗药物的抗癌效果，增强化疗药物对癌细胞抑制以及促凋亡坏死作用，且不会增加化疗药物对正常细胞的杀伤等特点，以解决上述联合化疗药物选择性差的问题，
[0009]实现本发明的具体方案是:
[0010]本发明提供的治疗癌症的复合物，由钙盐和化疗药物阿霉素混合而成，钙盐与阿霉素重量比为5000: I~20000: 1，优选为10000: 1，所述的钙盐可以是氯化钙。
[0011]本发明提供的治疗癌症的复合物能增加化疗药物的抗癌效果，增强化疗药物对癌细胞抑制以及促凋亡坏死作用，但不会增加化疗药物对正常细胞的杀伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:不同钙离子组HepG2细胞和L02细胞增值率
[0013]取对数生长期的细胞种于96孔板，放于5% CO2的37°C培养箱内培养24小时。用培养基稀释药物(对照DMEM、氯化钙组0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL)，加到培养板中，置于5 %CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。按公式计算相对光密度值以反映细胞的增殖率(增
值率(％ ) = (A实验组-Asm)/ (A 对照组_A空白组)X 100% )。
[0014]图2:复合药物选择性增强阿霉素对HepG2细胞的增殖抑制作用
[0015]取对数生长期的细胞种于96孔板，放于5% CO2的37°C培养箱内培养24小时。用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL，即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。按公式计算相对光密度值以反映细胞的增殖率(增值
率(％ ) = (A 实验组-Asm)/ (A 对照组_A空白组)X 100% )。
[0016]图3:钙离子选择性增强阿霉素对!fepG2的促凋亡作用
[0017]取对数生长期的细胞种于6孔板培养24小时。用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。加Annexin-V、PI染料孵育后，用流式细胞仪检测。
[0018]图4:钙离子选择性增强阿霉素对IfepG2的促坏死作用[0019]取对数生长期的细胞种于6孔板培养24小时。用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。加PI染料孵育后，用流式细胞仪检测。
[0020]图5:不同剂量药物处理L02细胞48h蛋白表达及灰度值比较
[0021]取对数生长期细胞培养24h。用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。收获细胞并提取总蛋白，蛋白变性后，电泳、转膜、一二抗孵育，最后加入ECL化学发光液，用荧光化学发光凝胶成像分析系统分析结果。
[0022]图6:不同剂量药物处理IfepG2细胞48h蛋白表达及灰度值比较
[0023]取对数生长期细胞培养24h。用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。收获细胞并提取总蛋白，蛋白变性后，电泳、转膜、一二抗孵育，最后加入ECL化学发光液，用荧光化学发光凝胶成像分析系统分析结果。
[0024]具体实施实例
[0025]实施例1不同钙离子组HepG2细胞和L02细胞增值率
[0026]1.用含10%小牛血清的DMEM培养基培养L02细胞和H印G2细胞，细胞传代后置含5% CO2的37°C培养箱内培养。
[0027]2.当细胞处于对数生长期时，每瓶加入胰酶(使细胞从瓶上脱离下来)500ul，摇动瓶子使胰酶与细胞充分接触，2分钟后，瓶中加入500ul小牛血清，终止胰酶的作用。
[0028]3.再向瓶中加入3ml培养基，用吸管将细胞从瓶上吹下，并把细胞悬液移入离心管,600g 离心 5min。
[0029]4.倒掉上清，加入新鲜培养基3ml，用吸管小心吹打，使细胞分散。
[0030]5.计数，以每孔5X103个细胞种于96孔板，每孔培养液(含10%小牛血清)为200ul，放入37°C、5% C02培养箱培养24小时。
[0031]6.用移液器弃去上清培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(PBS，PH = 7.4)洗两次，然后用培养基稀释氯化|丐、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化|丐组0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL),加到培养板中，置于5% CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。加入96孔板中，放入37°C、5% C02培养箱培养48小时。[0032]7.弃上清，每孔加入MTT溶液100 μ L (MTT终浓度为0.05mg/mL)，37°C培养箱继续培养4小时。
[0033]8.用5ml针头吸弃孔内液体，每孔加入150ulDMS0，37°C放置10分钟，使结晶充分溶解，最后用多功能酶标仪(Synergy 2,BioTek Instrument Inc.,Winooski,USA)在490nm处测定溶液吸光度(Optical Density，0D值)。按公式计算相对光密度值以反映细胞的增
殖率(增值率(％ ) = (A实验组_A空白组)/(A对照组_A空白组)X 100% )。
[0034]结果如图1所示:随着钙离子浓度的提高，肝癌细胞H印G2和肝正常细胞L02的细胞增殖率都呈降低趋势，但是H印G2降低更快，在9mM时，两种细胞的增殖率都很高，而在9mM时，HepG2细胞增值率降低很明显，而L02细胞增殖率降低不明显，当钙离子浓度升高到ISmM时，两种细胞的增殖率都明显降低，所以我们把钙离子浓度定为9mM。
[0035]实施例2复合药(氯化钙与阿霉素重量比为10000:1)对肝癌细胞H印G2和肝正常细胞L02的影响
[0036](一)复合药(氯化钙与阿霉素重量比为10000: I)对肝癌细胞H印G2和肝正常细胞L02增殖的影响
[0037]1.用含10%小牛血清的DMEM培养基培养L02细胞和H印G2细胞，细胞传代后置含5% CO2的37°C培养箱内培养。
[0038]2.当细胞处于对数生长期时，每瓶加入胰酶(使细胞从瓶上脱离下来)500ul，摇动瓶子使胰酶与细胞充分接触，2分钟后，瓶中加入500ul小牛血清，终止胰酶的作用。
[0039]3.再向瓶中加入3ml培养基，用吸管将细胞从瓶上吹下，并把细胞悬液移入离心管,600g 离心 5min。
[0040]4.倒掉上清，加入新鲜培养基3ml，用吸管小心吹打，使细胞分散。
[0041]5.计数，以每孔5X IO3个细胞种于96孔板，每孔培养液(含10%小牛血清)为200ul，放入37°C、5% C02培养箱培养24小时。
[0042]6.用移液器弃去上清培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(PBS，PH = 7.4)洗两次，然后用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙)，加到培养板中，置于5%CO2的37°C培养箱内继续培养48小时。加入96孔板中，放入37°C、5% C02培养箱培养48小时。
[0043]7.弃上清，每孔加入MTT溶液100 μ L (MTT终浓度为0.05mg/mL)，37°C培养箱继续培养4小时。
[0044]8.用5ml针头吸弃孔内液体，每孔加入150ulDMS0，37°C放置10分钟，使结晶充分溶解，最后用多功能酶标仪(Synergy 2,BioTek Instrument Inc.,Winooski,USA)在490nm处测定溶液吸光度(Optical Density，0D值)。按公式计算相对光密度值以反映细胞的增
殖率(增值率(％ ) = (A实验组_A空白组)/(A对照组_A空白组)X 100% )。
[0045]结果如图2所示:单独阿霉素组，L02的增殖抑制作用高于H印G2的增殖抑制作用(P < 0.05)。在L02细胞，与阿霉素相比，复合药组细胞增殖抑制作用没有明显变化(P >
0.05);但在HepG2细胞，与阿霉素相比，复合药组细胞增殖抑制作用明显升高(P < 0.05)。
[0046]( 二)复合药在体外对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L02凋亡的影响
[0047]1.用含10%小牛血清的DMEM培养基培养L02细胞和!fepG2细胞，细胞传代后置含5% CO2的37°C培养箱内培养。
[0048]2.当细胞处于对数生长期时，每瓶加入胰酶(使细胞从瓶上脱离下来)500ul，摇动瓶子使胰酶与细胞充分接触，2分钟后，瓶中加入500ul小牛血清，终止胰酶的作用。
[0049]3.再向瓶中加入3ml培养基，用吸管将细胞从瓶上吹下，并把细胞悬液移入离心管,600g 离心 5min。
[0050]4.倒掉上清，加入新鲜培养基3ml，用吸管小心吹打，使细胞分散。
[0051]5.计数，以每孔1.5 X 1O5个细胞种于6孔板，每孔培养液(含10%小牛血清)为2ml，放入37°C、5% C02培养箱培养24小时。
[0052]6.用移液器弃去上清培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(PBS，PH = 7.4)洗两次，然后用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙),加到培养板中，放入37°C、5% C02培养箱培养48小时。
[0053]7.将板拿出，把上清培养基移入离心管，每孔加2mlPBS洗细胞一次，并将洗液移入离心管，然后每孔加入胰酶200ul，37°C放置I分钟，再向每孔加入500ul小牛血清中和胰
酶作用。
[0054]8.从离心管中吸取Iml液体移入相应孔中，小心吹打使细胞从板上分离下来，移入离心管，600g离心5分钟。
[0055]9.倒掉上清，每管加入2mlPBS，吹打沉淀使细胞分散，600g离心5分钟。
[0056]10.倒掉上清，每管加入190ul流式buffer重悬细胞，然后每管加入5ulAnnexin-V,摇动离心管使染料与细胞充分接触，室温避光孵育lOmin，再加入IOulPI，避光孵育lOmin，最后用流式细胞仪(BD Science, San Jose, CA，USA)检测。
[0057]结果如图3所示，阿霉素单独作用组，L02细胞的凋亡率明显高于HepG2细胞(P
<0.05)，这表明阿霉素毒副作用很大；复合药物组，L02细胞的凋亡率相较于阿霉素组没有明显变化(P > 0.05),HepG2细胞凋亡率较阿霉素组明显升高(P < 0.05)，且高于L02细胞的凋亡率(P < 0.05)。此结果显示复合药物增强了阿霉素对HepG2细胞的凋亡作用，但不增加对正常细胞L02的促凋亡作用。
[0058](三)复合药物在体外对肝癌细胞H印G2和肝正常细胞L02坏死的影响
[0059]1.用含10%小牛血清的DMEM培养基培养L02细胞和H印G2细胞，细胞传代后置含5% CO2的37°C培养箱内培养。
[0060]2.当细胞处于对数生长期时，每瓶加入胰酶(使细胞从瓶上脱离下来)500ul，摇动瓶子使胰酶与细胞充分接触，2分钟后，瓶中加入500ul小牛血清，终止胰酶的作用。
[0061]3.再向瓶中加入3ml培养基，用吸管将细胞从瓶上吹下，并把细胞悬液移入离心管,600g 离心 5min。
[0062]4.倒掉上清，加入新鲜培养基3ml，用吸管小心吹打，使细胞分散。计数，以每孔
1.5X IO5个细胞种于6孔板，每孔培养液(含10%小牛血清)为2ml，放入37°C>5% C02培养箱培养24小时。
[0063]5.用移液器弃去上清培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(PBS，PH = 7.4)洗两次，然后用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙),加到培养板中，放入37°C、5% C02培养箱培养48小时。
[0064]6.将板拿出，把上清培养基移入离心管，每孔加2mlPBS洗细胞一次，并将洗液移入离心管，然后每孔加入胰酶200ul，37°C放置I分钟，再向每孔加入500ul小牛血清中和胰
酶作用。
[0065]7.从离心管中吸取Iml液体移入相应孔中，小心吹打使细胞从板上分离下来，移入离心管，600g离心5分钟。
[0066]8.倒掉上清，每管加入2mlPBS，吹打沉淀使细胞分散，600g离心5分钟。倒掉上清，每管加入 200 μ IDMEM(含 10%血清)包含 50 μ 110ΧΡΙ (500 μ g/ml)，避光 4°C放置 30min,最后用流式细胞仪(BD Science, San Jose, CA, USA)检测。
[0067]结果如图4所示，单独阿霉素组HepG2细胞和L02细胞坏死率没有差异(P >0.05)。复合药物组，L02细胞的坏死率相较于阿霉素组没有明显变化(P > 0.05)，HepG2细胞坏死率较阿霉素组明显升高(P < 0.05)，且高于L02细胞的坏死率(P < 0.05)。此结果显示复合药物增强了阿霉素对HepG2细胞的坏死作用，但不增加对正常细胞L02的促坏死作用。复合药物组H印G2细胞坏死率是L02细胞坏死率400% (P < 0.01)。
[0068](四)复合药物在体外对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L02凋亡相关蛋白影响
[0069]1.用含10%小牛血清的DMEM培养基培养L02细胞和H印G2细胞，细胞传代后置含5% CO2的37°C培养箱内培养。
[0070]2.当细胞处于对数生长期时，每瓶加入胰酶(使细胞从瓶上脱离下来)500ul，摇动瓶子使胰酶与细胞充分接触，2分钟后，瓶中加入500ul小牛血清，终止胰酶的作用。
`[0071]3.再向瓶中加入3ml培养基，用吸管将细胞从瓶上吹下，并把细胞悬液移入离心管,600g 离心 5min。
[0072]4.倒掉上清，加入新鲜培养基3ml，用吸管小心吹打，使细胞分散。
[0073]5.计数，以每孔1.5 X IO5个细胞种于6孔板，每孔培养液(含10%小牛血清)为2ml，放入37°C、5% C02培养箱培养24小时。
[0074]6.用移液器弃去上清培养基，每孔用磷酸盐缓冲液(PBS，PH = 7.4)洗两次，然后用培养基稀释氯化钙、阿霉素、复合药(对照DMEM、氯化钙组lmg/mL、阿霉素组0.lug/mL、复合药物组lmg/mL,即Iml液体中含0.1ug阿霉素和Img氯化钙),加到培养板中，放入37°C、5% C02培养箱培养48小时。
[0075]7.将板拿出，把上清培养基移入离心管，每孔加2mlPBS洗细胞一次，并将洗液移入离心管，然后每孔加入胰酶200ul，37°C放置I分钟，再向每孔加入500ul小牛血清中和胰
酶作用。
[0076]8.从离心管中吸取Iml液体移入相应孔中，小心吹打使细胞从板上分离下来，移入离心管，4°C、600g离心5分钟。
[0077]9.倒掉上清，每管加入lmlPBS，吹打沉淀使细胞分散，移入1.5mlEP管中，4°C、600g离心5分钟。
[0078]10.倒掉上清并用纸吸干净(不要碰到细胞沉淀)。
[0079]11.向细胞沉淀中加入细胞裂解液(含lmmol/LPMSF)各100微升，将EP管放于冰上裂解30分钟，期间每隔5分钟，将EP管置于高速混匀器上，剧烈震荡5秒，使细胞沉淀分散开并与裂解液充分混合(如果细胞沉淀不易分散开，可以适当加大震荡时间)。[0080]12.裂解30min后，在混匀器上震荡5秒，在4°C环境下600g离心5分钟。
[0081]13.用枪头小心吸干净上清(不要碰到沉淀，以免影响结果)，移到干净的EP管中，-20 V保存。留少许测BCA。
[0082]14.配胶:12 % SDS-PAGE分离胶和5 %的浓缩胶
[0083]15.电泳:用IOul移液器上样，蛋白上样量为40ug，左边孔加3ul上样缓冲液，右边孔加3ul marker。跑浓缩胶时用80V，到分离胶后用120V。溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
[0084]16.转膜:250mA 电流转膜 60min。
[0085]17.封闭:把膜放入5%脱脂奶粉中，室温摇床60min。
[0086]18.一抗孵育:裁下一块封口膜，折成小船铺于湿盒中，将脱脂奶粉加到小船中，用移液枪把一抗注进奶粉溶液里，摇床上摇一会。膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡。摇床摇半小时后，放在湿盒中4°C过夜。
[0087]19.洗膜:TBST 洗膜 3 次，每次 lOmin。
[0088]20.孵育二抗:用TBST按适当比例(一般小鼠5000: 1，兔2000: I)稀释二抗。将脱脂奶粉加到小船中，把二抗注进奶粉溶液里，摇床上摇一会儿。膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温摇床孵育Ih~2h。 [0089]21.洗膜:TBST，摇床上洗 3 次 X IOmin0
[0090]22.曝光:(曝光的整个过程需要避光)将ECL化学发光液中的两种发光剂按I: I的比例混合(一般一张膜用IOOul混合液)，体积根据膜的大小以及多少来定。用移液枪将发光剂混合液洒在膜的蛋白面上，用突光化学发光凝胶成像分析系统(GeneGnome,Synoptics Ltd.，Cambridge, UK)分析结果。
[0091]结果如图5和图6所示，在L02和HepG2细胞，相较于对照组，各剂量组bcl_2、caspase-3前体(procaspase-3)蛋白表达量均减少(P < 0.05), bax蛋白表达量在单独钙处理组均没有明显变化(P >0.05)，但在单独阿霉素组和复合药物组是升高的(P
<0.05)。在L02细胞,与阿霉素组相比，复合药物组bax、bcl_2、caspase_3前体蛋白表达量均没有明显变化(P > 0.05)，但在!tepG2细胞，与阿霉素组相比，复合药物组bax蛋白表达量明显升高(P < 0.05),bcl-2,caspase-3前体蛋白表达量明显减少(P < 0.05)。上述结果说明，复合药物能显著提高阿霉素对H印G2细胞的杀灭作用，而不增加对正常细胞的损伤，与前面结果一致。
[0092]实施例3复合药(氯化钙与阿霉素重量比为5000:1)对肝癌细胞H印G2和肝正常细胞L02增殖的影响
[0093]为统一观察调整配比后的符合药物疗效，本实施例中仍固定ADM的终浓度为0.lug/ml,即复合药物使用浓度为0.5mg/mL。本实验操作同实施例2之(一)。
[0094]结果表1所示:在L02细胞，与阿霉素相比，复合药组细胞增殖抑制作用没有明显变化(P > 0.05);但在H印G2细胞，与阿霉素相比，复合药组细胞增殖抑制作用些微升高(P
<0.05)。
[0095]表1胞外钙离子增强阿霉素对H印G2细胞和L02细胞增值率影响(n = 3,I±s,% )
_6] fflSJ HepG2 细胞 L02 细胞 P_
【权利要求】
1.一种治疗癌症的复合物，由钙盐和化疗药物阿霉素混合而成，钙盐与阿霉素重量比为 5000: 1 ~20000: 1。
2.根据权利要求1所述的治疗癌症的复合物，其特征在于，钙盐与阿霉素重量比为10000: 1。
3.根 据权利要求1或2所述的治疗癌症的复合物，其特征在于，所述的钙盐是氯化钙。
【文档编号】A61K33/14GK103860588SQ201210549975
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2012年12月17日
【发明者】吴志刚, 谢虹, 黄雪雪, 刘延一 申请人:华中科技大学