减少息肉病和结肠直肠癌的方法

减少息肉病和结肠直肠癌的方法
【专利摘要】本发明提供减少或抑制息肉病或结肠直肠癌的方法。所述方法包括将经修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸的展示的细菌施用于哺乳动物。所述重组细菌的施用促进了所需的治疗响应。所述重组细菌可以单剂量或一系列剂量施用。方法可用于治疗或预防多种息肉相关疾病，例如治疗或林奇综合征、家族性腺瘤性息肉病和结肠直肠癌。
pta-11587
2011.01.10
【专利说明】减少息肉病和结肠直肠癌的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及减少或抑制息肉病和结肠直肠癌的方法和组合物。

【背景技术】
[0002] 鉴别肠道中能提高保护性与致病性炎症之比的细菌组分和最终产物，对于 使胃肠（GI)慢性炎性疾病和恶性肿瘤中的稳态再平衡是重要的。共生的乳杆菌属 (Lactobacillus)物种是人类胃肠道中的天然微生物群栖居者，并且可通过其表面层蛋白 质的相互作用刺激先天细胞以同时产生炎性和调节性细胞因子。脂磷壁酸是乳酸杆菌和其 他乳酸菌的主要细胞壁组分，并且据报道通过特异性模式识别受体（包括TLR2)刺激树突 状细胞（DC)，导致细胞因子释放。通过缺失嗜酸乳杆菌（L.acid 〇philuS)NCFM的磷酸甘油 转移酶基因来中断LTA合成，导致了作用于肠免疫细胞的细菌菌株（NCK2025)增加 IL-10 的产量，下调IL-12水平，并且显著减轻小鼠中硫酸葡聚糖钠（DSS)诱导的以及⑶4+⑶45RB *T 细胞介导的结肠炎（PCT 申请 NO.PCT/US2011/040674 和 Mohamadzadeh，et al.PNAS(20 11) 108Supplementl : 4623-4630 (Mohamadzadeh 等人，《美国国家科学院院刊》，2011 年，第 108卷，增刊1，第4623-4630页））。根据这些观察，LTA-缺陷的嗜酸乳杆菌显示出通过减 轻炎症来改变细菌-宿主相互作用。
[0003] 结肠直肠癌在世界范围内是第三常见的癌症和第四常见的癌症死亡原因 （Weitz et al·，2005, Lancet365 : 153-65 (Weitz 等人，2005 年，《柳叶刀》，第 365 卷，第 153-165 页））。所有结肠直肠癌中大约5-10%遗传了家族性腺瘤性息肉病（FAP)的一种主要形式， 该疾病是其中约80%的受影响个体包含结肠腺瘤性息肉病（APC)基因中的种系突变的常 染色体显性疾病。另外，炎症已显示出在患有息肉病的小鼠中和在人类结肠癌中具有肿瘤 促进作用。调节性T细胞（Tregs)是炎症的强效抑制剂，并且有证据显示其在息肉病和结肠 癌中具有保护作用。然而，Tregs与促炎性细胞及其细胞因子的长期相互作用可逆转Tregs 的抗炎特性并赋予其促炎性。对于淋巴细胞和骨髓细胞之间的相互作用调节促肿瘤与抗肿 瘤免疫性之比已形成共识。然而，肠道菌群组分对息肉病和相关结肠直肠癌的相互作用尚 未阐明。
[0004] 本领域需要另外的方法和组合物来改善息肉病的治疗并且减低结肠直肠癌的发 生率。


【发明内容】

[0005] 本发明提供减少或抑制息肉病或结肠直肠癌的方法。所述方法包括将经修饰以减 少细胞表面上脂磷壁酸的展示的细菌施用于哺乳动物。修饰细菌的施用促进了所需的治疗 响应。修饰细菌可以单剂量或一系列剂量施用。方法可用于治疗或预防多种息肉相关疾病， 例如治疗或预防林奇综合征、家族性腺瘤性息肉病和结肠直肠癌。

【专利附图】

【附图说明】
[0006] 图1报道了用PBS、NCK56或NCK2025处理的充满息肉的小鼠中息肉的状态。PBS， η = 6。NCK56和NCK2025, η = 5。（a)对回肠和结肠中的息肉进行计数，结果使用盒须图 表示。（b)用PBS(上）或NCK2025(下）处理的小鼠的代表性结肠的照片。（c)用PBS、 NCK56或NCK2025处理的小鼠息肉中Ki-67+和TUNEL+细胞的定量。（d)Ki-67 (上图）和 TUNEL(下图）的结肠息肉的染色；用PBS、NCK56或NCK2025处理的小鼠的石蜡包埋组织的 6 μ m 切片。柱条表不 50 μ m。（***p < 0· 0001 ;**p < 0· 004 ;*p < 0· 0176)
[0007] 图2示出了嗜酸乳杆菌菌株减少TS4CreXcAPClox468中息肉内炎症。（a)CAE+ 肥大细胞，η = 4小鼠；(b)Grl+嗜中性粒细胞和粒细胞（ganulocyte), η = 5或更多；（c) F4/80+巨噬细胞，η = 5或更多；（d)息肉内CAE+细胞的频率，< 0. 0001 ;(e)息肉内 Grl+细胞的频率，< 0. 0005 ; (f)息肉内F4/80+细胞的频率，#p < 0. 006。黑色尺 寸条表示50 μ m，黑色箭头表示肥大细胞，白色箭头表示F480+或Grl+细胞，对于对照组和 NCK2025组，η = 3 ;对于Nck56组，η = 5。示出SEM(均值标准误差）误差条。
[0008] 图3表示对表达免疫抑制性和促炎性细胞因子的DC(树突状细胞）在息肉和 正常邻近组织中的浸润的定量。（a)CDllc+IL-10+，< 0.0001，#ρ < 0.001 ;(b) Q)llc+IL-12+,**p < 0· 006, (**)p < 0· 004 ; (c)Q)llc+TNFa +,***p < 〇· 〇〇〇5,*p < 0· 01 ; (d)CDllc+CD103+*#p < 0.0009, *p < 0.05。与息肉外相比息肉内 CD103+DC 显著增加， **p < 0. 0014。白色尺寸条表示50 μ m，白色箭头表示双阳性细胞。
[0009] 图4示出了息肉浸润性Tregs和辅助⑶4T-细胞的质量的变化。图示息肉浸润 性（a)涵盖抗炎性和促炎性亚型二者的⑶4+Foxp3+Tregs，（b)涵盖抗炎性和促炎性Tregs 以及促炎性T-细胞的ROR γ t和/或Foxp3的细胞表达，（c)⑶4+IFN γ +促炎性T-细胞； 小鼠未处理或用PBS、NCK56或NCK2025处理，如图所示。对息肉和正常邻近组织中以下 四者的定量：（d)涵盖抗炎性和促炎性亚型二者的CD4+F 〇Xp3+TregS，*p < *0· 004,（e) ROR Y t-Foxp3+ 抗炎性 Treg，林p < 0· 0〇2n = 5，*p < 0· (Mn = 5，（f) ROR γ t+Foxp3+ 促 炎性 Tregs，#p < 0· 008η = 3PBS&5NCK2025，（g) ROR γ t+Foxp3-促炎性 T-细胞，趋势无 统计意义上的显著性，（h)⑶4+IFN γ +促炎性效应T-细胞，*ρ < 0. 016η = 5。尺寸条表示 50 μ m，白色箭头表示F4/80+或Grl+细胞。
[0010]图5示出了嗜酸乳杆菌菌株减少充满息肉的小鼠中的全身性炎症。（a)未处理或 用嗜酸乳杆菌菌株处理的充满息肉的小鼠中的脾脏重量；*P < 〇. 026。（b)未处理和处理的 充满息肉的小鼠的脾脏和MLN中⑶4+Foxp3-效应T-细胞和⑶4+F〇xp3+Treg-细胞的频率； 脾脏 CD4+*p < 0· 065，脾脏 Tregs p < 0· 026，PBS η = 3，NCK56n = 5，NCK2025n = 3。（c) 未处理或处理的小鼠的脾脏来源的MNC中⑶llb+F4/80+巨噬细胞、⑶llb+Grl+嗜中性粒细 胞/粒细胞和⑶Ilb+⑶Ilc+树突状细胞的频率；脾脏⑶llb+F4/80+细胞***p < 0. 0001， 脾脏 CDllb+Grl+ 细胞 ***p < 0· 0004, PBS η = 3, NCK56n = 5, NCK2025n = 3。（c)肠系 膜淋巴结（MLN)来源的MNC中的相同频率。柱状图示出了经编辑的结果，带有SEM ;显示的 趋势无统计意义上的显著性。黑色柱条是未处理的，灰色是NCK56,白色柱条是NCK2025处 理的小鼠。
[0011] 图6示出了用嗜酸乳杆菌菌株处理充满息肉的小鼠对于小鼠中血清细胞因子水 平的影响。数据以 NCK2025/NCK56/PBS 的顺序列出。IL-6 : 23. 16+3. 03/45. 60+2. 21/82. 72+32. 06，与 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0· 039，与 NCK56 相比 NCK20225 的 p = 0· 009 ; IFN- g : 5· 11 ±2. 13/2. 79+1. 39/9. 08+3. 17 ;TNF-a : 1〇· 33+2. 66/16. 79+4. 02/16. 19+1. 77 ;I L-IO : 18. 95+95/16. 07+4. 89/39. 14+4. 31，与 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0· 002,与 PBS 相比 NCK56 的 p = 0· 03 ;VEGF : 3. 19+1. 13/18. 11±9· 98/12. 46+7. 42,与 NCK56 相比 NCK2025 的 p = 0· 008 ;G-CSF : 573. 3 ±109. 1/9361+638. 8/7689+1436,与 PBS 和 NCK56 相比 NCK2025 的 p < 0· 0001 ;IL-12p70 : 34. 15+15. 46/69. 76+8. 60/24. 64+3. 50,与 PBS 相比 NCK56 的 p = 0· 001 ;IL-22 : 59. 57+5. 65/31. 85+4. 18/19. 89+12. 60,与 PBS 相比 NCK2025 的 p = 0. 005 ;p值在达到统计学意义时给出。NCK2025, η = 5小鼠；NCK56, η = 2小鼠；PBS，η = 3小鼠；每个均重复进行测试。

【具体实施方式】
[0012] 下文将参照附图更完整地描述本发明，附图中示出了一些但并非全部本发明的实 施例。实际上，这些发明可以多种不同的形式体现，并且不应理解为限制于本文示出的实施 例；相反，提供这些实施例使得本公开满足适用法律要求。在全文中同样的编号表示同样的 元件。
[0013] 这些发明所属领域的技术人员得益于具有上述说明和相关附图呈现的教导内容， 将会想到本文示出的这些发明的多个修改和其他实施例。因此，应当理解本发明不限于所 公开的具体实施例，并且还旨在将修改和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然 本文使用了具体术语，但它们仅以通用和描述意义使用，并且不出于限制目的。
[0014] 概述
[0015] 提供了减少受试者中息肉病的方法，包括治疗或预防结肠直肠癌的方法。此类方 法可用于使用经修饰以减少细菌细胞表面上LTA的展示的细菌来减低胃肠道中的炎症。肠 道炎症是息肉病的促进因素，所述息肉病随后可发展为结肠直肠癌。因此，本文提供的方法 利用修饰的细菌菌株归一化（normalize)先天和适应性免疫响应，以预防和治疗息肉病和 结肠直肠癌。
[0016] 治疗或ΜΦ息肉病发牛率的方法
[0017] 提供了治疗或减少哺乳动物中息肉病发生率的方法，该方法包括施用经修饰以减 少细菌表面上LTA的展示的细菌。在一些实施例中，LTA的展示减少的细菌菌株可改善确 立的息肉病的症状，并且预防结肠直肠癌的发病。在一些实施例中，提供了减少息肉内的有 丝分裂活性、减少息肉内肥大细胞计数以及减少骨髓细胞的息肉内密度的方法。
[0018] "治疗"或"减低"或"减少"在本文中定义为治愈、痊愈、缓减、减轻、改变、医治、改 善、完善或影响患有息肉病或结肠直肠癌的哺乳动物的病症或症状。因此息肉病的减少可 包括例如息肉病的至少一个症状或指标减少至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%、90%或100%。息肉病的症状或指标包括但不限于：息肉内有丝分裂活性、骨髓 细胞密度（例如Grl+粒细胞）、息肉内肥大细胞计数、息肉内巨噬细胞计数（例如F4/80+巨 噬细胞）、息肉内嗜中性粒细胞计数、息肉内树突状细胞计数、息肉内炎症（例如促炎性细 胞）、脾脏尺寸、脾脏巨噬细胞计数、脾脏粒细胞计数、促炎性Treg细胞计数、结肠或肠道炎 症以及肠道、结肠或直肠中息肉的数量。息肉病的症状和指标的测定方法是本领域已知的， 并且在本文别处有描述。待治疗的哺乳动物可患有息肉病或结肠直肠癌或存在患有息肉病 或结肠直肠癌的风险，包括例如患有林奇综合征（遗传性非息肉病）、家族性腺瘤性息肉病 (FAP)、MUTYH-相关息肉病、肥大细胞增多症、脾肿大、糖尿病或自体免疫疾病（如干燥综合 症）或存在患有这些疾病的风险。
[0019] LTA-缺陷细菌的施用可出于预防或治疗目的。所谓"预防"或"抑制"是指预防性 提供重组细菌，即在任何症状之前提供细菌。细菌的预防施用起到预防或减轻息肉病或结 肠直肠癌的任何后续症状的作用。在一些实施例中，预防或抑制息肉病包括其中在LTA-缺 陷细菌的首次施用后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或 大于30天不形成息肉的病症。在一些实施例中，预防或抑制息肉病包括其中在LTA-缺陷 细菌的最终施用后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或大 于30天不形成息肉的病症。当被提供以减少息肉病时，细菌在症状的发作或息肉的形成时 (或不久之后）提供。细菌的施用因此可起到减轻包括息肉的生长或分裂在内的任何实际 症状的作用。
[0020] 所谓"受试者"是指哺乳动物。在具体实施例中，受试哺乳动物是灵长类或人。在 其他实施例中，受试者包括驯养哺乳动物，例如猫科动物或犬科动物，或耕作动物，例如反 刍动物、马、猪、家禽或绵羊。在具体实施例中，经历本文所述的细菌菌株治疗或预防的受试 者是人。在一些实施例中，经历治疗的人可以是新生儿、婴儿、学步的幼儿、青春期前的儿 童、青少年或成人。本发明的受试者可遭受息肉病或结肠直肠癌的症状或可存在发展息肉 病的风险。
[0021] 息肉病
[0022] 本文公开的方法涉及息肉病的治疗和预防。如本文所用，术语"息肉病"是指以存 在至少一种息肉为特征的病症。在一些实施例中，息肉病具有基因或遗传因素，例如林奇综 合征（遗传性非息肉病，HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病（FAP)和MUTYH-相关息肉病（MAP)。 在一些实施例中，息肉病是指结肠直肠癌或结肠癌。
[0023] 术语"息肉"或"瘤形成"是指从粘膜突起的组织的异常生长。本文所述的息肉可 以是增生性息肉、腺瘤性息肉（腺瘤）、炎性息肉或任何其他类型的息肉。如本文所用，赘生 性息肉可以是腺瘤性息肉或恶性息肉。就结肠直肠腺瘤（腺瘤性息肉）而言，异常生长局 限于粘膜。如果该非典型生长延伸穿过粘膜肌层、粘膜下的肌肉层，并且损坏解剖壁，则异 常生长称为结肠直肠癌或恶性息肉。
[0024] 如本文所用，"结肠直肠癌"或"结肠癌"是指以具有至少一种结肠直肠癌为特征的 病症。结肠直肠癌可包括所有形式的胃肠道或结肠的癌症。结肠直肠癌可包括偶发性和遗 传性结肠直肠癌。结肠直肠癌可包括恶性结肠肿瘤、原位恶性肿瘤、典型类癌瘤和非典型类 癌瘤。结肠直肠癌还可包括腺癌、鳞状上皮细胞癌和腺鳞状细胞癌。结肠直肠癌可与选自 遗传性非息肉病性结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加特纳综合征、黑斑息肉综合征、特 科特综合征和幼年性息肉病的遗传性综合征相关。如本文所述，结肠癌可由选自遗传性非 息肉病性结肠直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加特纳综合征、黑斑息肉综合征、特科特综合 征和幼年性息肉病的遗传性综合征引起。
[0025] 在一些实施例中，息肉可见于胃肠道或直肠中。如本文所用，"胃肠道"包括胃窦、 十二指肠、空肠、回肠和结肠。
[0026] 在一些实施例中，本文所述的细菌施用给存在发展息肉病或结肠直肠癌的风险因 素的哺乳动物。如本文所用，发展息肉病或结肠直肠癌的风险因素包括遗传风险因素或生 活方式风险因素。遗传风险因素包括但不限于：具有肿瘤抑制基因如结肠腺瘤性息肉病 (APC)基因的突变，或具有错配修复（MMR)基因如SCH2、MLH1、MSH6和PMS2基因的突变。生 活方式风险因素包括但不限于：升高的身体质量指数（BMI)、肥胖、低体力活动、红肉和加 工肉制品、细粮、甜食和醇的高消耗量以及水果和蔬菜的低消耗量。
[0027] 在一些实施例中，息肉病的减少以息肉内有丝分裂活性的减少为特征。如本文所 用，"息肉内有丝分裂活性"是指息肉中细胞的分裂或增殖。例如，息肉内有丝分裂活性可通 过定量Ki-67 +或TUNEL+细胞的群体或密度来测量。测量Ki-67+或TUNEL+细胞的方法是本 领域已知的，并且在本文别处有描述。
[0028] 在一些实施例中，息肉病的减少以息肉内炎症的减少为特征。如本文所用，"息肉 内炎症"是指至少一种息肉内的组织的炎症。息肉内炎症的减少可在LTA-缺陷细菌施用后 通过鉴别抗炎性细胞因子水平的增加，或促炎性细胞因子水平的减少或它们的任何组合来 测量。在一些实施例中，息肉内炎症的减少在LTA-缺陷细菌施用后通过测量增加的抗炎性 Tregs与促炎性Tregs的比率来鉴别。
[0029] 如本文所用，术语"促炎性细胞因子"是指有利于炎症的免疫调节细胞因子。本发 明的促炎性细胞因子包括 ILl-a、ILl-β、TNF-a、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、 IL-17、IL-18、TNF-a、LT、LIF、制瘤素或 IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
[0030] 如本文所用，术语"抗炎性细胞因子"是指在具有该细胞因子的受体的细胞中引 起抗炎性响应的天然存在的或重组的蛋白、其类似物或其片段。本发明的抗炎性细胞因子 可以是控制促炎性细胞因子响应的免疫调节分子。本发明的抗炎性细胞因子包括白介素 (IL)-I 受体拮抗剂、IL-4、IL-10、IL-Il 和 IL-13、IL-16、IFN-a、TGF-β、G-CSF。
[0031] 如本文所用，术语"抗炎性调节性T细胞"或"抗炎性Tregs "或"天然调节性T细 胞"或"nTregs"或"良性Tregs"是指表达抗炎性细胞因子，例如⑶4+F 〇Xp3+TregS的调节 性T细胞。抗炎性Tregs可通过ROR γ t的表达和Foxp3的缺失而丧失其抗炎特性，导致转 化为TH17细胞。或者，它们可共表达Foxp3和ROR γ t，保持T-细胞抑制特性，但获得促炎 性功能。在两种情况下，Tregs抗炎特性的丧失可促使病原性炎症的逐步升级和息肉病的 进展。抗炎性调节性T细胞可产生抗炎性细胞因子，例如IL-10。如本文所用，术语"促炎 性调节性T细胞"是指表达促炎性细胞因子如F 〇Xp3+R0R γ t+Tregs的调节性T细胞。
[0032] 治疗有效量
[0033] 所谓"治疗有效剂量"、"治疗有效量"或"有效量"是指当施用给受试者时减少息 肉病或预防息肉病的发展、增加或进展的LTA-缺陷细菌的量。"积极治疗响应"是指例如改 善息肉病或结肠直肠癌的至少一种症状或指标的状况。
[0034] 治疗剂的有效量根据预期目标确定。术语"单位剂量"是指适用于受试者的物理上 分立的单位，每个单位包含预定量的治疗组合物，该量经计算以产生与其施用即适当的途 径和治疗方案相关的所需响应。根据治疗次数和单位剂量二者的施用量取决于待治疗的受 试者、受试者的状态和所需的保护。精确量的治疗组合物还取决于专业人员的判断，并且仅 限于每个个体。一般来讲，LTA-缺陷细菌的剂量将根据例如患者的年龄、体重、身高、性别、 一般医疗状况和既往病史的因素而变化。在特定实施例中，期望在大约IO 4至约l〇12CFU、IO5 至10nCFU、IO6至101° CFU、IO8至IOltlCFU或IO8至IO12CFU/剂量的范围内施用细菌。
[0035] 在一些实施例中，该方法包括施用多剂量细菌。该方法可包括施用1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多治疗有效剂量的包含本文所述的细菌的组合物。在一 些实施例中，剂量在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或多于30 天的过程中施用。在一些实施例中，该方法包括连续施用细菌。例如，多剂量组合物的施用 频率和持续时间是使得减低或预防炎性响应从而治疗或预防肠胃疾病的施用频率和持续 时间。此外，用治疗有效量的本发明重组细菌治疗受试者可包括单次治疗或可包括一系列 治疗。还应当理解用于治疗的有效剂量的细菌可在具体治疗过程中增加或减少。剂量的变 化可得自本领域已知和本文所述的检测息肉病的诊断测定法的结果并且从该结果显而易 见。
[0036] 药物纟目合物
[0037] 在一些实施例中，将LTA的展示减少的细菌菌株以保健食品组合物 (nutraceutical composition)例如营养补充剂和/或食品添加剂的形式施用给受试者。 在具体实施例中，药物或保健食品组合物包含经修饰以减少编码磷酸甘油转移酶的多核苷 酸或多肽的表达的LTA-缺陷细菌。在其他实施例中，将提取物以药物组合物的形式施用给 受试者。施用可包括单剂量或多剂量施用，如本文别处所述。
[0038] 药物组合物可以是液体制剂或固体制剂。当药物组合物是固体制剂时，其可配制 为片剂、吮吸片剂、咀嚼片剂、咀嚼胶、胶囊剂、小药囊、粉末、颗粒剂、包衣颗粒、包衣片剂、 肠溶包衣片剂、肠溶包衣胶囊剂、熔化条或膜剂。当药物组合物是液体制剂时，其可配制为 口服溶液剂、混悬剂、乳剂或糖浆剂。药物组合物可以鼻腔、口腔、阴道或肛门途径施用。对 于肛门递送，可使用栓剂。栓剂可包含粘结剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。该组 合物还可以局部制剂或静脉注射形式递送。所述组合物还可包含独立地选自但不限于乳酸 发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白质的载体材 料。
[0039] 如本文所用，术语"药物组合物"可配制为食物组合物、膳食补充剂、功能性食品、 医疗食品或营养品，只要实现所需效果，即治疗或预防息肉病或结肠直肠癌。所述食物组合 物可选自：饮料、酸奶、汁、冰淇淋、面包、饼干、薄脆饼干、谷物、健康条状食品、涂抹料和营 养品。食物组合物还可包含载体材料，其中所述载体材料选自乳酸发酵食品、发酵乳制品、 非发酵乳制品（如，牛奶）、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白质。
[0040] 根据本发明的、根据本发明使用的或根据本发明制备的药物组合物也可包含其他 物质，例如熟知的惰性载体或可药用佐剂、载体、防腐剂等。
[0041] 本公开还包括重组细菌彼此和/或与一种或多种可用于治疗息肉病或结肠直肠 癌的其他药剂的组合。例如，本发明的细菌可与有效剂量的治疗息肉病或结肠直肠癌的 常规抗炎性剂组合施用，所述常规抗炎性剂例如化学治疗剂FOLFOX(甲酰四氢叶酸[亚叶 酸]、5-FU和奥沙利钼）、F0LF0X(甲酰四氢叶酸[亚叶酸]、5-FU和奥沙利钼）XapeOX (卡 培他滨和奥沙利钼）、贝伐单抗、西妥昔单抗、5-FU和甲酰四氢叶酸、F0LF0XIRI (甲酰四氢 叶酸、5-FU、奥沙利钼和伊立替康）、含或不含西妥昔单抗的伊立替康、西妥昔单抗或帕尼单 抗。术语"组合施用"是指活性剂的同时和按顺序施用。当然组合治疗不限于本文提供的 试剂，而是包括任何治疗息肉病或结肠直肠癌的组合物。
[0042] LTA的展示ΜΦ的修饰细菌细朐
[0043] 本文提供的治疗、减少或预防息肉病的各种方法利用细胞表面上LTA展示减少 的修饰细菌细胞。如本文所用，当与适当的对照比较时，细胞表面上或细胞表面的LTA展 示减少包括细胞表面上展示的LTA水平的任何统计意义上的显著减少。此类减少可包括 例如细胞表面上展示的LTA的量减少至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%、90%或100%。测定细胞表面上LTA的量的方法包括例如丁醇和疏水相互作用色谱法 (Morath S，Geyer A，&Hartung T (2001)J Exp Medl93(3) :393-397(Morath S、Geyer A 和 Hartung T，2001年，《实验医学杂志》，第193卷，第3期，第393-397页））或酶联免疫吸附 测定（ELISA)(Tadler et al. (2005) J Clin Lab Anal. 1989 ;3(1) :21 (Tadler 等人，2005 年，《（临床实验室分析杂志》，1989年，第3卷，第1期，第21页））。如本文所用，"LTA的 展示减少"涵盖细胞表面上LTA的展示的改变。细胞表面上LTA的展示的改变意指涵盖任 何与野生型细菌表面上的LTA结构不同的LTA结构。因此，如本文所用，"LTA-缺陷"细菌 是指细胞表面上LTA的展示改变或减少的细菌。在一些实施例中，本文所述方法中使用的 LTA-缺陷细菌是在 PCT 申请 No. PCT/US2011/040674 和 Mohamadzadeh，et al. PNAS (2011) 108Supplementl : 4623-4630 (Mohamadzadeh 等人，《美国国家科学院院刊》，2011 年，第 108 卷，增刊1，第4623-4630页）中详细描述的嗜酸乳杆菌NCK2025,这些文献全文以引用方式 并入本文。
[0044] 如本文所用，术语"表面"、"细胞表面"或"细菌表面"是指细胞质膜外部和包括细 胞质膜的细菌细胞区域。革兰氏阳性菌包含细胞质膜外部的肽聚糖层以及其中散布的磷壁 酸。革兰氏阴性菌还包含覆盖肽聚糖层的外膜。因此，根据本发明的表面上LTA的展示可 以在革兰氏阳性菌的细胞质膜或肽聚糖层之中或之上，或在革兰氏阴性菌的细胞质膜、肽 聚糖层或外膜之中或之上。
[0045] 用于本文公开的方法的细菌细胞经基因修饰以减少细胞表面上LTA的展示。如本 文所用，术语"重组细菌"或"重组细菌细胞"是指其中至少一个基因变更已作用于所关注 基因的细菌或多个细菌细胞，或经如此变更而包含该基因变更的细胞的子代细胞。因此，如 本文所用，术语"经基因修饰的"或"基因修饰"是指已作用于所关注的基因或核酸序列的 基因变更，例如缺失、添加或置换。在一些实施例中，基因变更是通过突变或重组技术手工 产生的变更。在一些实施例中，手工使用的突变技术是基于选择的诱变技术，其中所选择的 细菌具有基因修饰以及减少或改变的LTA展示。
[0046] 在一些实施例中，基因变更包括将异源多核苷酸引入细菌细胞的基因组中。如本 文所用，针对序列所谓的"异源"为来源于外来物种的序列，或者，如果来源于相同物种的 话，则通过有意的人为干预对其天然形式的组成和/或基因座进行了实质性修饰。例如，有 效连接至异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来 自于相同/相似物种的话，则对一者或二者从其初始形式和/或基因座进行了实质性的修 饰，或启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。
[0047] 任何所关注的细菌均可用于本文所述的方法。在具体实施例中，细菌包括益生 菌。如本文所用，术语"益生菌"是指当适量施用时赋予宿主健康有益效果的活微生物 (FA02001 :参见网站 isapp. net/docs/ProbioticDefinition. pdf)或至少一种有助于受试 者肠道的健康和平衡的生物体。在具体实施例中，也称为"友好"、"有益"或"优良"细菌，当 由受试者摄入时，有助于维持肠道健康，并且有助于部分或完全减轻疾病的一种或多种症 状。如本文所用，"益生菌特性"包括增强肠道功能和稳定性；改善对感染性和非感染性疾 病的保护；免疫系统调节；减轻乳糖不耐症；改善消化和营养物质吸收；减低血胆固醇；减 低过敏风险；以及减低尿道感染风险。在一些实施例中，益生特性包括接受益生菌的受试者 中产生的抗炎性细胞因子增加，接受益生菌的受试者中产生的促炎性细胞因子减少或接受 益生菌的受试者中产生的抗炎性与促炎性细胞因子的比率增加。
[0048] 在一些实施例中，本文所述的细菌经修饰或选择以增强一种或多于一种益生特 性。例如，在一些实施例中，用于本方法的细菌经修饰以增加对胃肠上皮的粘附，并且还经 修饰以减少细胞表面上LTA的展示。在其他实施例中，用于本方法的细菌经修饰以增加对 酸或胆汁的耐受性，或增加胆汁盐水解酶活性，并且还经修饰以减少细胞表面上LTA的展 示。在其他实施例中，用于本方法的细菌经修饰以从膳食组分生成微生物代谢物，例如雌马 酚（equol)或其他有益糖苷元,并且还经修饰以减少细胞表面上LTA的展示。在一些实施例 中，用于本方法的细菌经修饰以减低DNA损伤，或增加针对化学致癌物的抗基因毒性特性， 并且还经修饰或选择以减少细胞表面上LTA的展示。在一些实施例中，用于本方法的细菌 经修饰或选择以增加谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物 酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、草酸利用率或丁酸产量。
[0049] 在某些实施例中，细菌是乳酸细菌。如本文所用，"乳酸细菌"是指选自如下属的 细菌：气球菌属（Aerococcus)、肉杆菌属（Carnobacterium)、肠球菌属（Enterococcus)、 乳球菌属（Lactococcus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、明串珠菌属（Leuconostoc)、酒球 菌属（Oenococcus)、片球菌属（Pediococcus)、链球菌属（Streptococcus)、蜜蜂球菌属 (Melissococcus)、差异球菌属（Alloiococcus)、狡诈球菌属（Dolosigranulum)、乳球形菌 属（Lactosphaera)、四联球菌属（Tetragenococcus)、漫游球菌属（Vagococcus)和魏斯氏 菌属（Weissella) (Holzapfel et al. (2001)Am.J. Clin. Nutr. 73 : 365S_373S(Holzapfel 等人，2001年，《美国临床营养学杂志》，第73卷，第365S-373S页）；Sneath，ed. (1986) Bergeyj s Manual of Systematic Bacteriology Vol2, Lippincott, Williams and Wilkins, Hagerstown, MD) (Sneath编辑，1986年，《伯杰氏系统细菌学手册》，第2卷， Lippincott、Williams 和 Wilkins，马里兰州黑格斯敦））。
[0050] 在一些实施例中，使用乳杆菌。所谓"乳杆菌"意指来自乳杆菌属的任何细 菌，包括但不限于干酪乳杆菌（Lcasei)、类干酪乳杆菌（Lparacasei)、罗伊氏乳杆菌 (L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌（L. /ohnsonni)、加氏乳杆 菌（L.gasseri)、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus)、植物乳杆菌（L.plantarum)、发酵乳杆菌 (L. fermentum)、唾液乳杆菌（L. salivarius)、惰性乳杆菌（L. iners)、保加利亚乳杆菌 (L.bulgaricus)，以及 Wood 等人概述的多种其他物种（Holzapfel and Wood，eds. (1995) The Genera ofLactic Acid Bacteria,Vol. 2· , Springer,New York(Holzapfel 和 Wood 编 辑，1995年，《乳酸菌的属》，第2卷，施普林格，纽约））。在具体实施例中，细菌是嗜酸乳杆 菌 NCK2025。
[0051] LTA的展示减少的细菌的产生、此类细菌的起子培养物的制备以及底物尤 其是食物底物例如牛奶和益生元低聚糖（如，半乳糖-低聚糖或果糖-低聚糖）的 发酵方法可根据已知技术进行，包括但不限于：Mayra-Makineii and Bigret(1993) Lactic Acid Bacteria. Salminen and vonffright eds.Marcel Dekker, Inc. New York. 65-96 ( 和 Bigret，1993 年，《乳酸菌》，Salminen 和 vonWright 编 辑，Marcel Dekker 公司，纽约，第 6δ_96 页）；Sandine(l996)Dairy Starter Cultures Cogan and Accolas eds. VCH Publishers，New York. 191-206 (Sandine，1996 年，《乳品起 子培养物》，Cogan和Accolas编辑，VCH出版社，纽约，第191-206页）；Gilliland (1985) Bacterial Starter Cultures for Food. CRC Press, Boca Raton, Florida(Gilliland, 1985年，《食品的细菌起子培养物》，CRC出版社，佛罗里达州博卡拉顿）中描述的那些技术。 在一些实施例中，LTA-缺陷细菌通常被认为是安全的（GRAS)。
[0052] 本文所述的细菌细胞可在合适的培养基中培养，如通常在Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) (Sambrook 等人，1989 年，《分子克隆： 实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港）中所描述。
[0053] 在一些实施例中，本文所述的细菌菌株是这样的细菌的生物学上纯的培养物，该 细菌包含至少一种导致本文所述的细胞表面上LTA的展示减少的基因变更。在另外的实施 例中，细菌包含一种或多种核苷酸添加、缺失和/或置换。这些菌株可包括但不限于：嗜酸 乳杆菌、加氏乳杆菌、约汉逊氏乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌（Lactococcus Iactis)、嗜 热链球菌（Streptoccus thermophilus)和肠球菌属物种。所谓"生物学上纯的"是指90%、 95%、96 %、97%、98 %、99 %或100 %不含其他细菌细胞。在其他实施例中，本文所述的细菌 菌株与其他细菌菌株组合存在而生成混合培养物。
[0054] "对照"或"对照细胞"或"对照细菌"提供了测量重组细菌细胞表型变化的基准点。 对照细菌可包括，例如：（a)野生型细菌，即与导致产生主题细菌的基因变更的起始材料有 相同的基因型；或（b)与起始材料基因型相同但已用无效构建体（即对所关注的性状不具 有已知效果的构建体，例如包含标记基因的构建体）转化的细菌。
[0055] 表面上LTA的展示减少或改变的重组生物体可使用多种技术构建。在本发明中， 可减少编码一种LTA组装途径的至少一种酶例如磷酸甘油转移酶或糖基转移酶的多核苷 酸或多肽的表达，如本文所述。
[0056] 在一个实施例中，包含磷酸甘油转移酶的LTA-相关多肽的水平减少。磷酸甘油转 移酶是涉及Gro-P单元转移至糖脂从而延伸LTA链的多肽。各种磷酸甘油转移酶多肽和编 码所述多肽的基因是已知的。如本文所用，磷酸甘油转移酶涵盖LTA合酶（LtaS)、甘油磷 酸转移酶、甘油磷酸转移酶以及任何其他催化Gro-P单元转移形成LTA的聚甘油磷酸主链 的多肽。磷酸甘油转移酶是碱性磷酸酶超家族的成员（MdoB [C0G1368]磷酸甘油转移酶）。 参见,例如NCBI登录号NZ_ACGX01000068. 1和NC_010609. 1。这些参考文献中的每一个以 引用方式并入本文。
[0057] 在另一个实施例中，细胞表面上LTA的展示改变或减少的细菌可使糖基转移酶的 表达减少。在该实施例中，糖基转移酶的水平使用本文别处所述的减少多核苷酸或多肽水 平的方法中的任何一个方法来减少。糖基转移酶是涉及糖脂和LTA的脂质锚的合成的多 肽。糖基转移酶多肽和编码该多肽的基因是已知的。如本文所用，术语糖基转移酶是指任 何催化糖脂或LTA的脂质锚的合成的多肽，包括例如YgpP、Ugt、BgsA、IagA、LafA或LafB。 糖基转移酶是糖基转移酶超家族的成员[C110013]。各种糖基转移酶是已知的。 参见例如NCBI登录号NC_010609. 1和EF138835. 1。这些参考物中的每一个以引用方式并 入本文。
[0058] 磷壁酸上D-Ala置换的质量和水平可减少或改变细胞表面上LTA的展示。D-丙 氨酰-LTA的合成需要dlt操纵子DltA、DltB、DltC或DltD编码的四个蛋白质。因此，在 一些实施例中，LTA-相关多核苷酸或多肽可包括Dlt操纵子中示出的多核苷酸或多肽，包 括SEQ ID NO : 9-16。因此，在另一个实施例中，DltA、DltB、DltC或DltD的水平减少。 dlt操纵子的各种成员是已知的。参见例如NCBI登录号AAF09201 (DltA)、NCBI登录号 AAB17658. I (DltB)、NCBI 登录号 CAR86674. I (DltC)和 NCBI 登录号 CAQ6598L I (DltD)。这 些参考物中的每一个以引用方式并入本文。LTA的结构可通过NMR和MS使用已知的技术测 量。参见例如 Morath S，Geyer A，&Hartung T (2001) J Exp Meadl93 (3) :393-397 (Morath S、Geyer A和Hartung T，2001年，《（实验医学杂志》，第193卷，第3期，第393-397页）。
[0059] 保藏
[0060] 申请人:于2011年1月10日将嗜酸乳杆菌NCK2025保藏在弗吉尼亚州马纳萨 斯的美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，Manassas， VA20110USA)，ATCC保藏号PTA-11587。2011年I月10日保藏在ATCC的细菌培养物在本 专利申请的 申请日期:之前取自北卡罗来纳州立大学（North Carolina State University) 保存的保藏物，地址北卡罗来纳州罗利市，校园邮箱7624,肖布霍尔100室，邮编 27695 (IOOSchaub Hall，Campus Box7624, Raleigh，North Carolina，27695)。在本申请待 审期间，专利和商标专员可获取该保藏物，由专员确定的人员在提出请求后也有权获取该 保藏物。在本申请中的任何权利要求获得批准后， 申请人:将根据37C. F. R. § 1. 808使该保 藏物可供公众获取。嗜酸乳杆菌NCK2025的该保藏物将保存在公共保藏库ATCC保藏库中 30年，或在最新请求后5年，或本专利的可执行期（enforceable life)中的较长者，并且如 果在该期限内无法存活将会更换。另外， 申请人:已经或将满足37C.F.R. § § 1.801-1.809 的所有要求，包括提供保藏时样品存活力的指示。 申请人:无权免除法律所规定的对生物材 料的转移或其商业运输的任何限制。
[0061] 根据以上提供的说明，提供了如下编号的实施例：
[0062] 1. 一种减少哺乳动物中的息肉病的方法，所述方法包括将治疗有效量的细菌施用 于哺乳动物，所述细菌经基因修饰或选择以减少所述细菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
[0063] 2.实施例1的方法，其中所述哺乳动物具有发展息肉病或结肠直肠癌的风险因 素。
[0064] 3.实施例2的方法，其中所述风险因素是肿瘤抑制基因的突变。
[0065] 4.实施例3的方法，其中所述肿瘤抑制基因是结肠腺瘤性息肉病（APC)基因。
[0066] 5.实施例1-4中任一项的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种息肉。
[0067] 6.实施例1-5中任一项的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种在胃肠道中的息 肉或至少一种在直肠中的息肉。
[0068] 7.实施例1-6中任一项的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种赘生性息肉。
[0069] 8.实施例7的方法，其中所述赘生性息肉是腺瘤性息肉。
[0070] 9.实施例8的方法，其中所述腺瘤性息肉位于所述哺乳动物的胃肠道中或位于直 肠中。
[0071] 10.实施例5或6的方法，其中所述息肉是恶性息肉。
[0072] 11.实施例1-10中任一项的方法，其中所述治疗有效量的细菌的施用减少息肉内 有丝分裂活性。
[0073] 12.实施例11的方法，其中所述息肉内有丝分裂活性的减少包括Ki-67+或 TUNEL+细胞的减少。
[0074] 13.实施例5-12中任一项的方法，其中当与健康相邻组织比较时，所述息肉以息 肉内炎症为特征。
[0075] 14.实施例13的方法，其中所述治疗有效量的细菌的施用减少所述息肉内炎症。
[0076] 15.实施例14的方法，其中所述息肉内炎症的减少包括至少一种选自以下的细胞 类型的密度的减少：肥大细胞、巨噬细胞、F4/80+巨噬细胞、嗜中性粒细胞、Grl+粒细胞、树 突状细胞和促炎性调节性T细胞。
[0077] 17.实施例5-10或13-15中任一项的方法，其中所述治疗有效量的细菌的施用减 少息肉内骨髓细胞密度、息肉内肥大细胞计数、息肉内巨噬细胞计数、息肉内嗜中性粒细胞 计数、息肉内树突状细胞计数或息肉内嗜中性粒细胞计数。
[0078] 18.实施例1-17中任一项的方法，其中所述治疗有效量的细菌的施用减少脾脏尺 寸、脾脏巨噬细胞计数或脾脏粒细胞计数。
[0079] 19. -种抑制哺乳动物中的息肉病的方法，所述方法包括将治疗有效量的细菌施 用于哺乳动物，所述细菌经基因修饰以减少所述细菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
[0080] 20.实施例19的方法，其中所述哺乳动物具有发展息肉病或结肠直肠癌的风险因 素。
[0081] 21.实施例20的方法，其中所述风险因素是肿瘤抑制基因的突变。
[0082] 22.实施例21的方法，其中所述肿瘤抑制基因是结肠腺瘤性息肉病（APC)基因。
[0083] 23.实施例1-22中任一项的方法，其中所述受试者是人。
[0084] 24.实施例1-22中任一项的方法，其中所述受试者是驯养动物。
[0085] 25.实施例1-22中任一项的方法，其中所述受试者是耕作动物。
[0086] 26.实施例1-22中任一项的方法，其中所述细菌是益生菌。
[0087] 27.实施例26的方法，其中所述益生菌是乳酸菌。
[0088] 28.实施例27的方法，其中所述乳酸菌是乳杆菌。
[0089] 29.实施例28的方法，其中所述乳杆菌是嗜酸乳杆菌。
[0090] 30.实施例29的方法，其中所述嗜酸乳杆菌是以ATCC登录号PTA-11587保藏的嗜 酸乳杆菌NCK2025。
[0091] 31.实施例1-30中任一项的方法，其中所述细菌与至少一种其他细菌菌株组合施 用。
[0092] 32.实施例31的方法，其中所述至少一种其他细菌菌株是益生菌。
[0093] 实骀
[0094] 实例 1
[0095] 将结肠息肉病小鼠模型用于研究肠道菌群在控制胃肠免疫平衡中的作用。为了分 析NCK2025的免疫调节特性，每天用5X IO8Cfu NCK2025的剂量口服治疗5个月大充满息 肉的小鼠，或喂入水4周作为对照。为了具体阐述LTA的作用，第三组小鼠以类似的方式用 亲代嗜酸乳杆菌NCK56治疗。在治疗4周后，对所有小鼠实施安乐死并分析。NCK56治疗 小鼠与对照PBS治疗小鼠相比息肉病的变化很小。相比之下，NCK2025治疗的小鼠小肠中 息肉数量减低（图1A)并且结肠息肉的数量显著减少（图ΙΑ、B)。与PBS-和NCK56治疗 小鼠相比，在NCK2025治疗小鼠的息肉中有丝分裂和凋亡活性显著减低（图1C、D)。这些 观察结果同时证明了在这个模型中NCK2025 口服治疗在具有预先建立的结肠息肉病的小 鼠中的治疗特性以及亲代嗜酸乳杆菌菌株的刺激活性。图像使用Tissue Gnostics获取并 且使用Image J进行分析。数据通过未配对t检验进行统计分析。根据制造商的指示进行 Ki_67(iHistochem 公司）和 TUNEL(密理博（Millipore)公司）染色。
[0096] 实例 2
[0097] 进行整个结肠石蜡切片的免疫荧光染色，以提供NCK2025治疗小鼠中炎症受到抑 制的证据。之前，报道了腺瘤性息肉中肥大细胞的扩增和活化，以及其肿瘤促进作用的证据 (Khazaie et al. (2011) Cancer Metastasis Rev30 : 45 (Khazaie 等人，2011 年，《（癌症 与转移评论》，第30卷，第45页））。为了评估肠道菌群对炎症的影响，对用NCK2025治疗的 患有息肉病的小鼠进行息肉内肥大细胞密度定量，与喂入亲代嗜酸乳杆菌NCK56的小鼠相 t匕。观察到喂入NCK2025的小鼠中息肉内肥大细胞计数的显著减少，达到相当于无息肉病 小鼠的结肠中的肥大细胞的水平，但发现与PBS治疗小鼠相比NCK56治疗小鼠中的变化很 小（图2A、D)。息肉被相对高密度的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和骨髓来源抑制细胞浸润，因 此定量测量治疗对F4/80+巨噬细胞和Grl +粒细胞的息肉内密度的影响。用NCK2025治疗导 致F4/80+和Grl+细胞的息肉内密度显著减少，达到健康肠道的典型水平（图2B、C、E、F)。 这些细胞的密度在NCK56治疗小鼠中无变化。数据通过学生t检验双尾2型进行分析，与未 治疗的小鼠相比。冰冻结肠组织的切片（5 μ m厚）用特异性抗体的氯乙酸酯酶（CAE)染色， 如早前所述（Gounaris et al.，（2007) Proc Natl Acad Sci U S A104 : 19977 (Gounaris 等人，2007年，《美国国家科学院院刊》，第104卷，第19977页））。对于免疫染色一抗：大 鼠抗小鼠 F4/80(Abcam公司（Abeam))、生物素抗小鼠 Grl、仓鼠抗小鼠⑶llc(BD生物科学 公司（BD Biosciences))、抗仓鼠 AlexaFluor594、抗大鼠 AlexaFluor488、链霉抗生物素蛋 白488以及4,6-二脒基-2-苯基Π 引哚二盐酸盐（DAPI，英杰公司（Invitrogen))，以显现 细胞核。图像使用TissueGnostics组织/细胞高通量成像和分析系统（TissueGnostics Tissue/Cell High Throughput Imaging and Analysis System)获取并且使用 ImageJ 软 件进行分析。
[0098] 树突状细胞（DC)赋予粘膜免疫性。为了揭示治疗的影响，测定了所存在的DC的 IL-10、IL-12或TNF-α的息肉内表达。息肉内DC总体趋向于在息肉内的数量比健康相邻 组织高，但该差异在统计意义上不显著（图3A-C)，例外的是CD103+DC，其在息肉内显著升 高（图3D)。用NCK2025治疗使DC计数降低至接近健康野生型小鼠的DC计数，而NCK56 的影响很小（图3A-D)。因此，DC和促炎性细胞的息肉内密度的减少表明NCK2025将充 满息肉的小鼠中肠道的致病性免疫环境成功重置回其生理状态。数据通过学生t检验双 尾2型进行分析，与未治疗的小鼠相比。免疫染色、采集和分析如图2所述进行。抗体：仓 鼠抗小鼠 CDllc(BD生物科学公司（BD Bioscience))、大鼠抗小鼠 IL-10、IL-12、IFN-γ、 TNF-a (BioLegend 公司（BioLegend))、抗仓鼠 Alexa Fluor594、抗大鼠 Alexa Fluor488。
[0099] 实例 3
[0100] 之前，我们报道了息肉病相关的炎症在遗传性息肉病的小鼠模型中变为全身 性的，所述小鼠模型发展脾肿大并且血清促炎性细胞因子的水平升高（Gounaris et al. (2008)PL〇S One3 : e2916(Gounaris 等人，2008年，《PLoS One》，第 3卷，第 e2916页））。 年老的充满息肉的小鼠也发展脾肿大（图5A)。用NCK2025治疗使脾脏尺寸显著减低，而用 NCK56治疗显示出类似的趋势，然而其没有统计意义上的显著性（图5A)。脾脏尺寸减低与 脾脏中的CD4效应T-细胞相对频率增加和Tregs减低（图5B)、巨噬细胞和粒细胞减低（图 5C)相关联。类似但不显著的趋势也可见于MLN中（图5B、C)。这些变化对应于血清中IL-10 以及促炎性细胞因子水平显著下降但IL-22增加（图6)。过滤单细胞悬浮液（40 μ m)，并 且使用Ack裂解缓冲液（BioWhittaker公司（BiOWhittaker))裂解血细胞（RBC)。洗涤细 胞，然后用Fe block(BD生物科学公司（BD Bioscience))温育。排除死细胞（LIVE/DEAD紫 死细胞染色试剂盒（LIVE/DEAD Violet Dead cell Stain kit);英杰公司（Invitrogen))。 抗体：CDllc FITC(HL3)、GRlAPC(RB6-8C5)、CD4Percp(RM4-5)、CD25 生物素（7D4)和链霉抗 生物素蛋白 FITC 得自 BD Pharmingen 公司（BD Pharmingen) ;F4/80Percp(BM8)和 CDllb PE-Cy7(Ml/70)得自 Biolegend 公司（Biolegend)。数据用 BDFACSCanto II 获取，并且使 用FlowJo软件（Tree Star公司（Tree Star))进行分析。多重ELISA根据制造商的指示 (密理博公司（Millipore))在已过滤（0. 22mm)血清上进行。结果使用LuminexlOO仪器获 取并使用xponent软件（Luminex公司（Luminex Corporation))进行分析。我们的发现同 时表明NCK2025施用至具有确立的息肉的小鼠可下调炎症，并且重置局部和全身性免疫， 而在该模型中亲代NCK56菌株产生中间响应。
[0101] 实例 4
[0102] Tregs在癌症中具有双重作用，不仅增加总数以及抑制保护性T-细胞免疫性，而 且通过抑制炎症而防止癌症。在癌症和慢性炎症中，Tregs可丧失其抗炎特性。这可通过 ROR Y t的表达和Foxp3的丧失而发生，导致转化为TH17细胞。或者，它们可共表达Foxp3 和ROR Y t，保持T-细胞抑制特性，但获得促炎功能。在两种情况下，Tregs的抗炎特性丧失 是促使致病性炎症逐步升级的关键因素 （Blatner et al.，（2010)Proc Natl Acad Sci U S A107 :6430 (Blatner等人，2010年，《美国国家科学院院刊》，第107卷，第6430页））。鉴于用 NCK2025治疗的小鼠中炎症的减低，我们假设NCK2025治疗有助于Treg抗炎特性的恢复。肠 道组织的免疫染色揭示了 NCK2025治疗小鼠的息肉中Foxp3+细胞的密度减低（图4D)。这 未必揭示Tregs的致病性亚型与保护性亚型的相对比率。实际上，NCK2025治疗的小鼠显示 出息肉侵润性F 〇xp3+R0R γ t_良性Tregs的密度显著增加（图4E)，以及F〇xp3+R0R γ t+促炎 性Tregs密度的对应下降（图4F);用亲代NCK56治疗的小鼠显示出中间响应（图4E、F)。 表达ROR Y t的非Tregs的水平没有因 NCK2025发生改变，而促炎性⑶4+IFN γ +T-细胞减低 (图4G、H)。这些观察结果清楚地表明NCK2025治疗小鼠的息肉微环境中促炎性与抗炎性 Tregs的平衡的变化，以及炎性辅助T-细胞的对应减低。我们的发现突出了分别分析Treg 各亚型的重要性，并且提示了 NCK2025能改善患有息肉病的小鼠的Treg保护功能。数据通 过学生t检验双尾2型进行分析，与未治疗的小鼠相比。免疫染色、采集和分析如图3所 述进行。抗体：小鼠抗小鼠⑶4 (Abeam公司（Abeam))、大鼠抗小鼠 IFN-γ (BioLegend公司 (BioLegend))、大鼠抗小鼠 Foxp3 (ebiosciences 公司（ebiosciences))、兔抗小鼠 RoR Y、 抗大鼠 Alexa Fluor488、抗小鼠 Alexa Flour594、抗兔 Alexa Fluor488。
[0103] 因此，患有癌症前期结肠息肉的小鼠中的病理炎症可通过有益微生物的口服治疗 重置为保护模式。健康肠道免疫性处于平衡状态，该状态允许针对病原体的准确和快速的 保护响应，同时缩减致病性炎症过程。该平衡通过微生物群驱动的炎症和Tregs的IL-IO 依赖性炎症抑制来实现。促炎性和抗炎性⑶4+T-细胞二者通过其与⑶Ilc+DC的相互作 用而分化和活化。调节性或促炎性DC通过其细胞因子的表达被识别，所述细胞因子例如 引起胸腺外Tregs的生成的IL-10,以及促炎性细胞因子，促炎性细胞因子包括将T-细胞 定向于THl或TH17谱系（36、37)的IL-12和TNF-α。肠道衍生的DC在将肠道归巢特性 以⑶103和视黄酸依赖性方式赋予这些T-细胞中具有显著作用（Mora et al.，（2003) Nature424 : 88 (Mora等人，2003年，《自然》，第424卷，第88页））。通过磷酸甘油转移酶 基因的缺失来丧失LTA消除了嗜酸乳杆菌与肠道相互作用的免疫刺激组分，从而导致炎症 和免疫性的质量的变化。虽然肠道以及脾脏中促炎性细胞的密度下调，但效应T-细胞的相 对密度增加，并且Tregs减少。这些变化反映了 NCK2025治疗小鼠中健康免疫性的重置。该 治疗的有趣结果是息肉侵润性Treg亚型的变化。癌症炎症由Tregs调节，其在息肉病和癌 症中趋于回复到促炎性表型（Gounaris et al.，（2009)Cancer Res69 : 5490(Gounaris 等 人，2009年，《癌症研究》，第69卷，第5490页））。在本研究中，用NCK2025 口服治疗显著增 加了抗炎性Tregs相对于炎性Tregs的比率。我们预期该变化对于肠道中的炎症从致病性 水平恢复至健康水平是关键的。
【权利要求】
1. 一种减少哺乳动物中的息肉病的方法，所述方法包括将治疗有效量的细菌施用于哺 乳动物，所述细菌经基因修饰以减少所述细菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物具有发展息肉病或结肠直肠癌的风 险因素。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述风险因素是肿瘤抑制基因的突变。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述肿瘤抑制基因是结肠腺瘤性息肉病（APC)基 因。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种息肉。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种在胃肠道 中的息肉或至少一种在直肠中的息肉。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物具有至少一种赘生性息 肉。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述赘生性息肉是腺瘤性息肉。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述腺瘤性息肉位于所述哺乳动物的胃肠道中或 位于直肠中。
10. 根据权利要求5或6所述的方法，其中所述息肉是恶性息肉。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述施用治疗有效量的细菌减少息 肉内有丝分裂活性。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述息肉内有丝分裂活性的减少包括Ki-67+或 TUNEL+细胞的减少。
13. 根据权利要求5-12中任一项所述的方法，其中当与健康相邻组织比较时，所述息 肉以息肉内炎症为特征。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述施用治疗有效量的细菌减少所述息肉内炎 症。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述息肉内炎症的减少包括至少一种选自以下 的细胞类型的密度的减少：肥大细胞、巨噬细胞、F4/80+巨噬细胞、嗜中性粒细胞、Grl+粒 细胞、树突状细胞和促炎性调节性T细胞。
16. 根据权利要求5-10或13-15中任一项所述的方法，其中所述施用治疗有效量的细 菌减少息肉内骨髓细胞密度、息肉内肥大细胞计数、息肉内巨噬细胞计数、息肉内嗜中性粒 细胞计数、息肉内树突状细胞计数或息肉内嗜中性粒细胞计数。
17. 根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述施用治疗有效量的细菌减少脾 脏尺寸、脾脏巨噬细胞计数或脾脏粒细胞计数。
18. -种抑制哺乳动物中的息肉病的方法，所述方法包括将治疗有效量的细菌施用于 哺乳动物，所述细菌经基因修饰以减少所述细菌表面上的脂磷壁酸（LTA)展示。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物具有发展息肉病或结肠直肠癌的 风险因素。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述风险因素是肿瘤抑制基因的突变。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述肿瘤抑制基因是结肠腺瘤性息肉病（APC) 基因。
22. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
23. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是驯养动物。
24. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述受试者是耕作动物。
25. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细菌是益生菌。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述益生菌是乳酸菌。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述乳酸菌是乳杆菌（Lactobacillus)。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述乳杆菌是嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)〇
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述嗜酸乳杆菌是以ATCC登录号PTA-11587保 藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。
30. 根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述细菌与至少一种其他细菌菌株 组合施用。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述至少一种其他细菌菌株是益生菌。
【文档编号】A61K35/744GK104321065SQ201280061005
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】M·莫哈马扎德, 托德·克莱恩哈默 申请人:北卡罗来纳州立大学, M·莫哈马扎德