抗原呈递癌症疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供治疗黑色素瘤的试剂、方法和试剂盒。该试剂包括干扰素-γ（IFN-γ）应答的黑色素瘤细胞，其中所述细胞是自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，并且其中所述细胞表达MHC?II类分子。在另一方面，所述试剂包括负载了干扰素-γ应答的、非凋亡性的、表达MHC?II类的黑色素瘤细胞的树突细胞。
【专利说明】抗原呈递癌症疫苗
[0001]相关申请
[0002]本申请要求享有2011年10月20日提交的美国临时申请N0.61/549681和2012年2月2日提交的美国临时申请N0.61/594304的全部巴黎公约优先权及其权益，上述两篇临时申请通过引用并入本文,如同其全部内容在本文中阐述一样。
【技术领域】
[0003]本发明涉及治疗黑色素瘤、筛选适合治疗的受试者、物质组合物、方法和试剂盒。
[0004]发明背景
[0005]癌症的特征是缺乏对癌症有效的免疫应答。免疫应答的缺乏可由以下事实引起:例如许多肿瘤抗原是“自身抗原”;肿瘤细胞缺乏MHC的表达以及由此产生的肿瘤细胞缺乏肿瘤抗原的呈递；巨噬细胞与肿瘤的关联，该巨噬细胞表达降低免疫应答的细胞因子；以及调节性T细胞(Tregs)的免疫抑制活性。对肿瘤的免疫应答的缺乏还可以由以下事实引起:肿瘤细胞倾向于不表达那些刺激先天性免疫应答的分子，即刺激Toll样受体(TLRs)或核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体的分子。癌症包括实体肿瘤以及诸如白血病和骨髓发育不良综合征的血液癌症。
[0006]免疫系统包括细胞免疫、体液免疫、补体反应(complement response)。细胞免疫包括多种细胞和多种活动的网络，涉及树突细胞、CD8+T细胞(细胞毒性T细胞；细胞毒性淋巴细胞)和CD4+T细胞(辅助T细胞)。树突细胞(Dendritic cells, DCs)获得多肽抗原，其中这些抗原可以从DC的外部获得，也可以在DC的内部由感染生物体来生物合成。DC处理多肽，得到长度约10个氨基酸的肽，并将这些肽传输给MHC I类或MHC II类以形成复合体，并将复合体运(shuttles)到DC的表面。当携带MHC I类/肽复合体的DC与⑶8+T细胞接触时，结果是CD8+T细胞的活化和增殖。对于MHC II类所起的作用，当携带MHC II类/肽复合体的DC与CD4+T细胞接触时，其结果是CD4+T细胞的活化和增殖(Munz等(2010)Curr.0pin.1mmunol.22:89-93 ；Monaco(1995)J.Leukocyte Biol.57:543-547 ；Robinson等(2002) Immunologyl05:252-262)。尽管呈递抗原给T细胞的树突细胞能够“活化”该T细胞，活化的T细胞可能不能够具有有效的免疫应答。CD8+T细胞的有效的免疫应答通常需要DC通过一次或多次多个交互来在先刺激(prior stimulation)。这些交互包括⑶4+T细胞与DC的直接接触(通过⑶4+Τ细胞的⑶40配体与DCs的⑶40受体接触的方式)，或者TLR激动剂与树突细胞的toll样受体(TLRs)中的一个受体的直接接触。
[0007]体液免疫涉及B细胞和抗体。B细胞被转化成浆细胞，浆细胞表达并分泌抗体。初始B细胞的区别在于它们不表达标志物(marker)⑶27，而抗原特异性B细胞则表达⑶27(Perez-Andres 等(2010)Cytometry Part B78B(Suppl.1)S47_S60)。分泌的抗体随后可以与驻留在肿瘤细胞表面上的肿瘤抗原结合。结果是受感染的细胞或肿瘤细胞被抗体标记。随着抗体与受感染的细胞或肿瘤细胞的结合，结合的抗体介导(mediates)杀灭受感染的细胞或肿瘤细胞，其中杀灭细胞是由NK细胞进行的。尽管并没有以配置T细胞来识别靶抗原的方式对NK细胞 进行配置来识别特定的靶抗原，但是NK细胞与抗体的恒定区域结合的能力使得NK细胞能够特异性地杀灭抗体所标记的细胞。NK细胞对抗体的识别是由与抗体的Fe部分结合的(NK细胞的)Fc受体介导的。这种类型的杀灭被称为抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)15NK细胞也可以不依赖ADCC机理来杀灭细胞，在这种情况下这种杀灭需要在靶细胞中MHC I类的表达损失或缺乏(参见例如Caligiuri (2008)Bloodll2:461-469)。
[0008]可以使用“迟发型超敏反应”(delayedtype hypersensitivity response)技术来区分主要涉及细胞免疫的免疫应答或主要涉及体液免疫的免疫应答。迟发型超敏反应的阳性信号表明细胞应答(参见，例如Roychowdhury等(2005)PS J.E834-E846)。
[0009]自噬是一个稳态过程，细胞溶质(cytosolic)成分和细胞器通过该过程被输送到溶酶体降解。自噬也与细胞内病原体的先天性免疫应答和适应性免疫应答有关，细胞溶质抗原借助于细胞内病原体而被负载到主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex, MHC) II类分子上，用于CD4+T细胞识别。
[0010]说明[0011]本文中使用时，包括所附权利要求书中使用时，除文本另有明确说明外，诸如“一个”、“一种”(“a”和“an”)和“所述”的词语的单数形式包括其相应的复数指示物。本文中所引用的所有参考文献通过引用并入本文，并入的程度如同明确且单独地指出各个出版物、专利、公开的专利申请和序列表以及在所述公开和专利文献中的图片和照片通过引用并入本文一样。
[0012]发明概述
[0013]本发明公开哺乳动物树突细胞群落，其包含来自给定受试者的黑色素瘤特异性肽，该受试者患有黑色素瘤并且包含黑色素瘤细胞；其中所述黑色素瘤特异性肽是被树突细胞从所述黑色素瘤细胞体外获得，该黑色素瘤细胞未经IFN-Y或IFN-Y模拟物(mimetic)体外处理，其中超过60%的未经IFN- Y或IFN- Y模拟物体外处理的所述黑色素瘤细胞是自噬性和非凋亡性的，并且其中树突细胞和黑色素瘤细胞来自相同的受试者。
[0014]本发明还公开上述哺乳动物树突细胞群落，其中超过80%的所述黑色素瘤细胞是自噬性的和非凋亡性的。
[0015]本发明公开上述树突细胞，其中基本上所有的未经IFN- Y或IFN- Y模拟物处理的黑色素瘤细胞都不能细胞分裂；以及上述树突细胞，其中基本上所有的未经IFN- Y或IFN-y模拟物处理的黑色素瘤细胞受到辐照且不能细胞分裂；以及上述树突细胞，其中至少80%的未经IFN-Y或IFN-Y模拟物处理的黑色素瘤细胞受到辐照且不能细胞分裂；以及上述树突细胞，其中至少80%的未经IFN-Y或IFN-Y模拟物处理的黑色素瘤细胞经核酸交联剂处理且不能细胞分裂。
[0016]本发明还公开了包含上述哺乳动物树突细胞的上述群落的疫苗。
[0017]本发明还公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑色素瘤特异性肽均来自不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0018]本发明进一步公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑色素瘤特异性肽来自由于黑色素瘤细胞受到辐照而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0019]本发明公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑色素瘤特异性肽来自由于黑色素瘤细胞的染色体被核酸交联剂交联而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0020]本发明还公开了上述树突细胞，包含来自经辐照处理过的黑色素瘤细胞的黑色素瘤特异性肽。
[0021]本发明公开了上述树突细胞，其包含黑色素瘤特异性肽，其中所有所述肽来自经辐照处理过的黑色素瘤细胞。
[0022]本发明还公开了上述树突细胞，其包含一个或多个衍生自黑色素瘤特异性抗原的肽，黑色素瘤特异性抗原是 S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-l、ART-l 或酪氨酸酶。
[0023]本发明公开了上述树突细胞，其中基本上所有黑色素瘤特异性肽来自在体外经处理而不能细胞分裂的黑色素瘤细胞。
[0024]本发明还公开了上述树突细胞，其中给定受试者是人类受试者。
[0025]本发明还公开了上述树突细胞，其中给定受试者是非人哺乳动物。
[0026]本发明公开了包含至少一种成熟树突细胞的黑色素瘤疫苗，该成熟树突细胞来自患有黑色素瘤的受试者，其中至少一种成熟树突细胞已经与来自相同受试者的至少一种黑色素瘤肿瘤细胞接触，其中与至少一种成熟树突细胞接触的至少一种黑色素瘤肿瘤细胞是未分裂的、自噬性和非凋亡性的。
[0027]本发明还公开了刺激对黑色素瘤特异性抗原的免疫应答的方法，其包括向受试者施用免疫刺激量的权利要求1的树突细胞。
[0028]本发明公开了其中受试者患有黑色素瘤并且确实具有黑色素瘤细胞。
[0029]本发明公开了上述方法，其中受刺激的免疫应答包括⑶4+T细胞应答、⑶8+T细胞应答和B细胞应答中的一种或多种。
[0030]本发明公开了上述方法，其中通过ELISPOT测定、通过细胞内细胞因子染色测定、通过四聚体测定、或者通过检测抗原特异性抗体的产生来测定CD4+T细胞应答、CDS+T细胞应答或B细胞应答。
[0031]本发明还公开了上述方法，其中免疫应答包括含有2年总生存率(OS)的生存时间，并且其中2年总生存率至少为60%。
[0032]本发明公开了上述方法，其中所述施用包括皮下注射疫苗。
[0033]本发明公开了上述方法，其中施用包括将每周给予的疫苗注射三个月，然后每月给予的疫苗注射五个月。
[0034]本发明还公开了制备树突细胞疫苗的上述方法，该树突细胞疫苗包含来自相同受试者的黑色素瘤细胞和树突细胞，该方法包括:用防止细胞分裂的试剂处理一种或多种黑色素瘤细胞；不对所述一种或多种黑色素瘤细胞进行干扰素-Y (IFN-Y)或IFN-Y模拟物体外处理；选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，丢弃非自噬性和凋亡性的黑色素瘤细胞；并且其中向一种或多种自体树突细胞提供自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，或者其中向一种或多种自体树突细胞提供衍生自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞的肽。
[0035] 本发明公开一种组合物，其包含:来自第一受试者的未经干扰素- Y (IFN-y)处理的至少一种黑色素瘤细胞，和来自相同第一受试者的至少一种抗原呈递细胞(APC)，其中黑色素瘤细胞是:自噬性和非凋亡性的。
[0036]本发明还公开上述组合物，其中黑色素瘤细胞能表达MHC II类。
[0037]本发明还公开上述组合物，其中APC是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。
[0038]本发明公开上述组合物，其中至少一种黑色素瘤细胞包含黑色素瘤特异性肽，并且其中黑色素瘤特异性肽基本不包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特异性肽基本不被所述APCs加工。
[0039]本 发明还公开上述组合物，其中黑色素瘤细胞包含黑色素瘤特异性肽，并且其中黑色素瘤特异性肽基本包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特异性肽部分地或基本上在APCs中被加工。本发明还公开上述组合物，其中黑色素瘤细胞被负载于APC中。本发明公开上述组合物，其中黑色素瘤细胞未被负载于APC中。
[0040]本发明公开上述组合物，其中自噬是通过如下测试证明的，该测试测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)。
[0041]本发明公开上述组合物，其中使用7-氨基放线菌素D (7-AAD)试剂或Annexin (膜联蛋白)试剂中至少一种来证明细胞是非凋亡性的。
[0042]本发明公开在受试者中刺激免疫应答的方法，该受试者患有黑色素瘤且包含黑色素瘤细胞，其中受试者是与第一受试者相同的受试者，包括施用免疫有效量的上述组合物。
[0043]本发明公开上述组合物，其中至少90%的黑色素细胞未经IFN- Y体外处理，并且小于10%的黑色素细胞经IFN-Y体外处理。
[0044]本发明公开制造上述疫苗或上述组合物的方法，其包括将至少一种黑色素瘤肿瘤细胞与至少一种抗原呈递细胞(APC)接触，其中至少一种黑色素瘤肿瘤细胞来自第一人受试者，并且其中至少一种APC来自相同的第一人受试者。
[0045]本发明公开制备树突细胞疫苗的方法，其包括:用防止细胞分裂的试剂处理从第一受试者获得的黑色素瘤细胞，其中不对所述黑色素瘤细胞进行IFN-Y或IFN-Y模拟物体外处理；选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞；并且将所选择的黑色素瘤细胞与来自相同第一受试者的自体树突细胞接触。
[0046]本发明公开一种组合物，其包含通过上述方法所制得的树突细胞疫苗。
[0047]本发明公开刺激对黑色素瘤特异性抗原免疫应答的方法，其包括给患有黑色素瘤的受试者施用上述组合物。
[0048]本发明公开包含至少一种来自第一受试者的黑色素瘤细胞和至少一种来自相同第一受试者的抗原呈递细胞(APCs)的组合物，其中黑色素瘤细胞是:自噬性的、非凋亡性的、并且表达MHC II类的。在本发明中，经IFN-Y处理的黑色素瘤细胞未负载于APC中；并且其中经IFN-Y处理的黑色素瘤细胞未负载于APC中。在另一方面，本发明包含上述组合物，其中黑色素瘤细胞来自患有I期(Stage I)、II期(Stage II)、III期(Stage III)或IV期(Stage IV)黑色素瘤的受试者。此外，本发明涉及上述组合物、相关的试剂盒和相关的方法，其中APC包含至少一种树突细胞。
[0049]在一个方面，本发明的药物组合物、试剂和相关的方法采用癌症细胞的制剂，该制剂为7-AAD阴性并且Annexin V阴性。这种群落(population)的非限制性例子可以是,例如约99%7-AAD阴性和约99%Annexin V阴性、或者至少约95%7_AAD阴性和约95%annexin V阴性、或者至少约90%7-AAD阴性和约90%Annexin V阴性。
[0050]此外，本发明包含上述组合物，其中自噬是通过如下测试证明的，该测试测定微管相关蛋白轻链3 (LC3);以及上述组合物，其中使用7-氨基放线菌素D (7-AAD)试剂或Annexin (膜联蛋白)试剂中至少一种来证明细胞是非凋亡性的。
[0051]在方法方面，本发明提供制造如上所述组合物的方法，其包括从第一受试者中去除至少一种黑色 素瘤细胞，从第一受试者中去除至少一种APC，并且允许黑色素瘤细胞与APC接触；以及刺激对受试者或患者中黑色素瘤的免疫应答的方法，其包含向受试者施用上述组合物。
[0052]在试剂盒方面，本发明提供用于测试对受试者中肿瘤抗原的免疫应答的试剂盒，其中通过一种或多种上述方法来治疗受试者，并且其中试剂盒包含检测体液免疫应答、细胞免疫应答和先天性免疫应答的试剂。
[0053]定义
[0054]免疫刺激量可以是，但不限于，以可测量的量增加ELISPOT测定结果的量、以可测量的量增加ICS测定结果的量、以可测量的量增加四聚体测定结果的量、以可测量的量增加抗原特异性⑶4+T细胞的血液总数(blood population)的量、以可测量的量增加抗原特异性⑶8+T细胞的血液总数的量、或者其中当与合适的对照相比时增加了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2.0倍、3.0倍等。合适的对照可以是对照疫苗，其中没有用黑色素瘤细胞负载树突细胞，或者没有用衍生自黑色素瘤细胞的肽负载树突细胞。
[0055]术语〃黑色素瘤特异性抗原〃包括通常与黑色素瘤相关的抗原，并且其中该抗原对于黑色素瘤来说被认为是唯一的，而不是与其他癌症有关，并且此外，术语〃黑色素瘤特异性抗原类〃包括通常与黑色素瘤相关的抗原，并且其中该抗原也与诸如乳腺癌、大肠癌等其他类型癌症有关。
[0056]在辐照本发明的黑色素瘤细胞的上下文中，“辐照”优选地通过Y-辐照，但也包括通过X-射线、电子、中子、质子、电磁辐照、可见光、紫外光等的辐照。在一个方面，辐照起到防止黑色素瘤细胞的细胞分裂的作用。在另一方面，辐照不仅防止细胞分裂，而且使细胞蛋白质变性。作为辐照的替换，本发明可通过物理破坏的方式诸如超声、空洞形成(cavitation)、脱水、离子耗竭(ion depletion)或者通过暴露于一种或多种盐产生的毒性来防止黑色素瘤细胞的细胞分裂。
[0057]在“超过60%的黑色素瘤特异性肽”中，术语〃%〃(百分数)涉及肽分子的数目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的数目。在“超过80%的黑色素瘤特异性肽”中，术语〃%"涉及肽分子的数目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的数目。在“小于40%的黑色素瘤特异性肽”中，术语"%"涉及肽分子的数目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的数目。在“小于20%的黑色素瘤特异性肽”中，术语"%"涉及肽分子的数目，而不涉及在抗原性方面不同的肽的数目。
[0058]在“超过60%的黑色素瘤特异性肽”中，术语〃肽〃涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。在“超过80%的黑色素瘤特异性肽”中，术语〃肽〃涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。在“小于40%的黑色素瘤特异性肽”中，术语"肽"涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。在“小于20%的黑色素瘤特异性肽”中，术语"肽"涉及肽分子、寡肽分子和多肽分子等的数目的总和。
[0059]在从一种或多种癌细胞获得的肽的上下文中，“衍生自”或“从……获得”(derivedfrom)包含以下内容。癌细胞可以被分解，例如通过均化器或通过渗透破裂，从而得到粗提取物。可以使粗提取物的肽、寡肽和多肽接触到树突细胞，然后通过树突细胞处理肽。“衍生自”也包括提供具有完整癌细胞的树突细胞，其中癌细胞是活的，或者其中已经采用辐照处理癌细胞但癌细胞仍然具有代谢活性，或者其中已经采用核酸交联剂处理癌细胞但癌细胞仍然具有代谢活性。“衍生自”包括癌细胞碎片、游离癌细胞蛋白质和经辐照的癌细胞的混合物，它们被树突细胞摄取(taken up),因此衍生自癌细胞。
[0060]应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”指的是，但不限于给受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物。“施用”可涉及例如处理方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法、安慰剂方法和实验方法。细胞的处理包括给细胞接触试剂、以及给流体接触试剂，其中流体与细胞接触。“施用”也包括诸如细胞的体外(in vitro)和活体外(ex vivo)处理,其通过试剂、诊断、结合组合物或者通过另一细胞进行。
[0061]涉及配体和受体时，“激动剂”包括刺激受体的分子、分子的组合、复合物、试剂的组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的激动剂可以包括GM-CSF、GM-CSF的变异体变白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子、或者刺激GM-CSF受体的抗体。涉及配体和受体时，拮抗剂包括抑制、抵消、下调和/或脱敏受体的分子、分子的组合物或复合物。“拮抗剂”包括抑制受体的组成性活性(constitutiveactivity)的任何试剂。组成性活性是当不存在配体/受体相互作用时显露的活性。“拮抗剂”还包括抑制或防止受刺激(或受调节)的受体活性的任何试剂。举例如下，GM-CSF受体的拮抗剂包括但不限于:与配体(GM-CSF)结合并防止其结合受体的抗体，或者与受体结合并防止配体与受体结合的抗体，或者其中抗体将受体封锁在非活性构象。
[0062]除本文另有指明或上下文指定外，术语“表达”包括如下内容。表达包括mRNA的生物合成、多肽生物合成、多肽活化，例如通过翻译后修饰，或者通过改变亚细胞位置或通过募集到染色质使表达活化。换言之，“提高的表达”包括由磷酸酯引起的生物合成提高或活性提高，或者由细胞质到细胞核的迁移所引起的活性提高。
[0063]抗原呈递细胞(APCs)是用于呈递抗原给T细胞的免疫系统细胞。APCs包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区KupfTer细胞、小胶质细胞、郎格汉斯细胞、T细胞和 B 细胞(参见，例如 Rodriguez-Pinto 和 Moreno (2005)Eur.J.1mmunol.35:1097-1105)。树突细胞产生在至少两个谱系中。第一谱系包括前体-DC1、骨髓DCl和成熟DC1。第二谱系包括 CD34++CD45RA-早期祖多能细胞(early progenitor multipotent cells)、CD34++CD45RA+ 细胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++ 促-DC2 细胞、CD4+CD11(T 浆细胞样DC2前体细胞、淋巴样人DC2浆细胞样-衍生的DC2、和成熟DC2 (参见，例如Gilliet和Liu (2002)J.Exp.Med.195:695-704 ;Bauer 等(2001)J.1mmunol.166:5000-5007 ；Arpinati等(2000)Blood95:2484-2490 ;Kadowaki 等(2001)J.Exp.Med.194:863-869 ;Liu(2002)Human Immunology63:1067-1071 ;McKenna等(2005) J.Virol.79:17-27 ;0，Neill 等(2004)Blood104:2235-2246 ；Rossi 和 Young(2005)J.Tmmunol.175:1373-1381 ；Banchereau 和Palucka(2005)Nat.Rev.Tmmunol.5:296-306)。
[0064] “有效量”包括但不限于可改善、反转、减轻、预防或诊断医学病情(condition)或病症(disorder)的症状或迹象的量。除非另有明确指明或通过上下文指明外，“有效量”不限于足以改善病情的最小量。疾病或病症的严重程度以及处理以预防、治疗或减轻疾病或病症的能力，可以通过生物标志物或通过临床参数测定，但不限于此。生物标志物包括核酸,血清、尿、脑脊液中的血球计数、代谢水平,肿瘤细胞计数,癌症干细胞计数,肿瘤水平。肿瘤水平可以通过 RECIST 标准(Eisenhauer 等(2009)Eur.J.Cancer.45:228-247)来测定。表达标志物包括mRNA的基因表达或者基因扩增、抗原表达和多肽的表达。临床参数包括但不限于无进展生存期(PFS, progression-free survival )、6月PFS、无病生存期(DFS,dsease-free srvival)、疾病进展时间(TTP, time to progression)、远处转移时间(TDM,time to distant metastasis)和总生存期(overall survival)。
[0065]“标记的”组 合物可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学方法直接或间接地检测。例如有用的标记包括32P、33P、35S、14C、3H、1251、稳定同位素、表位标签、荧光染料、电子-致密试剂、底物或酶例如在酶联免疫测定中使用的酶或fIuorettes(例如参见 Rozinov 和 Nolan (1998) Chem.Biol.5:713-728)。
[0066]评估免疫应答的方法
[0067]本发明还提供用于表征免疫应答的ELISPOT测定、细胞内细胞因子染色(ICS)和四聚体测定(参见例如，Pardoll 的 US2007/0190029 ；Chattopadhyay (2008) CytometryA.200873:1001-1009 ；Vollers(2008)Immunology.123:305-313 ；Lalvan1.等(1997)J.Exp.Med.186:859-865 ；ffaldrop(1997)J.Clin.1nvest.99:1739-1750 ；Hudgens(2004)J.1mmunol.Methods288:19-34 ；Goulder (2001) J.Virol.75:1339-1347 ；Goulder (2000)J.Exp.Med.192:1819-1831 ;Anthony (2003)Methods29:260-269 ；Badovinac 和Harry (2000) J.1mmunol.Methods238:107-117)。通过肿瘤学临床试验中所使用的终点来评估患者体内的免疫应答，包括客观反应(RECIST标准)、总生存期、无进展生存期(PFS)、无病生存时间、远处转移时间、6月PFS、12月PFS等等。
[0068]疫苗
[0069]本发明的树突细胞疫苗可以通过皮内、结内、粘膜或皮下途径或上述的任意组合来施用。每剂可以包括约IOX IO3个树突细胞、20X IO3个细胞、50X IO3个细胞、IOOX IO3个细胞、200 X IO3个细胞、500 X IO3个细胞、I X IO6个细胞、2 X IO6个细胞、20 X IO6个细胞、50X IO6 个细胞、100X IO6 个细胞、200X 1066、500X 106、1X IO9 个细胞、2X IO9 个细胞、5X IO9个细胞、10X IO9个细胞等等。施用频率可以是例如一周一次、一周二次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、两个月一次、三个月一次、四个月一次、五个月一次、六个月一次等等。进行施用的天的总数目可以是一天、2天或3天、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、或20等等。应当理解的是，任何给定的施用可以包含同一天中两次或更多次注射。在一个方面，本发明涉及用整个肿瘤细胞负载树突细胞，其中至少10%、其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的负载到树突细胞中的衍生自黑色素瘤细胞的蛋白质存在于整个肿瘤细胞中。在非限制性实施方式中，树突细胞疫苗在烧瓶中、小瓶中、瓶子中、注射器、导管中、套管中等等。为了施用，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%的被施用的树突细胞是树突细胞。
[0070]疫苗均匀性
[0071]在各种实施方式中，本发明提供包含树突细胞的疫苗，该树突细胞包含衍生自体外负载的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1等的树突细胞/黑色素瘤细胞的比例包含树突细胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的总和)。本发明还提供包含树突细胞的疫苗，该树突细胞包含衍生自体外负载的黑色素瘤肽，其中疫苗以至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1 等的[树突细胞]/[既非DC又非黑色素瘤的细胞]的比例包含树突细胞(包含黑色素瘤肽的DC和不包含黑色素瘤肽的DC的总和)。本发明提供一种带间隔的容器，其中第一间隔包含黑色素瘤细胞，并且第二间隔包含树突细胞。两个间隔可以通过以下物质来分离:膜、过滤器、阀门、导管、耦合器来分离，其防止黑色素瘤细胞与树突细胞接触，但其中手动传输或其中去除膜或打开阀门时允许黑色素瘤细胞与树突细胞接触，使得黑色素瘤细胞、黑色素瘤细胞片段和/或黑色素瘤肽可以负载到树突细胞上。
[0072]干扰素-Y模拟物
[0073]本发明包含模拟物，例如干扰素-Y模拟物，例如模拟肽95-132 (Ahmed (2007)J.1mmunol.178:4576-4583 ；Fulcher (2008) FEBS Lett.582:1569-1574)。IFN-模拟物包括例如具有与干扰素-Y相同激动剂活性的抗体。[0074]使黑色素瘤细胞失活
[0075]本发明提供其中癌症细胞失活的组合物和方法，例如通过辐射失活或通过核酸交联剂的方式失活。示例性交联剂具有交联DNA但不修饰蛋白质的能力。核酸烷基化剂可以是β _丙氨酸、N-(卩丫唳-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙基酯。在一些实施方式中，核酸靶向化合物是经由UVA辐照活化的补骨脂素化合物。例如，核酸靶向化合物可以是4’ - (4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(本文中也称为〃S-59〃)。可以用150微摩尔补骨脂素 S-59 和 3J/cm2UVA 光(FX1019 福照装置，Baxter Fenwal, Round Lake, IL)来失活细胞。用S-59进行的失活被称为光化学处理，并且导致细胞的完全失活。可以测试各种浓度的核酸交联剂在失活细胞方面的效力，例如在防止细胞分裂方面的效力。S-59的特征在于其交联核酸但保持蛋白质完整未被修饰的能力。细胞可以悬浮于含0、1、10、100和1000nM补骨脂素S-59的5mL生理盐水中。可以如下地辐照每个样品。可以以IOOnM的浓度加入 S-59。以大约 2J/cm2 (FX1019 福照装置，Baxter Fenwal, Round Lake, II1.)的剂量UVA辐照样品。并然后将每个样品转移到15mL管、离心并去除上清液，然后用5mL生理盐水洗涤、离心并去除上清液，并且最终的沉淀悬浮于0.5mL的生理盐水中(Dubensky的美国专利 Nos.7833775 和 7691393)。
[0076]富集非凋亡性的黑色素瘤细胞
[0077]可以使黑色素瘤细胞群落富含非凋亡性的黑色素瘤细胞，例如通过使用如下技术:将非凋亡性且自噬性细胞与非自噬性且凋亡性的细胞分离，其中分离是通过将自噬性且非凋亡性的细胞粘附到表面来进行的，其中其他细胞处于浮动状态。还可以通过去除凋亡的细胞来获得富含非凋亡性黑色素瘤细胞的群落，例如通过对磷脂酰丝氨酸特异的抗体的方式去除。通过经固定化的抗体的方式去除细胞的技术是已知的(Onodera(1998)Ther.Apher.2:37-42)。对磷脂酰丝氨酸特异的抗体是已知的(例如EMDMillipore, Billerca, MA)0也可以用荧光抗磷脂酰丝氨酸抗体标记黑色素瘤细胞的主体群落(bulk population),其中通过流式细胞法、亲和层析法、免疫磁性分离(参见例如Hoeppener (2012)Recent Results Cancer Res.195:43-58 ；Dainiak (2007)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.106:1-18)除去标记的凋亡黑色素瘤细胞。[0078]细胞凋亡的抑制剂
[0079]Z-VAD(Z-VAD-fmk)是一种细胞凋亡的抑制剂，其可以从例如 Enzo Life Sciences (Exeter, UK) > R&D Systems(Minneapolis,MN) >Tocris Biosciences(Bristol, UK) > BioMol(Plymouth Meeting, PA)和 EMDChemicals (Gibbstown, NJ)获得。Z-VAD-fmk 是一种合成妝 Z-Val-Ala-Asp (OMe) _CH2F。半胱天冬酶(caspases,胱天蛋白酶)是半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶家族。半胱天冬酶被死亡受体连接(li gat ion)而活化，例如TRAIL、FAS、通过DNA损伤、应激、血清饥饿以及在某些细胞类型中干扰素。半胱天冬酶在包括核断裂、染色质浓缩和细胞质完整性损失的细胞凋亡的高度调节过程中起关键的作用。泛蛋白酶抑制剂(pan-capase) z-VAD-fmk (节氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰- [O-甲基]-氟甲基酮)不可逆地结合半胱天冬蛋白酶的催化位点，并抑制它们在诱导细胞凋亡方面的功能。在对IFN-Y应答时抑制细胞进行细胞凋亡的能力可以是如下方式:通过此方式产生非凋亡性但自噬性细胞，而无洗涤选择步骤来去除浮动的凋亡细胞。
[0080]本发明提供药物、试剂、试剂盒(包括诊断试剂盒)，其中药物、试剂、试剂盒包含树突细胞、抗体或抗原。本发明还提供施用含至少一种树突细胞和至少一种抗原的组合物的方法、刺激抗体形成的方法、刺激ADCC的方法、刺激补体依赖性细胞毒性的方法、以及确定患者适用性的方法和试剂盒、在临床试验中确定患者入选/排除标准的方法和试剂盒、预测对药物或试剂的应答的方法。现有技术中已描述补体依赖性细胞毒性(参见例如Goodman等(1990) J.Clin.0ncol.8:1083-1092 ；Cheson(2010) J.Clin.0ncol.28:3525-3530)。本发明的药物组合物、试剂和相关方法包含CD83阳性树突细胞，其中CD83是通过用IFN-Y处理的癌细胞负载而诱导的。在本发明的⑶83方面，⑶83被诱导了至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10% 等。
[0081]图
[0082]图1展现了在用IFN- Y处理之前(左)和IFN- Y处理72小时之后(右)培养的肿瘤细胞的图形。处理后，培养的肿瘤细胞要么是浮动的、非自噬性且凋亡的，要么是粘附的、自噬性且非凋亡的。浮动的细胞示出表达凋亡标志物磷脂酰丝氨酸。浮动的细胞示出具有相对较少的表达的MHC II类，而粘附细胞示出具有过度表达的MHC II类。
[0083]图2A-D示出了用于负载树突细胞的经IFN-Y处理的自体肿瘤细胞的特征。在15%FBS/ECS中在RPMI中使用或者不使用1000IU/mL IFN-y处理自体黑色素瘤肿瘤细胞72小时，收获并用IOOGy辐照并冻存。然后在AIMV中将细胞解冻，并采样用于流式细胞，以及用于在抗原负载DC之前制备用于免疫印迹的细胞裂解物。四个独立的自体黑色素瘤细胞系的例子示于图2A、图2B和图2C中。通过IFN- Y处理自体肿瘤细胞诱导主要组织相容性复合体(图2D)。在使用或者不使用1000IU/mL IFN-y处理72小时后收获肿瘤细胞，然后测定MHC I类和II类。使用对照同类型抗体来认定阳性群落。深色数据点表示中值平均+/-95%置信区间。N=65。辐照后，通过测定检查黑色素瘤细胞，来确定无任何有丝分裂。
[0084]在一个方面，本发明排除用于负载树突细胞的非自体肿瘤细胞，并且排除使用用于负载树突细胞的非自体肿瘤细胞的方法。
[0085]图3A和3B描述用自体黑色素瘤细胞系负载的树突细胞的表型，其中使用干扰素-Y处理自体黑色素瘤细胞系或未使用干扰素-Y处理自体黑色素瘤细胞系。使用或者不使用1000IU/mL IFN-y处理一组四个自体黑色素瘤细胞系72小时，辐照并冻存。然后在AIMV中将细胞解冻，并在收获和通过流式细胞法测定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II类的表达之前，与自体树突细胞组合大约24小时(图3A)。数据总结于图3B中。示出了平均值土标准偏差(SD ), n=4。
[0086]图4A和4B示出了剂型(dose)制备所使用的树突细胞的表型。在用经IFN-y处理的、辐射的自体肿瘤细胞负载之前(Pre-ATC Load DC, N=53)和负载之后(Post-ATC LoadDC, N=65)，通过流式细胞法评估DC的样品对于⑶80、⑶83、⑶86和MHC II类的表达。使用FACS Caliber?球来设置的初始流式细胞仪仪器设定，然后在整个数据的采集中保持该设定不变(图4A)。在图4B中，比较ATC负载之前和ATC负载之后的百分数表示的值和平均荧光强度(MFI) +SD0 *ρ=0.019 且 **ρ=0.0009。
[0087]图5Α至5C示出了经干扰素-Y处理的黑色素瘤细胞进行自噬。选择商业可购得的黑色素瘤细胞系，并在5%FBS/RMPI中用10001U/mL IFN-y培育72小时。在培育期结束时拍摄SK-5-Mel细胞培养基的相位差显微镜照片(图5A)，示出了具有自噬体的囊泡的放大的细胞。在用IFN-Y处理之前，通过使用GFP-LC3B构建转染来证明自噬体的确定和形成(图5B)。通过使用用于LC3B的抗体蛋白质印迹(图5C)，来确定IFN-Y处理后的自噬诱导，确认LC3的更快的迁移形式，已经表明LC3与自噬性血管形成相关。
[0088]图6A和6B展现了对干扰素-Y应答时诱导的细胞凋亡和自噬。用10001U/mL的IFN-y培育SK-5-Mel细胞72小时，之后收集非粘附群落和粘附的群落并通过使用7-AAD和Annexin-V流式细胞法测定细胞凋亡和自噬(图6A)。使用Enzo Cyto-1D自噬检测染料，通过测定制造商所提供的染料的平均强度峰位移，通过流式细胞法来测定自噬(图6B)。图6C中示出了，与5%FBS/RPMI相比，峰位移的倍数变化(fold change)，其中无血清作为自噬诱导的阳性对照。
[0089]图7公开了阻断半胱天冬酶活性后的自噬诱导并不影响在黑色素瘤细胞中对IFN- Y应答时的自噬诱导。在20uM的泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD或其对照化合物z_FA存在下，用1000IU/mL的IFN- Y处理SK_5_Mel细胞72小时。收获细胞，并通过流式细胞法测定自噬，如图6C中所示。
[0090]图8示出了 SK-5-Mel细胞，其用1000IU/mL的IFN- Y在IOuM的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)存在下培育72小时。然后收获细胞，并通过流式细胞法测定细胞凋亡和MHC II 类(HLA-DR)表达。
[0091]图9示出了来自由患者肿瘤样本(N=36)所产生的肿瘤细胞系的IFN-Y处理过的细胞，测定其在MHC II类或细胞凋亡方面的变化。所示数据为平均荧光强度土SE的平均值。
[0092]图10示出了经IFN- Y处理的细胞，通过流式细胞法从用于负载患者特异性疫苗免疫治疗的树突细胞的样品测定其MHC II类或细胞凋亡。示出了 MHC II类的倍数变化、平均荧光强度和凋亡细胞百分数(Annexin-V阳性)。
[0093]图11和图12示出了 MHC II类的诱导和细胞凋亡的缺乏之间的相关性，在接受用自噬性、非凋亡性、经干扰素-Y处理的肿瘤细胞负载的树突细胞的患者中表现出更好的无进展生存期(图11)和总生存期(图12)。
[0094] 图13示出了来自三次试验的生存曲线。点图(Kaplan-Meier)是步进式曲线,表明在临床试验的过程中研究受试者生存的百分数。设计各个组DC-54 (实心圆)、TC-74 (实心方块)、TC-24 (实心三角形)以及DC-18 (线)。最差的生存发生在TC-24组。第二差的生存组是TC-74。TC-24指的是在涉及24个受试者的研究中肿瘤细胞的疫苗。
[0095]图14示出了来自三次试验的生存曲线。这些试验是与图13中所描述的试验相同的临床试验，但具有较晚的时间点所获得的额外数据。
[0096]进一步说明
[0097]自体树突细胞生成[0098]SSficoled apheresis products 的塑料粘附法(plastic adherence method)(Choi 等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft 等(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Cornforth 等(2011) Cancer Tmmunol.Immunother.60:123-131),在补充有各 lOOOIU/mL 的IL-4(CellGenix, Freisberg, Germany)和 GM-CSF(Bertex, Seattle, WA) (DC 培养基)的不含抗生素的AIM-V培养基(Invitrogen, Grand Island, NY)中，生成树突细胞。然后在用经IFN- Y处理的、辐照的自体肿瘤细胞负载之前，将烧瓶培养6天。
[0099]IFN-Y自体肿瘤细胞系生成和药物的制备
[0100]根据Cornforth 等(Cornforth 等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60: 123-131 ;DiI Iman 等(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorTmmunol.14:65-69 ;Dillman 等(2000) Cancer Biother.Radiopharm.15:161-168),生成纯的肿瘤细胞。然后用1000U/mL的干扰素-Y (InterMune, Brisbane, CA)培育肿瘤细胞72小时，用来自铯源的 IOOGy 辐照并冻存(Selvan 等(2007) Int.J.Cancerl22:1374-1383 ；Selvan等(2010)Melanoma Res.20:280-292)。从冻存中恢复经IFN-Y处理且辐照的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后加入培养的树突细胞(DCs)，然后培育约24小时。通过用橡皮淀帚轻轻刮取来收获负载了抗原的DCs，并冻存。获得经IFN-Y处理或未处理的肿瘤细胞和负载的DCs的多个等分部分,用于流式细胞评价和台盼蓝拒染(trypan-blueexclusion)测定。
[0101]皮肤黑色素瘤的分期(Staging)
[0102]本发明的药物或试剂可以施用于黑色素瘤患者，其中黑色素瘤诊断为I期、II期、III 期或 IV 期(Mohr 等(2009) Ann.0ncology (Suppl.6) vil4-vi21)0 例如 I 期指的是具有原发(初始)黑色素瘤而无区域或远处转移证据的患者。II期包括无淋巴结疾病或远处转移证据的患者，其中患者的进一步特征在于:例如损伤大于Imm且小于或等于2mm厚的覆上皮(overlying epithelium)溃瘍,或者损伤大于2mm且小于或等于4mm厚的上皮溃瘍。III期黑色素瘤包括病理记录波及区域淋巴结或在途(in-transit)转移或卫星(satellite)转移的损伤，其中患者可具有例如一个、两个、三个或四个或更多个受感染的淋巴结。IV期黑色素瘤定义为存在远处转移，其中转移仅位于远处皮肤、皮下组织或淋巴结，其中转移涉及肺转移，或者其中转移涉及所有其他内脏部位。
[0103]本发明包含预防性施用的方法，也就是用于尚未或从未诊断为患有黑色素瘤的受试者。本发明包含施用的方法，其中受试者此前已被诊断为黑色素瘤并且此前已得到成功治疗以消除黑色素瘤(或者经历过自动完全痊愈)，并且其中在根除后预防性施用。
[0104]肿瘤抗原
[0105]本发明的黑色素瘤细胞表达Mage、Mart-1, Mel-5, HMB45、SlOO或酪氨酸酶中的一种或多种(Dillman 等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415)，但并不限于此。在一个方面，肿瘤抗原的检测使用未暴露于IFN-Y的细胞，而在另一方面，肿瘤抗原的检测在经IFN-gamma处理的细胞上进行(参见例如Cornforth等(2011)CancerBiotherapy Radiopharmaceuticals26:345-351 )。本发明包含表达一种或多种黑色素瘤抗原或者包含一种或多种分离的黑色素瘤抗原的组合物的黑色素瘤细胞，如Dubensky的US2007/0207171所公开的，其通过引用以其全文并入本文。
[0106]测定细胞凋亡
[0107]可以使用多种试剂来检测或测定细胞凋亡，例如荧光染料标记的膜联蛋白，通过用染料诸如碘化丙烷和7-氨基放线菌素D (7-AAD)染色，通过测定线粒体内膜势的损失，通过测定半胱天冬酶的活化或裂解。参见例如George等(2004)Cytometry PartA.59A:237-2450细胞凋亡的早期活动是磷脂酰丝氨酸暴露于质膜的外表面，其可以通过荧光染料标记的膜联蛋白检测。可用的方法能够区分活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。本发明使用通过7-ADD测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞、通过膜联蛋白V测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞、在IFN-Y处理后经凋亡性测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞(Dillman 等(2011)Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals26:407-415)、或者通过一种或多种生物标志物Bcl-2、半胱天冬酶-3、P53或存活素测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞(Karam等(2007)Lancet Oncol.8:128-136)。本发明的药物组合物、试剂和相关方法排除经IFN-Y处理的凋亡性的黑色素瘤细胞，其中根据例如Herlyn等的美国专利N0.7544465、Thorpe等的美国专利7714109来测定细胞凋亡，其通过引用并入本文。
[0108]测定自噬
[0109]自噬是用于降解许多蛋白质和某些细胞器的自然存在的过程。自噬倡导蛋白质和细胞器周转、饥饿应答、细胞分化、细胞死亡等。与微管相关的蛋白轻链3 (LC3)监测自噬。在一种方法中，可以通过测量LC3的转化来检测自噬，其涉及LC3-1或LC3-1I的转化。LC3-1I的量与自噬体的数目相关。具体来说，LC3是细胞溶质的且可溶的，而LC3-1I存在于膜上。LC3-1I具有更大的分子量，因为其与脂质结合(conjugated)。可以测量LC3加工，例如通过western印迹,而自曬、自曬小泡和自曬体可以通过显微镜测定。自曬可以是定量的，例如通过检测加工的LC3-11、通过早期与晚期自噬性区室(compartment)之间的比例、或者通过自卩遼体积。参见(Mizushima 和 Yoshimori (2007) Autophagy3:542-546:634-641 ；Tanida等(2008)Methods Mol Biol.445:77-88 ；Eng.等(2010)Autophagy6:634-641)0 在一个方面，本发明使用自噬作为筛选工具，用于选择合适的自噬性癌细胞，其中可以根据在一个或多个具体阶段中自噬的出现来选择细胞。这些自噬阶段包括:(1)通过自噬体隔离胞质区室，(2)使用溶酶体融合自噬体，以形成自溶酶体，并且(3)通过溶酶体内的蛋白酶降解自溶酶体内容物。在另一个方面，本发明包括主要显示第一阶段、主要显示第二阶段、主要显示第三阶段、主要显示所有三个阶段的细胞。在另外一个方面，本发明包含显示第一阶段、第二阶段、第三阶段、第一和第二、第二和第三阶段或者显示所有三个阶段的细胞。
[0110]干扰素-Y (IFN-Y )信号传导
[0111]IFN-Y (II型干扰素)信号传导依赖于一些基因的表达，诸如IFN-Y受体、STATl、STAT2,STATl 同源二聚体、STAT1/STAT2 异源二聚体、IRF-UGAS 和 IRF-E。研究表示 IFN-Y信号传导依赖于IFN-Y受体(IFNGR1链；IFNGR2链)。细胞表面上IFNGR的低表达能够阻断IFN- Y 信号传导的某些方面(Schroder 等(2004) J.Leukocyte boil.75:163-189)。在一个方面，本发明排除使用表现出IFNGR的低表面表达的癌细胞。在另一个方面，本发明筛选表达STATl同源二聚体的那些癌细胞，使用这些细胞，并且基本上排除那些不表达STATl同源二聚体的细胞。在另外一个方面，本发明考虑筛选那些具有STATl磷酸化(丝氨酸-727)的细胞。本发明还考虑排除来自具有STATl基因中功能突变缺失的患者的癌细胞(参见例如Dupuis 等(2001)Science293:300-303 ;Schroder 等(2004)J.Leukoc.Biol.75:163-189)。下面关注IRF基团家族。RF-l、IRF-2和IRF-9均参与IFN-Y信号传导。本发明涵盖了使用表达这些IRF基因族基因中的一种或多种基因的癌细胞，或者排除未表达这些基因中一种或多种的癌细胞。
[0112]IFN-Y应答基因
[0113]在一些示例性实施方式中，本发明包含生物材料、组合物、试剂和方法，其要求使用对IFN-Y应答的黑色素瘤细胞或肿瘤前期的黑色素瘤细胞。可以通过一种或多种IFN-Y应答基团的表达测定，来确认、区分和选择黑色素瘤细胞。已经确认了许多 IFN- Y 应答基团(参见例如 Halonen 等(2006) J.Neuroimmunol.175:19-30 ；MacMicking(2004) 11:601-609 ;Boehm等(1997) 15:749-795)。所述测定可以涉及从患者中去除一种或多种黑色素瘤细胞、在添加的IFN-Y存在和不存在情况下培养细胞、并确定对IFN-y的应答。在该测定中，IFN-Y诱导的基因表达可以通过对以下敏感的试验来检测，上述试验对以下敏感:转录因子结合到IFN-Y诱导的基因的启动子、IFN-Y诱导的基因的mRNA的表达、表达的多肽等等。IFN-Y应答基因可以包括例如，用于免疫应答、编码转录因子、转运蛋白质的基因、细胞凋亡基因、用于细胞生长或维持的基因、用于脂质代谢的基因、介导胞吞或胞吐的基因、胞内信号传导基因、糖代谢基因、细胞粘附基因以及无确定功能(established function)的基因。
[0114]在一个方面， 本发明排除使用IFN-Y处理时具有以下特点的黑色素瘤细胞:表现出MHC II类表达降低，在MHC II类的表达方面表现出无可检测到的变化，表现出MHC II类表达增加10%或更少，表现出MHC II类表达增加15%或更少，表现出MHC II类表达增加20%或更少、25%或更少、30%或更少、40%或更少、50%或更少等等。在一个方面，百分数的值指的是存在于来自给定受试者或患者的活检或部分活检中的黑色素瘤细胞群落的平均表达值。
[0115]用于筛选IFN- Y应答癌细胞的IFN- Y诱导基因的非限制性列表
[0116]ab000677, JAB/S0CS1 ；m63961, IFN- Y 诱导蛋白(mag-1) ；m35590,巨噬细胞炎性蛋白 l-β ；ml9681, MCP-1 (JE) ；y07711, zyxin ；M34815, IFN- y 诱导的单核因子(MIG)；m33266,干扰素诱导蛋白IO(IP-1O) ；U44731,嘌呤核苷酸结合蛋白；U88328，细胞因子信号传导抑制因子 _3 (Sup.0f cytokine signalling-3, S0CS-3) ;M21065,干扰素调节因子I ;M63630，GTP 结合蛋白(IRG-47) ;U19119, G-蛋白样 LRG-47 ;L27990，Ro 蛋白；M31419, 204干扰素活化蛋白；af022371，干扰素诱导蛋白203 ；U28404, MIP-1 α受体；U43085，糖皮质激素减弱反应基因 39 (Glucocorticoid-attenuated response39) ；x56123, Talin ；m31419, 204 干扰素活化蛋白；U53219, GTPase IGTP ； 138444, T 细胞特异蛋白；M31418, 202干扰素活化蛋白；d38417,芳香烃(Arylhydrocarbon)受体；m26071,组织因子(mtf)；D13759, Cot 原癌基因；M18194,纤维连接蛋白；u59463, ICH-3 ；M13945, pim-1 原癌基因；L20450, DNA 结合蛋白(参见 Gil 等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci98:6680-6685)。本发明包含 IFN-Y 诱导基因 CIITA (参见例如 Chan 等(2010) J.Leukocyte Biol.88:303-311 ；Kwon等(2007)Mol.1mmunol.44:2841-2849)的用途。
[0117]本发明包含对如下IFN-Y诱导基因中一种或多种的表达的测量，作为用于确认施用药物的患者的资格或选择施用药物的患者的筛选过程。这些基因包括:(基因I)FCGR1A、(基因 2)IL6R、(基因 3)CXCL9、(基因 4) CLCSF14,(基因 5) UBD,(基因 6) C/EBPalpha 和(基因 7)MHC2TA(CIITA)(参见 Waddell 等(2010)PLoS 0NE5:e9753)。还包括这些基因的特定簇在确认资格过程中的用途，例如基因I和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、I和3、I和4、I和5、I和6、I和7、2和4、2和5、2和6、2和7、3和5、3和6、3和7、4和6、4和7、5和7以及这些基因的组合，例如1、2、3 ;或3、4、5 ;或4、5、6 ;或5、6、7 ;或1、
3、4 ;或 1、3、5，或 1、3、6，或 1、3、7 ;或 1、2、4 ;或 1、2、5 ;或 1、2、6 ;或 1、2、7 等等。(这些基 因编号是任意的。)
[0118]本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中小于90%是自噬性的、小于80%是自噬性、小于70%是自噬性、小于60%是自噬性、小于50%是自噬性、小于40%是自噬性等等。
[0119]本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中小于90%是非凋亡性的、小于80%是非凋亡性的、小于70%是非凋亡性的、小于60%是非凋亡性的、小于50%是非凋亡性的、小于40%是非凋亡性的等等。
[0120]本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中小于90%是非粘附性的、小于80%是非粘附性的、小于70%是非粘附性的、小于60%是非粘附性的、小于50%是非粘附性的、小于40%是非粘附性的等等。
[0121]测量MHC II类的表达
[0122]使用对MHC II类基因产物特异的抗体或核酸探针，可以测量MHC II类的表达。这些 MHC II 类产物包括 HLA-DPAl、HLA-DPBU HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA, HLA-DRBl 以及HLA-DM 和 HLA-D0 (参见例如 Apostolopoulos.等(2008)Human Vaccines4:400_409)。
[0123]例如，本发明包含试剂、治疗方法和诊断方法，其要求黑色素瘤细胞表达STATl和STAT2，从而具有活性STATl信号传导通路、具有活性STAT2信号传导通路或者具有活性STATl和STAT2信号传导通路。
[0124]本发明提供药物组合物或药物试剂、相关施用方法以及治疗方法，其导致以下生存数据:危害比(hazard ratio, HR)小于1.0,HR小于0.9,HR小于0.8,HR小于0.7,HR小于0.6,HR小于0.5,HR小于0.4,HR小于0.3等。本发明结果可以为总生存数据、无进展生存数据、疾病进展时间数据等。本发明还提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月PFS。此外，本发明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月总生存率/期。此外，本发明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)PFS。此外，本发明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的I年(或2年)总生存率(参见例如U.S.Dept, of Health and Human Services.Food and Drug Administration.Guidance for Industry.Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugsand biologies(April2005))0
[0125]IFN-y的使用和自噬的诱导
[0126]如通过增加主要组织相容性II类复合体测定，可以在IFN- Y处理后自噬的诱导，来确定对系统性(Systemic)IFN-Y处理的应答。如果在暴露于培养基中IFN-Y后，活检的黑色素瘤肿瘤细胞发生自噬而不是细胞凋亡，则这表明这些患者将有利地对系统性IFN- Y处理应答。此外，如果从活检中确定了成功细胞系，患者也会从细胞治疗产品受益，该细胞治疗产品由来自自噬性但非凋亡性粘附(adherent)群落的经IFN-Y处理的纯化的肿瘤细胞系制得。
[0127]本发明包含分离和表征从自噬性、非凋亡性细胞所分离的主要组织相容性复合体,上述细胞是从用干扰素-Y处理的肿瘤细胞系收集的。主要组织相容性复合体包含对CD4+T细胞特异的抗原，并且已经与抗体介导的免疫应答相关。复合体代表不会存在于非自噬性细胞中的大型抗原库(repertoire)，这是因为在自噬性细胞中诱导的溶酶体介导的抗原加工活动。
[0128]由经IFN-Y处理的细胞系所产生的非凋亡性的、自噬性肿瘤细胞可以与树突细胞整合，以增强抗原呈递，这是因为在自噬性肿瘤细胞的表面上高水平的主要组织相容性复合体。该过程会得到由两种细胞类型融合而产生的新的细胞产物。
[0129]对IFN-Y的应答时诱导自噬的过程可以以不导致细胞凋亡的方式诱导。通过用半胱天冬酶抑制剂和干扰素-Y合并处理肿瘤细胞，可以阻断细胞死亡(并最终阻断耐受性凋亡细胞的形成)的过程，而不抑制自噬的诱导或主要组织相容性II类复合体的增加。
[0130]消除凋亡细胞同 时保留有活力的自噬性细胞的程序
[0131]黑色素瘤的研究表明在临床试验中凋亡细胞的存在与差生存率之间具有相关性(Cornforth等(2011)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131 ;Dillman等(2011)CancerBiother.Radiopharmaceuticals26:407-415)。下面研究调查了在体外 IFN-Y 处理黑色素瘤肿瘤细胞后自噬的诱导、细胞凋亡和MHC II类分子。
[0132]本项研究的方法如下。在测定自噬、细胞凋亡和MHC II类表达之前，用1000IU/mL的IFN-Y培育自体黑色素瘤肿瘤细胞系和模型黑色素瘤肿瘤细胞系72小时。通过采用对LC3II的抗体的免疫印迹并通过采用Enzo’ s CytolD?自噬检测试剂盒的流式细胞法，来
检测自噬。通过使用7-AAD和Annexin-V染色和对MHC II类的抗体的流式细胞法，分别测定细胞凋亡和MHC II类诱导。
[0133]本研究的结果证明IFN-Y既诱导黑色素瘤细胞系中自噬性细胞群落又诱导凋亡性的细胞群落。凋亡性的群落主要发现于非粘附群落中，而自噬性细胞保持粘附到烧瓶上。用抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬会抑制对IFN-Y应答时MHC II类阳性细胞的诱导(39.4%IFN- Y vs.10.0%IFN- y +3_MA)。用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD抑制半胱天冬酶活性来在经IFN-Y处理的细胞中防止细胞凋亡但不干扰自噬(2.75±0.15IFN-Y vs.3.04±0.27IFN-Y+Z-VAD，倍数变化)。综上所述，细胞凋亡的诱导与低水平的自噬和MHC II类诱导有关。本发明提供消除凋亡性的细胞同时保护有活力的自噬性细胞的方法或程序，IFN- Y处理后能够增强这类基于细胞的免疫治疗的有效性。
[0134]已经发现，IFN-Y与对肿瘤的免疫应答的抑制有关(参见例如Hallermalm(2008)J.1mmunol.180:3766-3774 ；Romieu-Mourez(2010)Cancer Res.70:7742-7747 ；Lee (2005)Clinical Cancer Res.11:107-112)。
[0135]肿瘤可以是或多或少分化的细胞的异质性群落。肿瘤的黑色素瘤细胞的IFN-Y处理可以作用于一些较分化的细胞，这些细胞更容易细胞凋亡。通过从抗原源消除这些细胞，所得到的结果是接种后对肿瘤实体(bulk)的一些影响丧失，这可从肿瘤尺寸的消退变慢或者无明显消退看出。研究表明凋亡性细胞不会活化树突细胞(Sauter (2000) J.Exp.Med.191:423-434)。
[0136]IFN-Y可起到使单核细胞分化从DCs偏离到巨噬细胞的作用。制剂中IFN-Y的量可通过使表型偏离到较少特化的巨噬细胞，来影响DCs的不完全分化。
[0137]IFN-Y可用于增强MHC II类分子，并且能对T细胞直接呈递。然而，Ii protein(钙卫蛋白，Calprotectin)与MHC II类分子的联合诱导防止内源性肿瘤抗原从MHC II类分子呈递。
[0138]第一研究的材料和方法
[0139]自体树突细胞生成
[0140]通过如前所述的塑料粘附法(Choi等(1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ;Luft等(1998)Exp.Hematol.26:489-500)，生成树突细胞。简言之，将自体采血术产物进行ficoll-hypaque(GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)密度梯度分离。将所得到的外周血单核细胞置于无抗生素的AIM-V培养基中(Invitrogen, Grand Island, NY),上述培养基补充有在以15X106cells/mL的细胞培养瓶(Corning-Costar，Corning, NY)中各 1000IU/mL 的 IL-4(Ce llGenix, Freisberg, Germany)和 GM-CSF(Beriex, Seattle,WA)(DC培养基)。培育一小时后，丢弃未粘附群落，并将新鲜DC培养基加入到烧瓶中。第二天早晨，丢弃未粘附细胞，用室温PBS将烧瓶洗涤一次，并加入新鲜DC培养基。然后将烧瓶培养6天，在这段时间进行流式细胞评估来测定该方法(负载DC之前)所产生的DC的百分数和表型。
[0141]自体肿瘤细胞系生成
[0142]将先前报道的生成和表征的纯肿瘤细胞扩展到2亿个细胞，然后在15%FBS/ECS 中在 RPMI (完全培养基)中用 1000IU/mL 的 IFN-Y (InterMune, Brisbane, CA)培育72 小时，用来自铯源的 IOOGy 辐照并冻存(Choi (1998)Clin.Cancer Res.4:2709-2716 ；Luft(1998)Exp.Hematol.26:489-500 ；Dillman(1993)J.1mmunother.Emphasis TumorImmunol.14:65-69)，如前所述。从冻存中恢复经IFN-y处理且辐照的肿瘤细胞，用PBS洗涤3次，然后加入体外培养的DC，并培育约24小时。通过用橡皮淀帚轻轻刮取来收获负载了抗原的DC，并以相等的量在9-11个等份中冻存。获得细胞的等分部分，用于流式细胞评价，其代表负载后的DC细胞。
[0143]流式细胞法
[0144]使用对从BD Pharmingen San Diego, CA获得的表面标志物的单克隆抗体:结合PerCp的MHC II类抗体、结合APC的⑶IIc抗体，⑶80抗体、⑶83抗体、结合PE的⑶86抗体，进行树突细胞群落的表型表征。使用同型对照来测定百分阳性细胞。使用来自BDPharmingen的对结合FITC的MHC I和II类的抗体、Annexin-V-PE和7-氨基放线菌素D(7-AAD)，进行肿瘤细胞的流式细胞法。在每个批次之前，使用CaliBRITE流式细胞校准(BDPharmingen)，并且在流式细胞数据的整个收集过程中使用相同的仪器设定。[0145]免疫印迹测定
[0146]用 Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)加蛋白酶抑制剂混合物(Roche, Indianapolis, IN)以10，000细胞/uL在冰上，制备细胞质的细胞裂解物。将大约25uLs/道的细胞裂解物在12.5%Tris-甘氨酸凝胶上分离，转移到PVDF膜，并用针对如下的抗体进行探测:钙网蛋白(MBL，Woburn, MA)、Hsp-60、Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems, Minneapolis, MN)、HMBG-1 (Cell Signaling, Danvers, MA)、ICAM-1 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)、Mel_4、Mart_l(Signet, Emeryville, CA)、酪氨酸酶(Upstate, Lake Placid, NY)和 GADPH(Calbiochem, Darmstadt, Germany)。
[0147]免疫组织化学
[0148]使用免疫细胞化学程序，测定黑色素瘤系对一组(panel)抗原的表达。在存在或不存在 1000IU/mL IFN- Y 的情况下，在 8 室培养载玻片(Thermo Fisher, Rochester, NY)中培养细胞。72小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，并固定在冷丙酮中。阻断内源性过氧化物酶后，用适当的对所列抗原的一抗(primary antibodies)培育细胞。使用生物素化抗鼠(anitmouse)或兔免疫球蛋白、结合超敏感酶的链霉亲和素标记(Super Sensitiveenzyme-conjugated streptavidin Iabeling)和辣根过氧化物酶色原体(chromogen)以及底物试剂盒(Biogenex, San Ramon, CA),进行免疫组织化学。采用同型匹配对照抗体,研究如下抗人多克隆或单克隆抗体的活性:S_100和HMB-45 (Biogenex, San Ramon, CA)、Mel_2、Mel-5、art_l (Signet, Dedham, MA)、酪氨酸酶和 Mage-1 (Thermo Scientific, Fremont, CA)、Me I an-A > HLA-1 类和 HLA-1I 类(Dako, Denmark)。
[0149]统计分析
[0150]在双尾检验的学生t检验中，两样本的方差相等。通过？值< 0.05确定显著差异。
[0151]第一研究的结果
[0152]在完全培养基中，对用IFN-Y培育72小时应答时，在自体黑色素瘤肿瘤细胞系中差异地引起细胞死亡。在经IFN-Y处理的细胞上或者未经IFN-Y处理的细胞上,进行台盼蓝拒染料测定，其表明在经IFN-Y处理的细胞中向更低活力的显著趋势(89.1±6.8%vs.84.9±9.3%, p=0.014, N=47)。通过流式细胞法分析四个自体黑色素瘤细胞系的样本的细胞凋亡诱导(图1A)，其表明黑色素瘤细胞对IFN-Y诱导的细胞凋亡差异地敏感，其中一些细胞显示更迟的细胞凋亡或“死亡”群落(7-AAD+/AnneXin-V+)，而其他细胞显示出更早的细胞凋亡或“即将死亡”群落(7-AAD-/AnneXin-V+)的信号。IFN-Y处理后所得到的凋亡性细胞的存在与无进展生存期和总生存期中显著降低有关(Comforth (2010) CancerImmunol.1mmunother.Resistance to the proapoptotic effects of interferon-gammaon melanoma cells used in patient-specific dendritic cell immunotherapy isassociated with improved overall survival)。对数秩检验(log-rank test)表明IFN-y处理黑色素瘤肿瘤细胞后较低的活力与所研究患者中总生存期明显相关。
[0153]将在存在或不存在IFN-Y的情况下发育的细胞裂解物进行各种分子的免疫印迹，这些分子可能是免疫的重要介导物(图1B)。在用IFN-Y处理的黑色素瘤细胞的设定中，热休克蛋白似乎被差异性地调控，但基本上仍存在于细胞制剂中，尤其是在hsp-70的情况下。内质网蛋白、钙网蛋白和高迁移率族蛋白I(HMGB-1)似乎在某些情况下IFN-Y处理后被正调节(图1B)。相反，普通黑色素瘤抗原(mel-4、Mart-l和酪氨酸酶)通常似乎被IFN-y负调节，而ICAM-1被显著正调节(图1C)，ICAM-1是一种与对淋巴细胞介导的细胞毒性的敏感度有关的淋巴细胞黏附分子(Hamai (2008) Cancer Res.68:9854-9864)。事实上发现，经IFN-Y处理的黑色素瘤肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性更敏感。此外，一组黑色素瘤相关抗原的免疫组织化学表明，IFN- Y导致在许多考查的抗原中抗原表达的负调节(表1)。
[0154]IFN-Y的使用导致主要组织相容性复合体I类和II类的正调节(Bohn(1998)J.1mmunol.161:897-908)。如图1D中所示，用IFN-y处理自体黑色素瘤细胞导致几乎普遍的且显著的MHC I类正调节(ρ=2.8X 10_8),中值倍数诱导(median fold induction)为
2.91 + 1.13(95%C.1.)。此外，MHC II类的平均荧光强度也显著较高，但稍逊色(p=0.039)，中值诱导为4.23±2.66 (95%C.1.)。在自体黑色素瘤细胞表面上MHC II类分子的水平通常低于MHC I类分子，但在70%的情况下，对IFN- Y处理应答时对于MHC II类分子来说诱导高2倍，这是因为MHC II类表达的低初始水平。在抗原负载到树突细胞上时，肿瘤细胞上这些分子的存在可以提供将MHC复合体“易装”(“cross dressing”)到抗原呈递细胞上的机会(Dolan (2006) J.1mmunol.277:6018-6024，Dolan (2006) J.1mmunol.176:1447-1455)。
[0155]用IFN- y培育一组四个代表性自体黑色素瘤细胞系，并等量负载到树突细胞上，然后通过流式细胞法测定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II类的表达。结果表明，在负载经IFN-Y处理的黑色素瘤细胞后，观察到表达⑶83的树突细胞的阳性群落百分数的小幅但明显增加(图2)。此外，在⑶86散点图(左上象限)中标出更多的未经处理的肿瘤细胞，结果是⑶86阳性群落百分数明显减少，表明未经IFN-Y处理的肿瘤细胞仍然存在。此效果最可能地是由于IFN-Y诱导细胞凋亡，因为凋亡性细胞更可能被之前报告的树突细胞吞噬。
[0156]如图3中所示，负载前DC的样本表明其表达CD80(39.0 + 16.2%)、CD83 (7.1 ±6.9%)、CD86(73.6±19.5%)并且是 MHC II 类阳性的，并且具有 96.2±5.0% 活力。负载的DC具有显著更高百分数的⑶83 (9.4±7.1%, p=0.019)和显著更高的平均荧光强度(172.9±79.0, p=0.0009)，表明用经辐照的、IFN- Y处理的肿瘤细胞负载DC在一些树突细胞中诱导成熟(图3B)。
[0157]第一研究讨论
[0158]在抗肿瘤免疫的上下文中，抗原负载、成熟和施用的方案以及在基于树突细胞(DC)的免疫治疗的指导是本领域技术人员已知的。这种类型的治疗包含经纯化的自体肿瘤细胞作用抗原的来源的用途，并且包含与肿瘤相关抗原的患者特异库(repertoire) (Selvan(2010)Melanoma Res.20:280-292 ；DiIIman(2007)CancerBiother.Radiopharm.22:309-321)。一些临床试验使用未纯化的自体实体(bulk)肿瘤。这种抗原来源可能具有已污染的成纤维细胞和坏死组织(0’ROUrke(2007)Melanoma Res.17:316-322)。与肿瘤干细胞有关的抗原可以存在于经纯化的细胞系中(Dillman(2006)New Engl.J.Med.355:1179-1181)。IFN-Y 处理提高 MHC II 类分子的表达。MHC II类分子对于对基于树突细胞的治疗的应答非常重要。存在于吞噬物质中的分子(诸如钙网蛋白、HMGB- 1和热休克蛋白)可对成熟信号有贡献，该贡献可以是除细胞因子混合物贡献之外的贡献。本发明中DCs的制备表现出成熟的趋势，其可与晚期凋亡性细胞的吞噬有关(Ip(2004)J.1mmunol.173:189-196)。已经知晓凋亡性细胞的使用与树突细胞的生成有关，与负载肿瘤细胞裂解物或负载坏死细胞的树突细胞相比，该树突细胞在刺激淋巴细胞IFN-Y分泌方面更有效，表明负载了凋亡性细胞的树突细胞在体内更有效。对IFN- Y的促凋亡(proapoptotic)作用的耐性与更好的临床结果有关(Cornforth (2010)Cancer Immunol.1mmunother.60:123-131 )0 成熟 DC 分泌的白细胞介素-12 (IL-12)可以导致细胞毒性淋巴细胞(CTL ;CD8+T细胞)稳健的活性。活体外成熟是否导致持久的肿瘤免疫的问题已经得到解决。也已经表明，通过未成熟DC诱导调节性T细胞的风险(抑制抗原特异性CTLs)发生在使用细胞因子成熟的DC时。本文调查导致成熟的信号传导活动的顺序的重新评估，以改善DC成熟方案。因此，在本研究中在不需要体外细胞因子成熟的情况下经辐照的肿瘤细胞作为抗原来源的用途可能是DC免疫治疗的更优选的方法，因为本文中的证据表明DC已经开始成熟过程。注射后，这些“正在成熟”("maturing")的DCs可以通过分泌趋化因子，来完成成熟过程，该趋化因子会吸引表达许可(licensing)、抗原特异性⑶40L的⑶4+T细胞。已经证明，诸如树突细胞在对佐剂GM-CSF应答时所产生的CCL17/TARC的血清趋化因子与更好的无进展生存率有关。在某些情况下，树突细胞活化淋巴细胞可能需要诸如⑶80和⑶86的辅助刺激分子的表达。作为成熟的标志物，⑶83表达在成熟树突细胞上，并且可对应于能够诱导更有效免疫应答的树突细胞(Prazma(2008) Immunol.Lett.115:1-8)。这表示在药物组合物中所有细胞中的一部分。在任何药物团中，成熟DCs单独的数目可以与更好的患者应答有关或者可以与更好的患者应答无关。
[0159]第一研究的表
[0160]表1:使用患者特异性细胞基于树突细胞的治疗中黑色素瘤细胞系中对干扰素-Y应答时与普通肿瘤相关的抗原表达水平的变化。
【权利要求】
1.哺乳动物树突细胞群落，其包含: 黑色素瘤特异性肽，其来自从患有黑色素瘤的受试者采集的黑色素瘤细胞； 其中所述黑色素瘤特异性肽由树突细胞从所述黑色素瘤细胞体外获得； 其中所述黑色素瘤细胞未经IFN-Y或IFN-Y模拟物体外处理； 其中超过60%的未经IFN- Y或IFN- Y模拟物体外处理的所述黑色素瘤细胞是自噬性和非凋亡性的，并且 其中树突细胞和黑色素瘤细胞来自相同受试者。
2.如权利要求1所述的树突细胞群落，其中: 超过80%的未经IFN- Y或IFN- Y模拟物体外处理的所述黑色素瘤细胞是自噬性和非凋亡性的。
3.用于如权利要求1所述受试者的疫苗，其包含如权利要求1所述的树突细胞群落。
4.如权利要求1所述的树突细胞，其中基本上所有的未经IFN-Y或IFN-Y模拟物处理的所述黑色素瘤细胞均不能细胞分裂。
5.如权利要求1所述的树突细胞，其中基本上所有的未经IFN-Y或IFN-Y模拟物处理的所述黑色素瘤细胞受到辐照且不能细胞分裂。
6.如权利要求1所述的树突细胞，其中至少80%的未经IFN-Y或IFN- Y模拟物处理的黑色素瘤细胞受到辐照且不能细胞分裂。
7.如权利要求1所述的树突细胞，其中至少80%的未经IFN-Y或IFN- Y模拟物处理的黑色素瘤细胞经核酸交联剂处理且不能细胞分裂。
8.如权利要求1所述的树突细胞，其包含一种或多种衍生自黑色素瘤特异性抗原的肽，所述黑色素瘤特异性抗原为 S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-l、ART-l 或酪氨酸酶。
9.如权利要求1所述的树突细胞，其中所给定的受试者是人受试者。
10.如权利要求1所述的树突细胞，其中所给定的受试者是非人的哺乳动物。
11.黑色素瘤疫苗，其包含: 至少一种成熟树突细胞，所述成熟树突细胞来自患有黑色素瘤的受试者； 其中已经将所述至少一种成熟树突细胞与来自相同受试者的至少一种黑色素瘤肿瘤细胞接触； 其中与所述至少一种成熟树突细胞接触的所述至少黑色素瘤肿瘤细胞是未分裂的、自噬性的和非凋亡性的。
12.刺激对黑色素瘤特异性抗原免疫应答的方法，其包括给受试者施用免疫刺激量的如权利要求1所述的树突细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中被刺激的所述免疫应答包括CD4+T细胞应答、CD8+T细胞应答和B细胞应答中的一种或多种。
14.如权利要求13所述的方法，其中可通过ELISPOT测定、通过细胞内细胞因子染色测定、通过四聚体测定、或者通过检测抗原特异性抗体的产生来测定所述CD4+T细胞应答、CD8+T细胞应答或B细胞应答。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述免疫应答包括含有2年总生存率(OS)的生存时间，并且其中所述2年总生存率至少为60%。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述施用包括皮下注射所述疫苗。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述施用包括将每周给予的所述疫苗注射三个月，然后每月给予的所述疫苗注射五个月。
18.制备树突细胞疫苗的方法，其包含来自相同受试者的黑色素瘤细胞和树突细胞，所述方法包括: 用防止细胞分裂的试剂处理一种或多种黑色素瘤细胞； 不对所述一种或多种黑色素瘤细胞进行干扰素-Y (IFN- Y )或IFN- Y模拟物体外处理； 选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞； 丢弃非自噬性和凋亡性的黑色素瘤细胞；并且其中向一种或多种自体树突细胞提供自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞，或者其中向一种或多种自体树突细胞提供衍生自自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞的肽。
19.组合物，其包含: 至少一种来自第一受试者的未经干扰素-Y (IFN-y)处理的黑色素瘤细胞，和至少一种来自相同第一受试者的抗原呈递细胞(APCs)，其中所述黑色素瘤细胞是: 自噬性的；且 非凋亡性的。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述黑色素瘤细胞能表达MHCII类。
21.如权利要求19所述的组合物，其中所述APCs是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。
22.如权利要求19所述的组合物，其中所述至少一种黑色素瘤细胞包含黑色素瘤特异性肽，并且其中所述黑色素瘤特异性肽基本不包含于所述APCs中，而且黑色素瘤特异性肽基本不被所述APCs加工。
23.如权利要求19所述的组合物，其中所述黑色素瘤细胞包含黑色素瘤特异性肽，并且其中所述黑色素瘤特异性肽基本包含于所述APCs中，而且所述黑色素瘤特异性肽部分地或基本上在APCs中被加工。
24.如权利要求19所述的组合物，其中所述黑色素瘤细胞被负载到APC中。
25.如权利要求19所述的组合物，其中所述黑色素瘤细胞未被负载到APC中。
26.如权利要求19所述的组合物，其中自噬是通过如下测试证明的，该测试测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)。
27.如权利要求19所述的组合物，其中使用7-氨基放线菌素D(7-AAD)试剂或Annexin试剂中至少一种来证明所述细胞是非凋亡性的。
28.在受试者中刺激免疫应答的方法，所述受试者患有黑色素瘤且包含黑色素瘤细胞，其中所述受试者是与第一受试者相同的受试者，包括施用免疫有效量的如权利要求19所述的组合物。
29.如权利要求19所述的组合物，其中至少90%的黑色素细胞未经IFN-Y体外处理，并且小于10%的黑色素细胞经IFN-Y体外处理。
30.制造如权利要求1的疫苗或权利要求19的组合物的方法，其包括将至少一种黑色素瘤肿瘤细胞与至少一种抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述至少一种黑色素瘤肿瘤细胞来自第一人受试者，并且其中所述至少一种APC来自相同的第一人受试者。
31.制备树突细胞疫苗的方法，其包括:用防止细胞分裂的试剂处理从第一受试者获得的黑色素瘤细胞；其中不对所述黑色素瘤细胞进行IFN-Y或IFN-Y模拟物体外处理；选择自噬性和非凋亡性的黑色素瘤细胞；并且将所选择的黑色素瘤细胞与来自相同第一受试者的自体树突细胞接触。
32.组合物，其包含通过如权利要求31所述的方法制得的树突细胞疫苗。
33.刺激 对黑色素瘤特异性抗原免疫应答的方法，其包括给患有黑色素瘤的受试者施用如权利要求31所述的组合物。
【文档编号】A61P35/00GK103917246SQ201280051799
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2011年10月20日
【发明者】安德鲁·康福思, 罗伯特·迪尔曼 申请人:加利福尼亚干细胞公司