减少或消除由暴露于uv光而引起的蛋白质修饰和降解的方法
【专利摘要】本文提供了使包含蛋白质组分的样品中的病毒灭活的方法。本文还提供了在存在反应性物种如由于UV暴露而产生的反应性物种的情况下减少蛋白质降解或修饰的方法。另一方面，本文提供了一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法。所述公开的方法可以在任何规模下进行并且根据需要可以是自动化的。
【专利说明】减少或消除由暴露于UV光而引起的蛋白质修饰和降解的方法发明领域
[0001]本发明总体上涉及用于保护基于蛋白质的分子免受操作期间的降解和修饰并且用于在对蛋白质没有损害的情况下促进UV-C暴露增加的化合物和方法，所述操作涉及使所述基于蛋白质的分子暴露于UV光，具体是使用处于UV-C波长下的光的病毒灭活方法。
[0002]发明背景
[0003]细胞培养基和上清液的病毒污染对全世界范围内的生物制药制造商提出了挑战。已采用了若干方法使大的或小的、包膜或未包膜的(或“裸的”)DNA或RNA病毒颗粒灭活和/或使其从细胞上清液中除去。这些方法的实例包括20nm过滤技术、阴离子交换膜色谱法、低PH孵育以及深度过滤器技术。
[0004]除了以上技术之外，还使用了紫外光来处理含有蛋白质的溶液以便使病毒灭活。然而，为了实现有效的病毒灭活，必须使溶液暴露于足够剂量的UV-C波段中的UV光。在一些例子中，所希望的水平的υν-c光暴露可以在溶液中引起蛋白质的不希望的修饰和/或降解。例如，在一些情况下，反应性物种(reactive species)可以在溶液中形成并且在溶液中导致蛋白质的间接氧化或修饰；其它针对由于UV-C暴露引起的间接修饰的机理也是可能的。参见，例如 Cabiscol 等，(2010) Int.Microb1l, 3:315 ;Bandyopadhyay 等(1999)Curr.Sc1.77:658-666 ；Schoneich, (2005)B1chim B1phys Actal703:111-19 ；Stadtman等，(2003) Ant1xid.Redox.Signal5:577-82 ；Stadtman, (1993) Ann.Rev.B1chem.62:797-821 ;以及 Dean 等，(1997) B1chem.J.324:1-18。
[0005]本公开通过提供在暴露于UV波段光，并且更具体地UV-C光的溶液中减少蛋白质的氧化、修饰和降解的方法来解决这些和其它挑战。如所描述的，暴露于UV-C可以是病毒灭活操作的一个部分，并且溶液中的蛋白质可以是任何类型，例如像抗原结合蛋白这样的蛋白质(例如，以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)。
[0006]发明概述
[0007]一方面，提供了一种使包含蛋白质组分的样品中的病毒灭活的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白质组分的样品，其中已知或怀疑所述样品包含病毒；(b)鉴定在其下病毒被灭活的UV光的目标剂量；(c)将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物；(d)使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段；(e)评价稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及(f)如果评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0008]在一个实施方案中，所述样品包括色谱柱池；在具体实施方案中，所述池可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。在另一个实施方案中，所述样品包括色谱柱流出物流；在具体实施方案中，所述流出物流可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0009]在其它实施方案中，所述蛋白质组分可以包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fe结构域；(iii)肽；QV) Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
[0010]在还另外的实施方案中，所述病毒包括以下各项中的一种或多种:dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒以及ssRNA病毒；在具体实施方案中，所述病毒可以包括以下一种或多种病毒科的病毒:腺病毒科(adenoviridae)、非洲猪痕病毒科(asfarviridae)、抱疫病毒科(herpesviridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痕病毒科(poxviridae)、环状病毒科(circoviridae)、嗜肝 DNA 病毒科(hepadnaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、双RNA病毒科(birnaviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、vornaviridae、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、D型肝炎病毒科(deltaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、动脉炎病毒科(arter1viridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、冠状病毒科(cornonavirdae)、黄病毒科(flaviviridae)、HEV-样病毒、野田村病毒科(nodaviridae)、小RNA病毒科(picornaviridae)、披膜病毒科(togaviridae)以及逆转录病毒科(tertroviridae)。在具体实施方案中，所述病毒为细小病毒MVM、逆转录病毒MuLV或布尼亚病毒CVV。
[0011]在又另一个实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中，并且在其它实施方案中，保护剂可以包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在具体实施方案中，保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0012]在还另外的实施方案中，UV光的波长在约200nm至约280nm的范围内；在具体实施方案中，UV光的波长为约254nm。在各种实施方案中，目标剂量可以是以下各项中的一种或多种:约 lmj/cm2、约 10mJ/cm2、约 25mJ/cm2、约 50mJ/cm2、约 75mJ/cm2、约 100mJ/cm2、约125mJ/cm2、约 200mJ/cm2、约 250mJ/cm2、约 300mJ/cm2、约 350mJ/cm2、约 400mJ/cm2、约 450mJ/cm2、约 500mJ/cm2、约 600mJ/cm2、约 700mJ/cm2、约 800mJ/cm2、约 900mJ/cm2、约 1000mJ/cm2 以及大于约1000mJ/cm2。
[0013]在一些实施方案中，所述方法提供了大于或等于约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或大于约6.5的病毒对数减少值(LRV)。
[0014]在另一个实施方案中，所述方法是自动化的，并且在还另一个实施方案中，所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
[0015]另一方面，提供了一种减少由UV暴露期间产生的反应性物种的存在而引起的蛋白质降解或修饰的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白质组分的样品，已知或怀疑所述蛋白质组分在存在反应性物种的情况下被降解或修饰；(b)鉴定UV光的目标剂量；(C)将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物；(d)使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段；(e)评价稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及(f)如果评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0016]在一个实施方案中，所述样品包括色谱柱池；在具体实施方案中，所述池可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。在另一个实施方案中，所述样品包括色谱柱流出物流；在具体实施方案中，所述流出物流可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0017]在其它实施方案中，所述蛋白质组分可以包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fe结构域；(iii)肽；(iv)Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
[0018]在又另一个实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中，并且在其它实施方案中，保护剂可以包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在具体实施方案中，保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0019]在还另外的实施方案中，UV光的波长在约200nm至约280nm的范围内；在具体实施方案中，UV光的波长为约254nm。在各种实施方案中，目标剂量可以是以下各项中的一种或多种:约 lmj/cm2、约 10mJ/cm2、约 25mJ/cm2、约 50mJ/cm2、约 75mJ/cm2、约 100mJ/cm2、约125mJ/cm2、约 200mJ/cm2、约 250mJ/cm2、约 300mJ/cm2、约 350mJ/cm2、约 400mJ/cm2、约 450mJ/cm2、约 500mJ/cm2、约 600mJ/cm2、约 700mJ/cm2、约 800mJ/cm2、约 900mJ/cm2、约 1000mJ/cm2 以及大于约1000mJ/cm2。
[0020]在一些实施方案中，所述方法提供了大于或等于约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或大于约6.5的病毒对数减少值(LRV)。
[0021]在另一个实施方案中，所述方法是自动化的，并且在还另一个实施方案中，所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
[0022]在还另一个方面中，提供了一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供包含蛋白质组分的样品，所述蛋白质组分包含甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者；(b)鉴定UV光的目标剂量；(c)将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物；(d)使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段；(e)评价稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及
(f)如果评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0023]在一个实施方案中，所述样品包括色谱柱池；在具体实施方案中，所述池可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。在另一个实施方案中，所述样品包括色谱柱流出物流；在具体实施方案中，所述流出物流可以包括以下各项中的一种或多种:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0024]在其它实施方案中，所述蛋白质组分可以包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fe结构域；
(iii)肽；QV) Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
[0025]在又另一个实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中，并且在其它实施方案中，保护剂可以包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在具体实施方案中，保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
[0026]在还另外的实施方案中，UV光的波长在约200nm至约280nm的范围内；在具体实施方案中，UV光的波长为约254nm。在各种实施方案中，目标剂量可以是以下各项中的一种或多种:约 lmj/cm2、约 10mJ/cm2、约 25mJ/cm2、约 50mJ/cm2、约 75mJ/cm2、约 100mJ/cm2、约125mJ/cm2、约 200mJ/cm2、约 250mJ/cm2、约 300mJ/cm2、约 350mJ/cm2、约 400mJ/cm2、约 450mJ/cm2、约 500mJ/cm2、约 600mJ/cm2、约 700mJ/cm2、约 800mJ/cm2、约 900mJ/cm2、约 1000mJ/cm2 以及大于约1000mJ/cm2。
[0027]在一些实施方案中，所述方法提供了大于或等于约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约
2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或大于约6.5的病毒对数减少值(LRV)。
[0028]在另一个实施方案中，所述方法是自动化的，并且在还另一个实施方案中，所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
[0029]附图简述
[0030]图1是通过SEC-HPLC测定在三种不同pH水平(pH 4.3,5.0和7.0)下监测的作为UV-C暴露的函数的三种不同单克隆抗体样品(Mab X、Mab Y,Mab Z)的主峰变化百分比的曲线图；y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ剂量相比的值的变化％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。所有样品均为过滤型病毒灭活的池(FVIP)。
[0031]图2是通过CEX-HPLC测定在三种不同pH水平(pH4.3、5.0和7.0)下监测的作为UV-C暴露的函数的两种不同单克隆抗体样品(Mab X、Mab Z)的主峰、酸峰和碱峰纯度的曲线图；y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ/cm2剂量相比的所测量的物种的分布％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。所有样品均为过滤型病毒灭活的池(FVIP)。
[0032]图3是通过SEC-HPLC测定在三种不同电导率水平(低(30mM HOAc)、标准(10mMHOAc)和高(300mMH0Ac))下监测的作为UV-C暴露的函数的三种不同单克隆抗体样品(MabX、Mab Y、Mab Z)的主峰变化百分比的曲线图；y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ/cm2剂量相比的值的变化％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。
[0033]图4是通过CEX-HPLC测定在三种不同电导率水平(低(30mM HOAc)、标准(10mMHOAc)和高(300mM HOAc))下监测的作为UV-C暴露的函数的两种不同单克隆抗体样品(MabX、Mab Z)的主峰、酸峰和碱峰纯度的曲线图；y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ/cm2剂量相比的所测量的物种的分布％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。所有样品均为过滤型病毒灭活的池(FVIP)。
[0034]图5是通过SEC-HPLC测定在三种不同浓度(低(6g/L)、标准(12g/L)、高(24g/L))下监测的作为UV-C暴露的函数的单克隆抗体(Mab X)的主峰浓度的曲线图；y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ/cm2剂量相比的值的变化％并且X轴被绘制为当通过溶液组分解释UV吸光度时所接受的计算的剂量(mj/cm2)。
[0035]图6是如通过SEC-HPLC测定所监测作为UV-C暴露的函数的单克隆抗体(Mab X)的主峰纯度的一个曲线图和三个迹线。曲线图示出Mab X的两个肽图，UV暴露运行I和UV暴露运行2。y轴被绘制为与递送至溶液表面的OmJ/cm2剂量相比的值的变化％，并且x轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。
[0036]图7是突出在递送至溶液表面的10，000mj/cm2的UV-C暴露之后观察到的对单克隆抗体(Mab X)的氨基酸残基的氧化作用的肽图。在此极端的UV-C剂量暴露后观察到位置425和位置249处的甲硫氨酸残基的氧化。
[0037]图8 是概述了作为 OmJ/cm2、150mJ/cm2、375mJ/cm2 和 / 或 1000mJ/cm2 的 UV-C 暴露剂量的函数的针对单克隆抗体(Mab X)的纯度和活性趋势的表格。肽图结果鉴定了随着剂量增加而水平增加的蛋白质上特定甲硫氨酸残基的氧化。Mab X被称为“对照”并且酪氨酸被称为“添加I”。
[0038]图9是如通过SEC-HPLC测定所监测在存在和不存在保护剂的情况下作为UV-C暴露的函数的单克隆抗体(Mab X)的主峰纯度的曲线图；y轴被绘制为呈所测量的物种的分布的主峰％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量(mj/cm2)。曲线图示出针对Mab X的三个肽图:UV暴露运行I和UV暴露运行2 (未处理的重复运行)以及UV暴露“添加剂#2” (用色氨酸保护的运行)。
[0039]图10是在存在和不存在保护剂和单克隆抗体(Mab Y)的情况下作为UV-C暴露的函数的xmuLV灭活的曲线图。y轴被绘制为与已知病毒载量尖峰相差的相对对数减少量(对数减少值(LRV))。X轴被绘制为当通过溶液组分解释UV吸光度时所接受的计算的剂量(mj/cm2)。样品“对照” (Mab Y)中的蛋白质浓度处于2g/L和30g/L，样品“添加剂I” (MabY+酪氨酸)中的蛋白质浓度处于2g/L和30g/L。
[0040]图1la和图1lb是示出要求用于DNA病毒(图1la)和RNA病毒(图1lb)灭活的所要求的UV-C剂量的表。
[0041]图12是示出预测的对数减少值(LRV)与要求用于各种病毒灭活的UV剂量的表格。
[0042]图13是示出并行运行以适应大量稳定的样品的多个UV-C源的示意图。
[0043]图14是如通过SEC-HPLC测定所监测在存在各种保护剂(包括酪氨酸(TYR)、色氨酸(TRP)、苯丙氨酸(PHE)、叶酸、甲硫氨酸(MET)以及组氨酸(HIS))的情况下作为UV-C暴露的函数的单克隆抗体(Mab X)的主峰纯度的曲线图；y轴被绘制为呈所测量的物种的分布的主峰％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量。氨基酸与Mab X的摩尔比为20:1。还提供了 Mab X的对照。
[0044]图15是如通过SEC-HPLC测定所监测在存在各种保护剂(包括酪氨酸(TYR)、色氨酸(TRP)、苯丙氨酸(PHE)、叶酸、甲硫氨酸(MET)以及组氨酸(HIS))的情况下作为UV-C暴露的函数的单克隆抗体(Mab X)的主峰纯度的曲线图，并且呈现为与初始纯度相差的变化百分比；y轴被绘制为主峰纯度的归一化的变化％并且X轴被绘制为递送至溶液表面的计算的剂量。氨基酸与Mab X的摩尔比为20: I。还提供了 Mab X的对照。
[0045]发明详述
[0046]本公开提供了用在紫外光范围的C波段(UV-C，大约254nm)中的辐射处理含有蛋白质的溶液的方法。更具体地说，本公开提供了在存在使蛋白质稳定或使蛋白质修饰(例如，如甲硫氨酸和色氨酸的残基的氧化)减至最少的化学品的情况下，用在紫外光范围的C波段(UV-C，大约254nm)中的辐射处理含有蛋白质的溶液的方法。
[0047]本文所提供的病毒灭活方法目标在于使蛋白质损害、修饰或掺杂减至最少同时使病毒和与病毒相关的颗粒的灭活潜力最大化的谨慎平衡。本公开提供了对各种溶液添加剂的鉴定，所述溶液添加剂可以提供保护溶液蛋白质免受由通过UV-C波段光处理溶液时产生的物种引起的间接修饰。对许多的多肽分子，特别是抗原结合蛋白(例如，单克隆抗体分子)收集数据以建立UV-C对蛋白质修饰的作用。如通过SEC-HPLC(以检测聚集和二聚化)、CEX-HPLC(以检测电荷改性)、肽作图(以检测分子修饰、氧化和其它作用)以及生物活性(以检测分子效力)所测量，建立剂量水平(每平方厘米透射的UV-C的毫焦耳数)与蛋白质修饰水平之间的关系。
[0048]因此，一方面，本公开涉及一种使含有蛋白质组分的样品中的病毒灭活的方法。所述方法涉及使用UV光来使病毒灭活。所公开的方法的一个有益方面是:它并入了可以使样品的蛋白质组分的降解或修饰的可能性减至最小的保护剂。所述方法可以涉及反馈组分，其中监测包含保护剂的样品以确保样品正获得足够剂量的UV光以便使病毒灭活，但同时使蛋白质组分在可以损害蛋白质的UV光剂量下的暴露减至最小。此工艺可以有效地消除样品中的病毒而同时使蛋白质降解减至最少，并且当大规模(在样品体积方面或以并行操作的方式)进行时可以具有益处，具体是因为所述方法可从实验台规模(所述实验台规模涉及大约若干升的培养物)扩展高达至生产规模(所述生产规模涉及成千上万升的培养物)。
[0049]另一方面，本公开涉及一种在存在反应性物种如可以通过溶液暴露于UV光而产生的反应性物种的情况下减少蛋白质降解或修饰的方法。已观察到蛋白质可以由于长时间暴露于UV光而降解或被修饰。通过在包含蛋白质组分的样品中包括保护剂，可以减少或消除对蛋白质的损害。所述方法可以涉及反馈组分，其中监测包含保护剂的样品以确保样品正获得足够剂量的UV光以便使病毒灭活，但同时使蛋白质组分在可以损害蛋白质的UV光剂量下的暴露减至最小。此工艺可以有效地保护样品的蛋白质组分免受蛋白质降解或修饰，并且当大规模(在样品体积方面或以并行操作的方式)进行时可以具有益处，具体是因为所述方法可从实验台规模(所述实验台规模涉及大约若干升的培养物)扩展高达至生产规模(所述生产规模涉及成千上万升的培养物)。
[0050]在还另一方面中，本公开涉及一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法。已观察到色氨酸和甲硫氨酸可以由于长时间暴露于UV光而氧化。通过在包含蛋白质组分的样品中包括保护剂，可以减少或消除这种氧化。所述方法可以涉及反馈组分，其中监测包含保护剂的样品以确保样品正获得足够剂量的UV光以便使病毒灭活，但同时使蛋白质组分在可以损害蛋白质的UV光剂量下的暴露减至最小。此工艺可以有效地保护样品的蛋白质组分免受蛋白质降解或修饰，并且当大规模(在样品体积方面或以并行操作的方式)进行时可以具有益处，具体是因为所述方法可从实验台规模(所述实验台规模涉及大约若干升的培养物)扩展高达至生产规模(所述生产规模涉及成千上万升的培养物)。
[0051]所公开的方法的一个优点是:它们可以在从实验室规模(通常毫升或升规模)、中试规模(通常成百上千升)或工业规模(通常成千上万升)的规模范围下进行。此外，所述工艺还可以并行地或依次地进行多次。因此，所述工艺容易适合于自动化。大规模应用所公开的方法可以是在生物分子制造工艺中特别希望的。
[0052]1.定义
[0053]如本文所使用，术语“一个(a)”和“一种(an)”意指一个(种)或多个(种)，除非另外确切地指出。
[0054]如本文所使用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或分子的一部分，如抗原结合蛋白(包括，例如抗体或其免疫功能性片段)，并且还可以能够用于动物中以产生能够与所述抗原结合的抗体。抗原可以拥有能够与不同抗原结合蛋白(例如，抗体)相互作用的一个或多个表位。
[0055]如本文所使用，术语“抗原结合蛋白”是指包含与抗原或靶标结合的一个部分并且任选地包含允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构型的一个支架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括单克隆抗体；人抗体；人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双抗体；三抗体；四抗体；结构域抗体；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgGl抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。抗原结合蛋白可以包括，例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代蛋白支架或人工支架。此类支架包括，但不限于:抗体来源的支架，其包含被引入以便例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变；以及完全合成的支架，其包含例如生物相容性聚合物。参见，例如Korndorfer等，(2003)Proteins:Structure, Funct1n, and B1informatics,53(I):121-129 ；Roque等，(2004)B1technol.Prog.20:639-6540另外，肽抗体模拟物(“PAM”)可以形成支架以及利用纤连蛋白组分的基于抗体模拟物的支架。
[0056]抗原结合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体主要由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50kDa至70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为K轻链和λ轻链。重链被分类为μ、δ、Υ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第2版第7章(Paul，W.编著，Raven Press, N.Y.(1989))，出于所有目的，所述参考文献以引用的方式整体并入。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
[0057]天然存在的免疫球蛋白链展现出由三个高变区连接的相对保守的框架区(FR)的相同通用结构，所述高变区又称为互补决定区或CDR。从N端至C端，轻链和重链均包含结构域 FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4。可以根据 Kabat 等，(1991) “Sequencesof Proteins of Immunological Interest”，第 5 版，US Dept, of Health and HumanServices, PHS, NIH, NIH出版号91-3242的定义来进行每个结构域的氨基酸分配。虽然根据需要使用Kabat命名系统呈现出，但是本文所公开的CDR还可以根据替代的命名方案重新定义，如 Chothia (参见 Chothia&Lesk, (1987) J.Mol.B1l.196:901-917 ；Chothia 等，(1989)Nature342:878-883 或 Honegger&Pluckthun，(2001)J.Mol.B1l.309:657-670)的命名方案。
[0058]如本文所使用，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或针对特异性结合与完整抗体竞争的其抗原结合部分，除非另外指明。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促裂解或化学裂解来产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv、结构域抗体(dAb)、包括互补决定区(CDR)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体以及包含足以赋予与多肽的特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。
[0059]Fab片段是具有Vh、(^和ChI结构域的单价片段；F(ab’)2片段是在铰链区具有通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段具有Vh结构域和ChI结构域；Fv片段具有抗体的单臂的\结构域和Vh结构域；并且dAb片段具有Vh结构域、Vl结构域或Vh结构域或\结构域的抗原结合片段(美国专利号6，846，634和6，696，245 ;以及美国申请公布号 05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958，Ward 等，Nature341:544-546(1989))。
[0060]单链抗体(scFv)是其中Vl区和Vh区经由接头(例如，具有氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续的蛋白质链的抗体，其中接头是足够长的以允许蛋白质链在其自身上向后折叠并且形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等，(1988) Science242:423-26以及 Huston 等，(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-83)。双抗体是包含两个多肽链的二价抗体，其中每个多肽链包含通过接头连接的Vh结构域和\结构域，所述接头太短以致不能允许在同一链上的两个结构域之间成对，由此允许每个结构域与另一个多肽链上的互补结构域成对(参见，例如 Holliger 等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-48 以及Poljak等，(1994)Structure2:1121-23)。如果双抗体的两个多肽链是相同的，则由它们成对而产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用来制造具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体是分别包含三个和四个多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗原结合位点可以是相同的或不同的。
[0061]可以使用由Kabat 等，(1991) “Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,第5版，US Dept, of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版号91-3242所描述的系统来鉴定给定的抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。虽然根据需要使用Kabat命名系统呈现出，但是本文所公开的CDR还可以根据替代的命名方案重新定义，如 Chothia (参见 Chothia&Lesk, (1987) T.Mol.B1l.196:901-917 ；Chothia 等，(1989)Nature342:878-883 或Honegger &Pluckthun, (2001) J.Mol.B1l.309:657-670)的命名方案。可以共价地或非共价地将一个或多个CDR并入到分子中，以使得所述分子成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以并入一个或多个CDR作为更大的多肽链的部分，可以共价地使一个或多个⑶R与另一个多肽链连接，或可以非共价地并入一个或多个⑶R。⑶R容许抗原结合蛋白特异性地与感兴趣的具体抗原结合。
[0062]抗原结合蛋白可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性的”或“双功能性的”抗体具有两个不同的结合位点。此双特异性形式的抗原结合蛋白包括本公开的方面。
[0063]如本文所使用，术语“人抗体”是指具有一个或多个源自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有的可变结构域和恒定结构域均源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以用多种方式制备，所述方式的实例在以下描述，包括通过用小鼠的感兴趣的抗原进行免疫，所述小鼠被基因修饰以表达源自人重链编码基因和/或轻链编码基因的抗体，如源自Xenomouse?、UltiMab?、
HuMAb-Mcmse?、Velocimou.se?，Velocimmune?、KyMouse 或 AlivaMab 系统或源自人重链转基因小鼠、转基因大鼠人抗体谱、转基因兔人抗体谱或牛人抗体谱或HuTargTM技术的小鼠。还可以米用基于卩遼菌体的方法。
[0064]人源化抗体具有通过一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加与源自非人物种的抗体的序列不同的序列，这样使得当向人受试者施用时，人源化抗体与非人物种抗体相比不太可能诱导免疫应答和/或诱导不太严重的免疫应答。在一个实施方案中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域被融合至非人物种的一个或多个可变结构域中。在另一个实施方案中，当向人受试者施用时，非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基被改变以减小非人抗体的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基不是抗体与其抗原的免疫特异性结合的关键或做出的对氨基酸序列的改变是保守性改变，这样使得人源化抗体与抗原的结合不明显差于非人抗体与抗原的结合。如何制得人源化抗体的实例可以在美国专利号6，054, 297,5, 886，152和5，877，293中找到。
[0065]如本文所使用，术语“嵌合抗体”是指包含来自一种抗体的一个或多个区和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施方案中，一个或多个CDR源自与选择的靶标结合的人抗体。在另一个实施方案中，所有的CDR均源自与选择的靶标结合的人抗体。在另一个实施方案中，混合来自与选择的靶标结合的多于一种人抗体的CDR并且在嵌合抗体中匹配。例如，嵌合抗体可以包含来自与选择的靶标结合的第一人抗体的轻链的CDR1、来自与选择的靶标结合的第二人抗体的轻链的CDR2和CDR3以及来自与选择的靶标结合的第三抗体的重链的CDR。此外，框架区可以源自与选择的靶标结合的相同抗体之一，源自一个或多个不同的抗体(如人抗体)，或源自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自具体物种或属于具体抗体类别或子类别的抗体相同、与此同源或源自于此，而一个或多个链的剩余部分与来自另一种物种或属于另一抗体类别或子类别的一种抗体或多种抗体相同、与此同源或源自于此。还包括展现出希望的生物活性(例如，与选择的靶标特异性结合的能力)的此类抗体的片段。
[0066]如本文所使用，术语“Fe”和“Fe区”可互换使用并且是指包含人或非人(例如，鼠科动物)Ch2和Ch3免疫球蛋白结构域的抗体的一个片段，或所述抗体的片段包含与人或非人Ch2和Ch3免疫球蛋白结构域至少90 %相同的两个连续区。通过两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水性相互作用使两个重链片段保持在一起。Fe可以但不需要具有与Fe受体相互作用的能力。参见，例如William Ε.Paul编著的Hasemann&Capra,“Immunoglobulins:Structure and Funct1n,，，Fundamental Tmmunologv,第二版，209,210-218 (1989)，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
[0067]如本文所使用，术语“Fe融合”和“Fe融合蛋白”可互换使用并且是指共价附接至Fe结构域的肽或多肽。
[0068]如本文所使用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且意指通过肽键连接的具有至少五个天然或非天然存在的氨基酸的任何链。
[0069]如本文所使用，术语“肽体”是指包含任选地经由接头与Fe结构域连接在一起的一个或多个生物活性肽的多肽。参见美国专利号6，660，843、美国专利号7，138，370和美国专利号7，511，012针对肽体的实例。
[0070]如本文所使用，术语“Fab’片段”是指包含一条轻链和一条重链的一部分的结构，所述重链包含Vh结构域和ChI结构域并且还有ChI结构域与Ch2结构域之间的区，这样使得可以在两个Fab’片段的两个重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
[0071]如本文所使用，术语“？(&13’)2片段”是指包含两个轻链和两个重链的结构，所述重链包含ChI结构域与Ch2结构域之间的恒定区的一部分，这样使得在两个重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段主要由通过两个重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
[0072]如本文所使用，术语“Fv区”是指包含来自重链和轻链两者的可变区但是缺乏恒定区的结构。
[0073]如本文所使用，术语“结构域抗体”是指仅包含重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些例子中，用肽接头将两个或更多个Vh区共价连接以生成二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个Vh区可以靶向相同或不同的抗原。
[0074]如本文所使用，术语“半抗体(hemibody) ”是指包含完整重链、完整轻链以及与完整重链的Fe区成对的第二重链Fe区的免疫功能性免疫球蛋白构建体。可以但不需要采用接头来连接重链Fe区和第二重链Fe区。在具体实施方案中，半抗体是本文所公开的抗原结合蛋白的单价形式。在其它实施方案中，可以采用带电的残基对来使一个Fe区与第二Fe区缔合。
[0075]如本文所使用，术语“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗原结合蛋白或抗体。在一些例子中，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是如本文所描述的双特异性的并且形成本公开的方面。
[0076]如本文所使用，当在蛋白质组分的背景下使用时，术语“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向多于一个抗原或表位的多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且形成本公开的另一个方面。
[0077]如本文所使用，当在抗原结合蛋白或抗体蛋白质组分的背景下使用时，术语“双特异性的”、“双重特异性的”或“双功能性的”是分别具有两个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。双特异性的抗原结合蛋白和抗体是多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体的种类，并且可以通过多种方法包括但不限于杂交瘤融合或Fab’片段连接来产生。参见，例如 Songsivilai 和 Lachmann, (1990)Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 ;Kostelny 等，(1992) J.1mmunol.148:1547-1553.双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，所述表位可以存在于相同或不同的蛋白质靶标上。
[0078]如本文所使用，术语“蛋白A”意指与葡萄球菌蛋白A相同或大致类似的任何蛋白质，包括蛋白A的商业上可获得的形式和/或重组形式。出于本发明的目的，蛋白A确切地包括工程化的蛋白A来源的介质,如Mab Select SuRe?介质(GE Healthcare),其中单个亚单位(例如，B亚单位)复制两次或更多次并且以连续顺序连接以形成重组的蛋白A分子，以及其它非天然存在的蛋白A分子。
[0079]如本文所使用，术语“蛋白G”意指与链球菌蛋白G相同或大致类似的任何蛋白质，包括蛋白G的商业上可获得的形式和/或重组形式。经常通过亲和色谱法采用蛋白A和蛋白G来纯化抗原结合蛋白(例如，抗体、肽体以及其它包含Fe区的融合蛋白)。参见，例如 Vola 等(1994), Cell B1phys.24-25:27-36 ;Aybay 和 Imir (2000), J.1mmunol.Methods233(l-2):77-81 ;Ford 等(2001)，J.Chromatogr.B754:427-435。在这点上，蛋白A和蛋白G是有用的，因为它们与这些类型的蛋白质的Fe区结合。可以使用类似方法来纯化包含IgG抗体的Fe区的重组融合蛋白。在所公开的方法中可以采用蛋白A和蛋白G作为分离基质的吸附剂组分。
[0080]如本文所使用，术语“分离”和“纯化”可互换使用，并且意指可能存在于包含感兴趣的蛋白质的样品中的异质成分的量减少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%或更多，所述异质成分是例如生物大分子像蛋白质或DNA。可以通过任何适当的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、凝胶电泳以及染色法和/或ELISA测定来测定异质蛋白质的存在。可以通过任何适当的方法包括凝胶电泳和染色法和/或采用聚合物链式反应的测定来测定DNA和其它核酸的存在。
[0081 ] 如本文所使用，术语“保护剂”和“添加剂”可互换使用，并且意指具有响应于UV-C剂量水平来限制或调制蛋白质修饰程度的能力的化合物。适合用于所公开的方法中的保护剂的非限制性列表包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。术语“保护剂”涵盖单一化合物以及化合物的组合，如酪氨酸和色氨酸，所述酪氨酸和色氨酸可以相对于彼此以任何比率存在。如本文所描述，酪氨酸对总体UV吸光度的贡献最低。
[0082]如本文所使用，术语“UV光的剂量”意指以UV光的形式递送至靶标的能量的量。递送至靶标的UV光的剂量是强度和暴露时间的函数。“UV光的剂量”的实例的非限制性列表包括约 lmj/cm2、约 10mJ/cm2、约 25mJ/cm2、约 50mJ/cm2、约 75mJ/cm2、约 100mJ/cm2、约 125mJ/cm2、约 200mJ/cm2、约 250mJ/cm2、约 300mJ/cm2、约 350mJ/cm2、约 400mJ/cm2、约 450mJ/cm2、约500mJ/cm2、约 600mJ/cm2、约 700mJ/cm2、约 800mJ/cm2、约 900mJ/cm2、约 100mJ/cm2 以及大于约 1000mJ/cm2。
[0083]如本文所使用，术语“UV光”意指波长在至少1nm与至多400nm之间的光谱的区域。作为实例，术语“UV光”涵盖波长在约200nm至约280nm范围内(包括波长为约254nm)的光。在本文所提供的方法中，可以均匀聚焦和过滤的方式递送UV光；因此，术语“UV光”涵盖均匀聚焦和非聚焦的UV以及过滤的UV光和未过滤的UV光。
[0084]如本文所使用，术语“包含蛋白质组分的样品”意指包含至少水性组分和蛋白质组分的液体的等分试样。在各种实施方案中，水性组分可以包含缓冲液。蛋白质组分可以包含包括通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何物种。蛋白质组分可以包含所有、一些或不包含20种天然存在的氨基酸，并且蛋白质组分的其余部分可以包含任何非天然存在的氨基酸。因此，本文所提供的方法可以在包含包括一种或多种天然存在的氨基酸或一种或多种非天然存在的氨基酸的蛋白质的样品上进行。在各种实施方案中，包含蛋白质组分的样品中的蛋白质是抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段、Fe结构域；肽；Fc融合蛋白；以及治疗性蛋白。
[0085]如本文所使用，术语“反应性物种”意指可以或可能与另一种组分反应以引起反应中的组分的修饰或氧化的任何溶液组分。“反应性物种”的实例的非限制性列表包括氧离子(例如，O”、氢氧根离子(例如，or)以及过氧化物(例如，H2O2)。
[0086]如本文所使用，术语“水因子”是通过以下方程计算的值:水目子其中
a=溶液的吸光度并且I是路径长度(米)。
_7] I1.用于使样品中的病毒灭活的方法
[0088]病毒灭活是制备用于治疗用途的蛋白质溶液中的关键步骤。事实上，各种管理机构已建立了用于病毒灭活的标准并且众多卖主已在着手解决这个问题。病毒灭活技术已在许多方向上开发，包括过滤器技术、HTST和UV-C技术。虽然这些技术中的每一种都具有它的长处，但是每一种也同样具有它的缺点。在UV-C的情况下，已观察到虽然它是使病毒灭活的有效和高效的方法，但是蛋白质长时间暴露于UV-C光可能导致蛋白质降解和/或氧化。因此，虽然UV-C技术是使病毒灭活的有效方法，但是使包含蛋白质的样品暴露于高剂量的UV-C光可以对蛋白质本身具有不利作用。因此，在本公开的一个方面中提供了一种方法，其中可以采用使包含蛋白质组分的样品中的病毒灭活所要求的高剂量的υν-c，而同时减少或消除对蛋白质本身产生损害的可能。因此，提供了一种使包含蛋白质组分的样品中的病毒灭活的方法。在一个实施方案中，方法可以如下进行。
[0089]最初，提供了包含蛋白质组分的样品，其中已知或怀疑样品包含病毒。包含蛋白质组分的样品可以具有任何组成，值得注意的是样品包含蛋白质。例如，样品可以包含已被收集到池中的来自色谱柱的洗脱液。在此实施方案中，可以从任何类型的色谱操作中收集色谱柱池。色谱柱池的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
[0090]包含蛋白质组分的样品还可以包含色谱柱洗脱液流。例如，当洗脱液流离开色谱柱时可以获得所述洗脱液流；因此，方法可以在原位并且实时进行。色谱洗脱液流的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0091]虽然所公开的方法可以应用于包含任何类型的蛋白质组分的样品，但是所公开的方法可以在基于蛋白质的治疗药物的背景下特别有益，所述基于蛋白质的治疗药物是其中已采用病毒灭活标准的领域。因此，在一个实施例中，包含蛋白质组分的样品是包含基于蛋白质的药物分子的样品。在具体实施方案中，所公开的方法的样品的蛋白质组分包括抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、Fiahf )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)、Fe结构域、肽以及治疗性蛋白。这些类型的分子通常被鉴定为治疗性分子的形态。关于抗体抗原结合蛋白，如本文所述的术语“抗体”意味着完全人抗体、人源化抗体或完全非人(例如，鼠科动物)抗体，并且所公开的方法可以应用于所有这些类型的分子。
[0092]在所公开的方法的各种实施方案中，通过所公开的方法处理的样品可以是其中希望使病毒灭活的包含细胞的样品。此类样品的实例包括其中希望使病毒灭活的包含血小板细胞、CHO细胞或细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))的样品。这种样品可以包含细胞培养物。在这些实施方案中，方法可以如所描述来进行，其中包含细胞的样品代替包含蛋白质组分的样品。
[0093]UV-C病毒灭活被最常见地应用于包含蛋白质组分的样品，或应用于包含细胞如血小板的样品，虽然这不是必要条件，并且在其它实施方案中，还可以采用所公开的方法来使病毒从不包含蛋白质组分的样品中除去。
[0094]一方面，所公开的方法涉及可以无意地引入到包含蛋白质组分的样品中的病毒的灭活。在蛋白质生产过程中无意的病毒引入的可能来源包括由制造人员引起的污染的原材料或曝光。所公开的方法的一个优点是:可以针对任何类型的病毒采用它们，并且与病毒是否是包膜的或未包膜的无关。因此，所述方法可以应用于双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒以及单链RNA病毒。使用所公开的方法可以被灭活的病毒科(隐含地包括科的所有成员)的实例包括:腺病毒科、非洲猪瘟病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、环状病毒科、嗜肝DNA病毒科、细小病毒科、双RNA病毒科、呼肠孤病毒科、沙粒病毒科、vornaviridae、布尼亚病毒科、D型肝炎病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、动脉炎病毒科、星状病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、HEV-样病毒、野田村病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科以及逆转录病毒科。在可以与治疗性蛋白质生产过程特别相关的具体实施方案中，使用所公开的方法可以被灭活的病毒包括细小病毒MVM、逆转录病毒MuLV或布尼亚病毒CVV。
[0095]继续所述方法，鉴定在其下病毒被灭活的UV光的目标剂量。为了使用UV-C最有效和高效地使病毒灭活，希望鉴定将实现所希望的结果的UV-C的目标剂量。虽然可以在没有针对待灭活的病毒类型优化UV-C暴露条件(所述UV-C暴露条件总体来说包括“UV-C剂量”)的情况下进行所公开的方法并且在任何常规的UV-C剂量下进行方法，但是可以通过鉴定特定于待灭活的病毒的目标剂量来提高方法的效率。应该注意，一些病毒可以共有在其下它们将被UV-C光灭活的条件，并且通过选择适当的暴露条件，可以在所公开的方法的单个操作中使两种或更多种类型的病毒灭活。已进行了各种研究来鉴定各种含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。参见，例如Lytle & Sagripanti, (2005) JVirol.79:14244-252 以及 Knipe 等，(2007) Field’ sVirology, Lippincott Williams&Wilkins (所述参考文献以引用的方式并入本文)以及图11和图12。
[0096]接着，然后将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物。保护剂的一个功能是为了清除可以降解或修饰样品的组分(例如，样品中的蛋白质)的反应性物种，以便减少或消除由于样品暴露于UV-C光而可能发生的任何修饰或降解。更具体地说，使溶液暴露于具体操作例如病毒灭活所要求的UV-C光的剂量可以引起反应性物种。在一些情况下，样品中存在这些反应性物种可以例如经由样品组分(包括蛋白质)的间接氧化而导致不希望的修饰。在其它情况下，样品中存在反应性物种还可能有助于样品组分的间接修饰。如本文所述，蛋白质修饰和/或降解的可能性是与在病毒灭活方法中使用UV-C光相关的挑战之一。
[0097]可以降解或修饰蛋白质的反应性物种的实例包括反应性物种如氧离子(例如，02_)、氢氧根离子(例如，0H_)以及过氧化物(例如，H2O2)。因为这些和其它反应性物种通常在使溶液暴露于有效病毒灭活所常常要求的高剂量的UV-C光期间产生，所以优选地在使样品暴露于UV光之前添加保护剂。
[0098]不是所有的化学物种都可以充当保护剂。事实上，如在本文提出的实施例中所示，进行了详细研究来鉴定适合的保护剂。适合的保护剂是具有清除存在于样品中的任何反应性物种(如在UV-C暴露期间产生的那些)的能力的化合物，以使得这些反应性物种对样品的组分(例如，蛋白质)的作用相对于不存在保护剂情况下的反应性物种对样品组分的作用有所减小。在一些情况下，由于暴露于在UV-C操作期间产生的反应性物种而引起的样品组分的降解或修饰可以使用保护剂来完全消除。
[0099]除了保护剂在中和存在于样品中的任何反应性物种的不希望的结果方面的有效性之外，当选择保护剂时的另一个考虑是与UV-C暴露之后使其从样品中除去相关的难度。当所公开的方法应用于包含治疗性分子的样品时，这种考虑就变成非常重要的因素，所述治疗性分子如抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F (ab’ ) 2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)或治疗性蛋白。由于对产品品质的监管限制，保护剂的所希望的性质是在它已表现出其保护性功能之后从样品中除去其的能力。
[0100]考虑到所希望的保护剂的所有以上性质，提供了适合的保护剂的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在各种实施方案中，保护剂包含以各种比例存在的两种或更多种化合物。例如，保护剂可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸两者。可以根据经验和/或如本文所描述来确定保护剂的组合的精确组成和比例。
[0101]使用本公开作为指导，可以容易地鉴定另外的保护剂。在一种这样的筛选中，可以将候选保护剂添加至暴露于适合使一种或多种病毒(图11和图12，以及本文所提供的参考可以用作建立相关UV-C剂量的指导)灭活的剂量的UV-C光的包含蛋白质的样品中，并且然后检测以确定蛋白质的降解或修饰的程度。在这点上，可以采用标准色谱技术和分析技术。例如，可以采用IEC来评价蛋白质的修饰，并且可以使用SEC或质谱法来检测蛋白质降解。
[0102]在所公开的方法中采用的保护剂可以任何浓度添加。在一个优选的实施方案中，将保护剂添加至将有效减少或消除样品的组分的修饰或降解的浓度。可以按鉴定保护剂的类似形式确定保护剂的量。那就是说，可以在初始浓度下将选择的保护剂添加至样品中，样品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法确定样品组分(例如，蛋白质)的降解和/或修饰的程度。如在鉴定保护剂的情况下，适合的技术包括IEC、SEC和质谱法。如果蛋白质组分未被保护至所希望的程度，则可以重复评价直到鉴定浓度提供了所希望的保护程度。在一个具体的实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中。以另一种方式说，可以200mM蛋白质大于ImM保护剂(即，I: 200)的浓度比将保护剂添加至样品中。可以采用的其它浓度比包括1: 180、1: 170,1: 160,1: 150,1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1: 80、1:70、1: 60、1: 50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0103]虽然如所描述可以采用所提供的保护剂和保护剂浓度，但是可以使用经验矩阵型方法容易地进行另外的保护剂和保护剂浓度的鉴定。在这样一种方法的一个实施例中，可以构建矩阵，其中一个轴线体现各种候选保护剂并且另一个轴线体现各种浓度水平。可以如所描述(例如，使用SEC、IEC和/或质谱法来评价给定的保护剂和浓度的作用)进行实验以用优选的保护剂和针对这些保护剂的优选的浓度填充矩阵。这种方法将提供又另外的保护剂和保护剂浓度。
[0104]形成包括包含蛋白质组分的样品和保护剂的稳定的混合物，然后使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光持续选择的时间段。这些参数的组合在本文中总体来说是指UV-C剂量。可以在所公开的方法中采用的源的实例包括Newport Oiel.?泛光UV-C源，例如型号97536。
[0105]UV-C源优选地被适配为调谐至功率电平的范围。优选的功率电平在约ImJ至约100mJ范围内。在具体实施例中，UV-C源能够递送约lmj、约10mJ、约25mJ、约50mJ、约 75mJ、约 100mJ、约 125mJ、约 200mJ、约 250mJ、约 300mJ、约 350mJ、约 400mJ、约 500mJ、约600mJ、约700mJ、约800mJ、约900mJ或约1000mJ。针对UV-C源所希望的另一个特征是能够响应于来自监测器的反馈自动地或通过操作者手动地使第一功率电平转换至第二功率电平。
[0106]UV-C源还优选地被适配为递送在波长范围内的UV-C光。优选的波长在约200nm至约280nm范围内，这对应于UV光谱的全部C波段。在特别优选的实施方案中，波长为约254nm。
[0107]当保护剂或保护剂的组合被添加至样品中以形成稳定的混合物时，稳定的混合物的吸光度可以与没有添加保护剂的样品的吸光度不同。例如，存在于稳定的样品中的一种或多种添加的保护剂或其它化合物(例如，缓冲剂组分、稳定剂等等)可以吸收样品被暴露于其中的一些UV光。这可以导致透射至存在于样品中的任何病毒的有效UV光减少，并且因此减少病毒灭活。
[0108]为了解释一种或多种保护剂和/或其它溶液组分的固有吸光度并且确保目标剂量的UV-C光被稳定的混合物接受，可以采用反馈回路，其中UV光暴露的性质响应于UV混合物吸光度的评价而改变。因此，在评价进入UVC暴露装置的混合物吸光度之后，装置内的暴露的性质(例如，灯功率、停留时间或其它方式)可以瞬时变化以确保从装置中出来的稳定的混合物接受目标剂量。可以替代地通过测量离开装置的混合物的吸光度来进行或通过测量装置内的混合物来进行这样一种评价。在一个实施方案中，可以通过在指定的波长如254nm下监测样品的吸光度来进行这样一种评价。吸光度数据可以用来确定所接受的剂量并且可以被定义为所递送的能量剂量的调节，所述调节将可能包含在样品中的组分(例如，蛋白质、保护剂化学品或其它溶液化学品)的紫外光的吸光度考虑在内。在一个实施方案中，可以通过在溶液表面处测量光源功率来进行评价。或者，可以在灯表面处测量光源功率。此外,可以测量由灯汲取的电功率来评价光源功率。
[0109]期望的是评价将指出由于稳定的样品中的一种或多种保护剂的吸光度而引起的所接受的剂量的减少。因此，如果所述评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0110]在一个实施方案中，针对接受校准的UVc辐射光束的混合良好的容器，可以通过采用下式调节剂量:水因子=--，其中a =溶液的吸光度并且I是路径长度。参见，
例如Bolton，(2003) ASCE, 129(3):209-215。确定了用于给定的病毒灭活操作的水因子，将UV光的目标剂量除以水因子以确定用于处理的暴露时间。在另一个实施方案中，针对接受UVc辐射(例如，薄膜工艺反应器或等效物)的未混合的容器，可以通过采用下式调节剂量:剂量?(P/Q)exp(_al) = (PciA)ci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度,并且I是环形路径长度。在此式中，P是灯的功率输出并且Q是具有吸光度=a的混合物的体积流速；匕和Qtl是具有吸光度=Stl的参照混合物的功率和流速。参见，例如Ye，Z (2007) “UV Disinfect1nBetween Concentric Cylinders^hD dissertat1n,Georgia Institute of Technology。
[0111]应该注意，可以手动或通过任何常规的自动化装置如通过采用自动化的或计算机控制的系统来进行所公开的方法的任何步骤或所有步骤。在一些实施方案中，整个方法都可以是自动化的。在其它实施方案中，一个或多个步骤可以是自动化的。例如，对所递送的齐IJ量和响应于离目标剂量水平的变化的调制的评价可以形成单个自动化的步骤。在一个实施方案中，稳定的样品被暴露于UV光并且同时监测离目标剂量的变化。如果检测到了离目标的变化，则控制模块可以调制暴露时间、曝光波长或UV源的功率以使得实现目标剂量。这可以在反馈回路型布置中实时进行。
[0112]所公开的方法可以在任何规模下并且作为不连续的单元操作或作为连续的连接的工艺进行。在不连续的单元操作的一个实施方案中，在容器中形成任何体积的稳定的样品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且随后进行病毒灭活的评价。可以重复操作直到存在于样品中的任何病毒被灭活。或者，可以在暴露于UV光的情况下连续地进行评价。在使病毒灭活之后，可以将样品转移至单独的容器用于进一步加工或包装。
[0113]在连续的连接的工艺的一个实施方案中，可以由来自先前纯化步骤的流出物形成稳定的样品，其中流出物流离开现有柱时，保护剂被添加至所述流出物流中。可以凭借与保护剂引入到流出物流中相关的任何剪切力使保护剂与流出物流混合。然后稳定的样品可以穿过被配置用于使UV光连续暴露于穿过其的样品的装置。一旦实现了目标剂量的UV光，则可以使流传递至第二纯化操作，如除去存在于稳定的样品中的不希望的一种或多种保护剂或其它化合物的纯化步骤。
[0114]另一方面，所公开的方法可以在任何规模上进行，从实验台规模至商业规模。当在商业规模上进行所述方法时，可以适宜地使稳定的样品分成多个等分试样并且并行处理每个等分试样。例如，可以并行运行多个UV-C源以适应大量的稳定的样品。图13示出这样一种配置的示意性实施例。
[0115]II1.减少由UV暴露期间产生的反应性物种的存在引起的蛋白质降解或修饰的方法
[0116]如本文所描述并且在图1至图8中所示，包含蛋白质组分的样品当暴露于UV光(特别是UV-C波段中的光)时可以经历降解或修饰。然而，UV-C波段是用于多种目的例如使病毒灭活的最有效的光谱区域，并且在制造应用中具有特别用途。所观察到的蛋白质降解和/或修饰可以由反应性物种的存在而引起，所述反应性物种是通过用UV光或电离辐射对样品的溶剂组分进行照射而产生的。反应性物种的实例包括氧离子(例如，O2—)、氢氧根离子(例如，OHO以及过氧化物物种(例如，H2O2)。反应性物种的存在可以对蛋白质具有有害的作用。参见，例如 Cabiscol 等，(2010) Int.Microb1l, 3:315 以及 Bandyopadhyay 等(1999)Curr.Sc1.77:658_666。
[0117]在蛋白质生产操作中，UV光的使用可以被用来使病毒灭活，但还可以促进蛋白质降解和/或修饰。因此，一方面，本公开提供了一种减少由UV暴露期间产生的反应性物种的存在而引起的蛋白质降解或修饰的方法。在一个实施方案中，所公开的方法可以如下进行。
[0118]最初，提供了包含蛋白质组分的样品，已知或怀疑所述蛋白质组分在存在反应性物种的情况下降解或修饰。包含蛋白质组分的样品可以具有任何组成，值得注意的是样品包含蛋白质。例如，样品可以包含已被收集到池中的来自色谱柱的洗脱液。在此实施方案中，可以从任何类型的色谱操作中收集色谱柱池。色谱柱池的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
[0119]包含蛋白质组分的样品还可以包含色谱柱洗脱液流。例如，当洗脱液流离开色谱柱时可以获得所述洗脱液流；因此，所述方法可以在原位并且实时进行。色谱洗脱液流的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0120]虽然所公开的方法可以应用于包含任何类型的蛋白质组分的样品，但是所公开的方法可以在基于蛋白质的治疗药物的背景下特别有益，所述基于蛋白质的治疗药物是其中蛋白质降解和/或修饰可以具有重要关注的领域。因此，在一个实施例中，包含蛋白质组分的样品是包含基于蛋白质的药物分子的样品。在具体实施方案中，所公开的方法的样品的蛋白质组分包括抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F (ab’ ) 2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽;(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)、Fc结构域、肽以及治疗性蛋白。这些类型的分子通常被鉴定为治疗性分子的形态。关于抗体，如本文所述的术语“抗体”意味着完全人抗体、人源化抗体或完全非人(例如，鼠科动物)抗体，并且所公开的方法可以应用于所有这些类型的分子。
[0121]在所公开的方法的各种实施方案中，通过所公开的方法处理的样品可以是其中希望使病毒灭活的包含细胞的样品。此类样品的实例包括其中希望使病毒灭活的包含血小板细胞、CHO细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)的样品。这种样品可以包含细胞培养物。在这些实施方案中，所述方法可以如所描述来进行，其中包含细胞的样品代替包含蛋白质组分的样品。
[0122]继续所述方法，鉴定了 UV光的目标剂量。可以出于任何原因选择目标剂量，但是在一个优选的实施方案中，在其下所关注的病毒被灭活的剂量被选择为目标剂量。使用选择对应于已知或怀疑使所关注的具体病毒灭活的UV剂量的目标剂量作为一个实施例，为了使用UV-C最有效和高效地使病毒灭活，希望鉴定将实现所要结果的UV-C的目标剂量。虽然可以在没有针对待灭活的病毒的类型优化UV-C暴露条件(所述UV-C暴露条件总体来说包括“ν-c剂量”)的情况下进行所公开的方法并且在任何常规的UV-C剂量下进行所述方法，但是可以通过鉴定特定于待灭活的病毒的目标剂量来提高方法的效率。应该注意的是，病毒可以共有在其下它们将被UV-C光灭活的条件，并且通过选择适当的暴露条件，可以在所公开的方法的单个操作中使两种或更多种类型的病毒灭活。已进行了各种研究来鉴定各种含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。参见，例如Lytle &Sagripanti (2005)J Virol79: 14244-252 以及 Knipe 等(2007)Field，sVirology, Lippincott Williams &Wilkins(所述参考文献以引用的方式并入本文)以及图11和图12。
[0123]继续所述方法，然后将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物。保护剂的一个功能是为了清除可以降解或修饰样品的组分(例如，样品中的蛋白质)的反应性物种，以便减少或消除由于样品暴露于UV-C光而可能发生的任何修饰或降解。更具体地说，使溶液暴露于所要求的υν-c光的剂量可以引起如本文所述的反应性物种。事实上，这是与在病毒灭活方法中使用UV-C光相关的挑战之一。样品中存在这些反应性物种可以导致样品组分(包括蛋白质)的间接氧化。此外，反应性物种的存在还可以促成样品组分的间接修饰。
[0124]可以降解或修饰蛋白质的反应性物种的实例包括反应性物种如氧离子(例如，02_)、氢氧根离子(例如，0H_)以及过氧化物(例如，H2O2)。因为这些和其它反应性物种通常在使溶液暴露于有效病毒灭活所常常要求的高剂量的UV-C光期间产生，所以优选地在使样品暴露于UV光之前添加保护剂。
[0125]不是所有的化学物种都可以充当保护剂。事实上，如在本文提出的实施例中所示，进行了详细研究来鉴定适合的保护剂。适合的保护剂是具有清除存在于样品中的任何反应性物种(如在UV-C暴露期间产生的那些)的能力的化合物，以使得这些反应性物种对样品的组分(例如，蛋白质)的作用相对于不存在保护剂情况下的反应性物种对样品组分的作用有所减小。在一些情况下，由于暴露于在UV-C操作期间产生的反应性物种而引起的样品组分的降解或修饰可以使用保护剂来完全消除。
[0126]除了保护剂在中和存在于样品中的任何反应性物种的不希望的结果方面的有效性之外，当选择保护剂时的另一个考虑是与UV-C暴露之后使其从样品中除去相关的难度。当所公开的方法应用于包含治疗性分子的样品时，这种考虑变成非常重要的因素，所述治疗性分子如抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)或治疗性蛋白。由于对产品品质的监管限制，保护剂的所希望的性质是在它已表现出其保护性功能之后从样品中除去其的能力。
[0127]考虑到所希望的保护剂的所有以上性质，提供了适合的保护剂的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在各种实施方案中，保护剂包含以各种比例存在的两种或更多种化合物。例如，保护剂可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸两者。可以根据经验和/或如本文所描述来确定保护剂的组合的精确组成和比例。
[0128]使用本公开作为指导，可以容易地鉴定另外的保护剂。在一种这样的筛选中，可以将候选保护剂添加至暴露于适合使一种或多种病毒(图11和图12，以及本文所提供的参考可以用作建立相关UV-C剂量的指导)灭活的剂量的UV-C光的包含蛋白质的样品中，并且然后检测以确定蛋白质的降解或修饰的程度。在这点上，可以采用标准色谱技术和分析技术。例如，可以采用IEC来评价蛋白质的修饰，并且可以使用SEC或质谱法来检测蛋白质降解。
[0129]在所公开的方法中采用的保护剂可以任何浓度添加。在一个优选的实施方案中，将保护剂添加至将有效减少或消除样品的组分的修饰或降解的浓度。可以按鉴定保护剂的类似形式确定保护剂的量。那就是说，可以在初始浓度下将选择的保护剂添加至样品中，样品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法确定样品组分(例如，蛋白质)的降解和/或修饰的程度。如在鉴定保护剂的情况下，适合的技术包括IEC、SEC和质谱法。如果蛋白质组分未被保护至所希望的程度，则可以重复评价直到鉴定浓度提供了所希望的保护程度。在一个具体的实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中。以另一种方式说，可以200mM蛋白质大于ImM保护剂(即，I: 200)的浓度比将保护剂添加至样品中。可以采用的其它浓度比包括1: 180、1: 170,1: 160,1: 150,1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1: 80、1: 70、1: 60、1: 50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0130]虽然如所描述可以采用所提供的保护剂和保护剂浓度，但是可以使用经验矩阵型方法容易地进行另外的保护剂和保护剂浓度的鉴定。在这样一种方法的一个实施例中，可以构建矩阵，其中一个轴线体现各种候选保护剂并且另一个轴线体现各种浓度水平。可以如所描述(例如，使用SEC、IEC和/或质谱法来评价给定的保护剂和浓度的作用)进行实验以用优选的保护剂和针对这些保护剂的优选的浓度填充矩阵。这种方法将提供又另外的保护剂和保护剂浓度。
[0131]形成包括包含蛋白质组分的样品和保护剂的稳定的混合物，然后使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光持续选择的时间段。这些参数的组合在本文中总体来说是指UV-C剂量。可以在所公开的方法中采用的源的实例包括Newport Oriel?泛光UV-C源,例如型号97536。
[0132]UV-C源优选地被适配为调谐至功率电平的范围。优选的功率电平在约ImJ至约100mJ范围内。在具体实施例中，UV-C源能够递送约lmj、约10mJ、约25mJ、约50mJ、约 75mJ、约 100mJ、约 125mJ、约 200mJ、约 250mJ、约 300mJ、约 350mJ、约 400mJ、约 450mJ、约500mJ、约 600mJ、约 700mJ、约 800mJ、约 900mJ、约 100mJ 或多于 1000mJ。针对 UV-C 源所希望的另一个特征是能够响应于来自监测器的反馈自动地或通过操作者手动地使第一功率电平转换至第二功率电平。
[0133]UV-C源还优选地被适配为递送在波长范围内的UV-C光。优选的波长在约200nm至约280nm范围内，这对应于UV光谱的全部C波段。在特别优选的实施方案中，波长为约254nm。
[0134]当保护剂或保护剂的组合被添加至样品中以形成稳定的混合物时，稳定的混合物的吸光度可以与没有添加保护剂的样品的吸光度不同。例如，存在于稳定的样品中的一种或多种添加的保护剂或其它化合物(例如，缓冲剂组分、稳定剂等等)可以吸收样品被暴露于其中的一些UV光。这可以导致透射至存在于样品中的任何病毒的有效UV光减少，并且因此减少病毒灭活。
[0135]为了解释一种或多种保护剂和/或其它溶液组分的固有吸光度并且确保目标剂量的UV-C光被稳定的混合物接受，可以采用反馈回路，其中UV光暴露的性质响应于UV混合物吸光度的评价而改变。因此，在评价进入UVC暴露装置的混合物吸光度之后，装置内的暴露的性质(例如，灯功率、停留时间或其它方式)可以瞬时变化以确保从装置中出来的稳定的混合物接受目标剂量。可以替代地通过测量离开装置的混合物的吸光度来进行或通过测量装置内的混合物来进行这样一种评价。在一个实施方案中，可以通过在指定的波长如254nm下监测样品的吸光度来进行这样一种评价。吸光度数据可以用来确定所接受的剂量并且可以被定义为递送的能量剂量的调节，所述调节将可能包含在样品中的组分(例如，蛋白质、保护剂化学品或其它溶液化学品)的紫外光的吸光度考虑在内。在一个实施方案中，可以通过在溶液表面处测量光源功率来进行评价。或者，可以在灯表面处测量光源功率。此外,可以测量由灯汲取的电功率来评价光源功率。
[0136]期望的是评价将指出由于稳定的样品中的一种或多种保护剂的吸光度而引起的所接受的剂量的减少。因此，如果所述评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0137]在一个实施方案中，为了混合良好的容器接受校准的UVc辐射光束，可以通过采用下式调节剂量:水因子其中a =溶液的吸光度并且I是路径长度。参见，例如Bolton，(2003)ASCE, 129(3):209_215。确定了用于给定的病毒灭活操作的水因子，将UV光的目标剂量除以水因子以确定用于处理的暴露时间。在另一个实施方案中，针对接受UVc辐射(例如，薄膜工艺反应器或等效物)的未混合的容器，可以通过采用下式调节剂量:剂量?(P/Q)exp(_al) = (PcZQci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度，并且I是环形路径长度。在此式中，P是灯的功率输出并且Q是具有吸光度=a的混合物的体积流速Λ和Qtl是具有吸光度=a0的参照混合物的功率和流速。参见，例如Ye，Z (2007) “UVDisinfect1n Between Concentric Cylinders,，，PhD dissertat1n,Georgia Instituteof Technology。
[0138]应该注意，可以手动或通过任何常规的自动化装置如通过采用自动化的或计算机控制的系统来进行所公开的方法的任何步骤或所有步骤。在一些实施方案中，整个方法都可以是自动化的。在其它实施方案中，一个或多个步骤可以是自动化的。例如，对所递送的剂量和响应于目标剂量水平的变化的调制的评价可以形成单个自动化的步骤。在一个实施方案中，稳定的样品被暴露于UV光并且同时监测离目标剂量的变化。如果检测到了离目标的变化，则控制模块可以调制暴露时间、曝光波长或UV源的功率以使得实现目标剂量。这可以在反馈回路型布置中实时进行。
[0139]所公开的方法可以在任何规模下并且作为不连续的单元操作或作为连续的连接的工艺进行。在不连续的单元操作的一个实施方案中，在容器中形成任何体积的稳定的样品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且随后进行病毒灭活的评价。可以重复操作直到存在于样品中的任何病毒被灭活。或者，可以在暴露于UV光的情况下连续地进行评价。在使病毒灭活之后，可以将样品转移至单独的容器用于进一步加工或包装。
[0140]在连续的连接的工艺的一个实施方案中，可以由来自先前纯化步骤的流出物形成稳定的样品，其中流出物流离开现有柱时，保护剂被添加至所述流出物流中。可以凭借与保护剂引入到流出物流中相关的任何剪切力使保护剂与流出物流混合。然后稳定的样品可以穿过被配置用于使UV光连续暴露于穿过其的样品的装置。一旦实现了目标剂量的UV光，则可以使流传递至第二纯化操作，如除去存在于稳定的样品中的不希望的一种或多种保护剂或其它化合物的纯化步骤。
[0141]另一方面，所公开的方法可以在任何规模上进行，从实验台规模至商业规模。当在商业规模上进行所述方法时，可以适宜地使稳定的样品分成多个等分试样并且并行处理每个等分试样。例如，可以并行运行多个UV-C源以适应大量的稳定的样品。图13示出这样一种配置的示意性实施例。
[0142]IV.减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法
[0143]在本公开的另一个方面中，提供了一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法。如本文所描述和在相关文献中，甲硫氨酸残基和色氨酸残基易受到氧化并且可以导致蛋白质失活。参见，例如Schoneich, (2005)B1chim B1physActal703:111-19 ；Stadtman 等，(2003)Ant1xid.Redox.Signal5:577-82 ；Stadtman, (1993) Ann.Rev.B1chem.62:797-821 ；以及 Dean 等，(1997) B1chem.J.324:1-180贯穿本公开所述，UV光在各种应用例如病毒灭活(所述病毒灭活是UV光最常见的工业应用)中有效，但可以导致蛋白质的不希望的修饰和降解。在一些情况下，修饰和/或降解蛋白质可以是直接或间接地由于在UV暴露期间产生的反应性物种的存在而引起。在分子水平上，这些反应性物种可以攻击蛋白质中的侧链残基，特别是甲硫氨酸残基和色氨酸残基的侧链。在基于蛋白质的治疗药物的背景下，这些修饰可以最终导致高分子量物种(例如，聚集体和多聚体)和低分子量物种(例如，片段化的蛋白质)的形成。在治疗药物中存在这些物种可以转变为服用所述治疗药物的患者的严重问题。
[0144]鉴于这些潜在的问题，希望消除蛋白质(具体是基于蛋白质的治疗药物)的修饰和/或降解的可能性。因此，提供了一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法。在一个实施方案中，所公开的方法可以如下进行。
[0145]最初，提供了包含蛋白质组分的样品，所述蛋白质组分包括甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者。包含蛋白质组分的样品可以具有任何组成，值得注意的是样品包含蛋白质并且蛋白质包括甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者。例如，样品可以包含已被收集到池中的来自色谱柱的洗脱液。在此实施方案中，可以从任何类型的色谱操作中收集色谱柱池。色谱柱池的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含蛋白质组分的HIC柱池、包含蛋白质组分的SEC柱池、包含蛋白质组分的IEC柱池以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
[0146]包含蛋白质组分的样品还可以包含色谱柱洗脱液流。例如，当洗脱液流离开色谱柱时可以获得所述洗脱液流；因此，方法可以在原位并且实时进行。色谱洗脱液流的实例包括:包含蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
[0147]虽然所公开的方法可以应用于包含任何类型的蛋白质组分的样品，但是所公开的方法可以在基于蛋白质的治疗药物的背景下特别有益，所述基于蛋白质的治疗药物是其中经由甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的蛋白质修饰和/或降解可以致使基于蛋白质的治疗药物失活或对患者有害的领域。因此，在一个实施例中，包含蛋白质组分的样品是包含基于蛋白质的药物分子的样品。在具体实施方案中，所公开的方法的样品的蛋白质组分包括抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ ) 2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fe结构域；
(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)、Fe结构域、肽以及治疗性蛋白。这些类型的分子通常被鉴定为治疗性分子的形态。关于抗体，如本文所述的术语“抗体”意味着完全人抗体、人源化抗体或完全非人(例如，鼠科动物)抗体，并且所公开的方法可以应用于所有这些类型的分子。
[0148]在所公开的方法的各种实施方案中，通过所公开的方法处理的样品可以是其中希望使病毒灭活的包含细胞的样品。此类样品的实例包括包含血小板细胞、CHO细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)的样品。这种样品可以包含细胞培养物。在这些实施方案中，所述方法可以如所描述来进行，其中包含细胞的样品代替包含蛋白质组分的样品。
[0149]代表所公开的方法的一个应用的UV-C病毒灭活被最常见地应用于包含蛋白质组分的样品，或应用于包含细胞如血小板的样品，虽然这不是必要条件，并且在其它实施方案中，还可以采用所公开的方法来使病毒从不包含蛋白质组分的样品中除去。
[0150]继续所述方法，鉴定了 UV光的目标剂量。可以出于任何原因选择目标剂量，但是在一个优选的实施方案中，在其下关注的病毒被灭活的剂量被选择为目标剂量。使用选择对应于已知或怀疑使所关注的具体病毒灭活的UV剂量的目标剂量作为一个实施例，为了使用UV-C最有效和高效地使病毒灭活，希望鉴定将实现所要结果的UV-C的目标剂量。虽然可以在没有针对待灭活的病毒的类型优化UV-C暴露条件(所述UV-C暴露条件总体来说包括“υν-c剂量”)的情况下进行所公开的方法并且在任何常规的UV-C剂量下进行所述方法，但是可以通过鉴定特定于待灭活的病毒的目标剂量来提高方法的效率。应该注意的是，病毒可以共有在其下它们将被UV-C光灭活的条件，并且通过选择适当的暴露条件，可以在所公开的方法的单个操作中使两种或更多种类型的病毒灭活。已进行了各种研究来鉴定各种含有DNA的病毒和含有RNA的病毒的UV敏感性。参见，例如Lytle &Sagripanti，(2005)J Virol.79:14244-252 以及 Knipe 等，(2007)Field，sVirology, Lippincott Williams &Wilkins(所述参考文献以引用的方式并入本文)以及图11和图12。
[0151]继续所述方法，然后将保护剂添加至样品中以形成稳定的混合物。保护剂的一个功能是为了清除可以降解或修饰样品的组分(例如，样品中的蛋白质)的反应性物种，以便减少或消除由于样品暴露于UV-C光而可能发生的任何修饰或降解。更具体地说，使溶液暴露于所要求的υν-c光的剂量可以引起如本文所述的反应性物种。事实上，这是与在病毒灭活方法中使用UV-C光相关的挑战之一。样品中存在这些反应性物种可以导致样品组分(包括蛋白质)的间接氧化。此外，反应性物种的存在还可以促成样品组分的间接修饰。
[0152]可以降解或修饰蛋白质的反应性物种的实例包括反应性物种如氧离子(例如，02_)、氢氧根离子(例如，0H_)以及过氧化物(例如，H2O2)。因为这些和其它反应性物种通常在使溶液暴露于有效病毒灭活所常常要求的高剂量的UV-C光期间产生，所以优选地在使样品暴露于UV光之前添加保护剂。
[0153]不是所有的化学物种都可以充当保护剂。事实上，如在本文提出的实施例中所示，进行了详细研究来鉴定适合的保护剂。适合的保护剂是具有清除存在于样品中的任何反应性物种(如在UV-C暴露期间产生的那些)的能力的化合物，以使得这些反应性物种对样品的组分(例如，蛋白质)的作用相对于不存在保护剂情况下的反应性物种对样品组分的作用有所减小。在一些情况下，由于暴露于在UV-C操作期间产生的反应性物种而引起的样品组分的降解或修饰可以使用保护剂来完全消除。
[0154]除了保护剂在中和存在于样品中的任何反应性物种的不希望的结果方面的有效性之外，当选择保护剂时的另一个考虑是与UV-C暴露之后使其从样品中除去相关的难度。当所公开的方法应用于包含治疗性分子的样品时，这种考虑变成非常重要的因素，所述治疗性分子如抗原结合蛋白(例如以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’ )2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii)Fc结构域；(iii)肽；(iv)Fc融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白)或治疗性蛋白。由于对产品品质的监管限制，保护剂的所希望的性质是在它已表现出其保护性功能之后从样品中除去其的能力。
[0155]考虑所希望的保护剂的所有以上性质，提供了适合的保护剂的列表并且包括但不限于酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。在各种实施方案中，保护剂包含以各种比例存在的两种或更多种化合物。例如，保护剂可以包含以任何所要的比例存在的酪氨酸、色氨酸或酪氨酸和色氨酸两者。可以根据经验和/或如本文所描述来确定保护剂的组合的精确组成和比例。
[0156]使用本公开作为指导，可以容易地鉴定另外的保护剂。在一种这样的筛选中，可以将候选保护剂添加至暴露于适合使一种或多种病毒(图11和图12，以及本文所提供的参考可以用作建立相关UV-C剂量的指导)灭活的剂量的UV-C光的包含蛋白质的样品中，并且然后检测以确定蛋白质的降解或修饰的程度。在这点上，可以采用标准色谱技术和分析技术。例如，可以采用IEC来评价蛋白质的修饰，并且可以使用SEC或质谱法来检测蛋白质降解。
[0157]在所公开的方法中采用的保护剂可以任何浓度添加。在一个优选的实施方案中，将保护剂添加至将有效减少或消除样品的组分的修饰或降解的浓度。可以按鉴定保护剂的类似形式确定保护剂的量。那就是说，可以在初始浓度下将选择的保护剂添加至样品中，样品暴露于UV-C光并且使用已建立的方法确定样品组分(例如，蛋白质)的降解和/或修饰的程度。如在鉴定保护剂的情况下，适合的技术包括IEC、SEC和质谱法。如果蛋白质组分未被保护至所希望的程度，则可以重复评价直到鉴定浓度提供了所希望的保护程度。在一个具体的实施方案中，以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将保护剂添加至样品中。以另一种方式说，可以200mM蛋白质大于ImM保护剂(即，I: 200)的浓度比将保护剂添加至样品中。可以采用的其它浓度比包括1: 180、1: 170,1: 160、1:150、1: 140、I: 130,1: 120,1: 110,1: 100,1: 90、1:80、1: 70、1: 60、1:50、1: 40,1: 30、1: 20 或 1: 10。
[0158]虽然如所描述可以采用所提供的保护剂和保护剂浓度，但是可以使用经验矩阵型方法容易地进行另外的保护剂和保护剂浓度的鉴定。在这样一种方法的一个实施例中，可以构建矩阵，其中一个轴线体现各种候选保护剂并且另一个轴线体现各种浓度水平。可以如所描述(例如，使用SEC、IEC和/或质谱法来评价给定的保护剂和浓度的作用)进行实验以用优选的保护剂和针对这些保护剂的优选的浓度填充矩阵。这种方法将提供又另外的保护剂和保护剂浓度。
[0159]形成包括包含蛋白质组分的样品和保护剂的稳定的混合物，然后使稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光持续选择的时间段。这些参数的组合在本文中总体来说是指UV-C剂量。可以在所公开的方法中采用的源的实例包括Newport Oriel.?泛光UV-C源，例如型号97536。
[0160]UV-C源优选地被适配为调谐至功率电平的范围。优选的功率电平在约ImJ至约100mJ范围内。在具体实施例中，UV-C源能够递送约lmj、约10mJ、约25mJ、约50mJ、约 75mJ、约 100mJ、约 125mJ、约 200mJ、约 250mJ、约 300mJ、约 350mJ、约 400mJ、约 450mJ、约500mJ、约 600mJ、约 700mJ、约 800mJ、约 900mJ、约 100mJ 或多于 1000mJ。针对 UV-C 源所希望的另一个特征是能够响应于来自监测器的反馈自动地或通过操作者手动地使第一功率电平转换至第二功率电平。
[0161]UV-C源还优选地被适配为递送在波长范围内的UV-C光。优选的波长在约200nm至约280mn范围内，这对应于UV光谱的全部C波段。在特别优选的实施方案中，波长为约254nm。
[0162]当保护剂或保护剂的组合被添加至样品中以形成稳定的混合物时，稳定的混合物的吸光度可以与没有添加保护剂的样品的吸光度不同。例如，存在于稳定的样品中的一种或多种添加的保护剂或其它化合物(例如，缓冲剂组分、稳定剂等等)可以吸收样品被暴露于其中的一些UV光。这可以导致透射至存在于样品中的任何病毒的有效UV光减少，并且因此减少病毒灭活降低。
[0163]为了解释一种或多种保护剂和/或其它溶液组分的固有吸光度并且确保目标剂量的UV-C光被稳定的混合物接受，可以采用反馈回路，其中UV光暴露的性质响应于UV混合物吸光度的评价而改变。因此，在评价进入UVC暴露装置的混合物吸光度之后，装置内的暴露的性质(例如，灯功率、停留时间或其它方式)可以瞬时变化以确保从装置中出来的稳定的混合物接受目标剂量。可以替代地通过测量离开装置的混合物的吸光度来进行或通过测量装置内的混合物来进行这样一种评价。在一个实施方案中，可以通过在指定的波长如254nm下监测样品的吸光度来进行这样一种评价。吸光度数据可以用来确定所接受的剂量并且可以被定义为递送的能量剂量的调节，所述调节将可能包含在样品中的组分(例如，蛋白质、保护剂化学品或其它溶液化学品)的紫外光的吸光度考虑在内。在一个实施方案中，可以通过在溶液表面处测量光源功率来进行评价。或者，可以在灯表面处测量光源功率。此外,可以测量由灯汲取的电功率来评价光源功率。
[0164]期望的是评价将指出由于稳定的样品中的一种或多种保护剂的吸光度而引起的所接受的剂量的减少。因此，如果所述评价指出目标剂量的UV光尚未递送至稳定的混合物，则调制波长、UV光源功率以及UV光暴露时间中的一种或多种。
[0165]在一个实施方案中，为了混合良好的容器接受校准的UVc辐射光束，可以通过采用下式调节剂量:水因子=与^，其中a =溶液的吸光度并且I是路径长度。参见，例如
Bolton (2003) ASCE129 (3):209_215。确定了用于给定的病毒灭活操作的水因子，将UV光的目标剂量除以水因子以确定用于处理的暴露时间。在另一个实施方案中，针对接受UVc辐射(例如，薄膜工艺反应器或等效物)的未混合的容器，可以通过采用下式调节剂量:剂量?(P/Q)exp(_al) = (PcZQci) exp (_aQl),其中a =溶液的吸光度，并且I是环形路径长度。在此式中，P是灯的功率输出并且Q是具有吸光度=a的混合物的体积流速；匕和Qtl是具有吸光度=aQ的参照混合物的功率和流速。Ye，Z(2007) “UV Disinfect1n BetweenConcentric Cylinders,，，PhD dissertat1n, Georgia Institute of Technology。
[0166]应该注意，可以手动或通过任何常规的自动化装置如通过采用自动化的或计算机控制的系统来进行所公开的方法的任何步骤或所有步骤。在一些实施方案中，整个方法都可以是自动化的。在其它实施方案中，一个或多个步骤可以是自动化的。例如，对所递送的剂量和响应于目标剂量水平的变化的调制的评价可以形成单个自动化的步骤。在一个实施方案中，稳定的样品被暴露于UV光并且同时监测离目标剂量的变化。如果检测到了离目标的变化，则控制模块可以调制暴露时间、曝光波长或UV源的功率以使得实现目标剂量。这可以在反馈回路型布置中实时进行。
[0167]所公开的方法可以在任何规模下并且作为不连续的单元操作或作为连续的连接的工艺进行。在不连续的单元操作的一个实施方案中，在容器中形成任何体积的稳定的样品。然后使容器暴露于UV光(例如，UV-C光)并且随后进行病毒灭活的评价。可以重复操作直到存在于样品中的任何病毒被灭活。或者，可以在暴露于UV光的情况下连续地进行评价。在使病毒灭活之后，可以将样品转移至单独的容器用于进一步加工或包装。
[0168]在连续的连接的工艺的一个实施方案中，可以由来自先前纯化步骤的流出物形成稳定的样品，其中流出物流离开现有柱时，保护剂被添加至所述流出物流中。可以凭借与保护剂引入到流出物流中相关的任何剪切力使保护剂与流出物流混合。然后稳定的样品可以穿过被配置用于使UV光连续暴露于穿过其的样品的装置。一旦实现了目标剂量的UV光，则可以使流传递至第二纯化操作，如除去存在于稳定的样品中的不希望的一种或多种保护剂或其它化合物的纯化步骤。
[0169]另一方面，所公开的方法可以在任何规模上进行，从实验台规模至商业规模。当在商业规模上进行所述方法时，可以适宜地使稳定的样品分成多个等分试样并且并行处理每个等分试样。例如，可以并行运行多个UV-C源以适应大量稳定的样品。图13示出这样一种配置的示意性实施例。
[0170]已在本公开中提供了各种参考文献。出于任何目的，本文所引用的所有参考文献均整体并入。
实施例
[0171]以下实施例证明了所公开的方法的实施方案和方面，并且不旨在为限制性的。
[0172]实施例1
[0173]在暴露于UV-C剂暈后对过程化学关于蛋白质修饰的评估
[0174]使包含Fe部分的三种不同的重组蛋白质(即IgG2单克隆抗体Mab X、Mab Y和Mab Z)在哺乳动物表达系统(即CHO细胞)中表达。通过离心使蛋白质与细胞和其它固体碎片分离并且使用蛋白A色谱树脂来纯化。将蛋白质交换到具有不同条件的溶液中，所述条件包括盐在50mM至300mM乙酸钠范围内，pH在4.3至7.4范围内并且蛋白质浓度为2g/L 至 30g/L。
[0175]纯化之后,通过暴露于由用户配置的500瓦特Hg Newport ()reil.?泛光曝光源(型号97536)递送的在254nm波长下的UV-C光来处理每一个这些蛋白质等分试样。配置曝光源以提供在所接受的OmJ/cm2至lOOOmJ/cm2的目标剂量范围内的均匀聚焦光和过滤光。所接受的剂量被定义为所递送的能量剂量的调节，所述调节将可能包含在样品中的组分(例如，蛋白质、保护剂化学品或其它溶液化学品)的紫外光吸光度考虑在内。通过下式调节剂
1~1?~α?
量:7jc0其中a =溶液的吸光度并且I是路径长度。将所希望的接受的剂量除以水因子以确定用于处理的目标递送的剂量设定值。通过测量溶液表面处的光源功率以及调节暴露时间来实现剂量给予。
[0176]通过以下各项中的一种或所有来分析每个样品的蛋白质修饰:用于聚集水平的SEC-HPLC、用于电荷同种型水平的CEX-HPLC、用于氨基酸残基修饰的肽图以及用于效力比较的基于细胞的生物活性测定。
[0177]所观察到的结果指出pH、电导率以及蛋白质浓度不明显影响蛋白质修饰的水平。这些实验证实了蛋白质纯度和/或修饰的变化的主要来源是UV-C剂量水平。图1至图8概述了 UV-C暴露对所研究的三种单克隆抗体的影响。
[0178]实施例2
[0179]在暴露于UV-C剂暈后对溶液添加剂关于蛋白质修饰和病毒灭活的评估
[0180]已建立了 UV-C暴露是造成单克隆抗体蛋白质受试者的修饰和/或降解的原因而pH、电导率或蛋白质浓度则不是，进行了密集的搜索以鉴定将保护蛋白质免受与UV-C暴露相关的不希望的作用的化合物。
[0181]使包含Fe部分的重组蛋白(单克隆抗体Mab X)在哺乳动物表达系统(即CHO细胞)中表达。通过离心使蛋白质与细胞和其它固体碎片分离并且使用蛋白A色谱树脂来纯化。将蛋白A柱洗脱池调节至pH5.0并且稀释或浓缩至浓度为2g/L、12g/L或30g/L蛋白质浓度。
[0182]纯化之后，在ImM添加剂/20mM蛋白质的比率下将来自每种浓度的样品与添加剂合并。添加剂包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、叶酸、苯丙氨酸、吡哆醇以及核黄素。通过暴露于由用户配置的Newport Orei丨⑧泛光曝光源(型号97536)递送的在254nm波长下的UV-C光来处理每一个这些蛋白质等分试样。配置曝光源以提供在所接受的OmJ/cm2至lOOOmJ/cm2的目标剂量范围内的均匀的聚焦光和过滤光。所接受的剂量被定义为所递送的能量剂量的调节，所述调节将可能包含在样品中的组分(例如，蛋白质、保护剂化学品或其它溶液化学品)的紫外光吸光度考虑在内。这是通过下式来调节的:水因子=.s-1 In ￠10) 其中a =溶液的吸光度并且I是路径长度。将所希望的接受的剂量除以水因子以确定用于处理的目标递送的剂量设定值。通过测量溶液表面处的光源功率以及调节暴露时间来实现剂量给予。
[0183]通过以下各项中的一种或所有来分析每个样品的蛋白质修饰:用于聚集水平的SEC-HPLC、用于电荷同种型水平的CEX-HPLC、用于氨基酸残基修饰的肽图以及用于效力比较的基于细胞的生物活性测定。这些测定的结果在图1至图9中示出。
[0184]所观察到的结果指出一些添加剂(即叶酸和组氨酸)以积极的方式不明显地影响蛋白质修饰的水平，并且甲硫氨酸示出微小的益处。然而，其它添加剂(如色氨酸或酪氨酸)相对于UV辐射的剂量水平对限制蛋白质修饰的程度具有明显积极的作用。图9至图10以及图14至图15概述了此调查研究的结果。令人意外的是，酪氨酸和色氨酸是有效的保护剂，而组氨酸和苯丙氨酸的保护性明显较低或没有保护性的。在酪氨酸和色氨酸中发现的环结构类似于在苯丙氨酸和组氨酸中发现的结构。酪氨酸和苯丙氨酸是结构上非常相近的相关氨基酸。进一步令人意外的是，甲硫氨酸不是有效的保护剂，因为注意到它在用高剂量的UV-C处理的蛋白质中被明显氧化(图7和图8)，而色氨酸是有效的保护剂并且也注意到在用高剂量的UV-C处理的蛋白质中被氧化。
[0185]此外，证明了所实现的病毒灭活水平(即xmuLV)响应于UV-C剂量水平并且可以是实际上明显的(参见图10)，无论是否存在添加剂。这些实验的结果证明添加剂提供针对UV-C介导的修饰的保护并且不会不利地影响通过UV剂量水平进行的病毒灭活。
[0186]实施例3
[0187]UV-C处理的过稈中实施的评估
[0188]使包含Fe部分的两种不同的重组蛋白(即IgG2单克隆抗体Mab W和Mab X)在哺乳动物表达系统(即CHO细胞)中表达。通过离心和深度过滤使蛋白质与细胞和其它固体碎片分离。纯化、调节以及评价之后，形成一系列预处理样品。生成两种样品成分(leg):一种源自离心的和深度过滤的材料并且另一种源自经过蛋白质色谱树脂进一步纯化和中和所述池。将每一种这些池与荧光剂涂覆的微球示踪剂合并，并且然后进一步分成添加和不添加保护性添加剂(即酪氨酸)的池。评价单个的稳定混合物在254nm波长光谱下的吸光度。然后通过暴露于不同剂量的UV-C光来处理每个这些稳定的蛋白质混合物。通过使混合物穿过包含33瓦特Hq灯的Atlantic UV Infinity?薄膜反应器来实现处理。混合物流过介于1.5m灯周围的石英套筒与不锈钢外壳之间形成的0.9_环形空间。
[0189]将每个预处理池分成单独的剂量曝光池。通过经由流速调节改变暴露时间来调节反应器内递送的剂量。通过下式调节所递送的剂量:剂量~(P/Q)exp(-al) = (PcZQtl)θχρ(-&(ι1)，其中a =溶液的吸光度并且I是环形路径长度。在此式中，P是灯的功率输出并且Q是具有吸光度=a的混合物的体积流速；匕和Qtl是具有吸光度=a0的参照混合物的功率和流速。
[0190]然后通过用于聚集水平的SEC-HPLC来分析每个样品的蛋白质修饰(表1)。
[0191]表1具有和不具有酪氨酸保护剂的Mab W
[0192]
【权利要求】
1.一种使包含蛋白质组分的样品中的病毒灭活的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白质组分的样品，其中已知或怀疑所述样品包含病毒； (b)鉴定在其下所述病毒被灭活的UV光的目标剂量； (C)将保护剂添加至所述样品中以形成稳定的混合物； (d)使所述稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段； (e)评价所述稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述评价指出所述目标剂量的UV光尚未递送至所述稳定的混合物，则调制所述波长、所述UV光源功率以及所述UV光暴露时间中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括色谱柱池。
3.如权利要求5所述的方法，其中所述池包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的HIC柱池、包含所述蛋白质组分的SEC柱池、包含所述蛋白质组分的IEC柱池以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括色谱柱流出物流。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述流出物流包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质组分包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii) Fe结构域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒包括以下各项中的一种或多种:dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒以及ssRNA病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述病毒包括以下一种或多种病毒科的病毒:腺病毒科、非洲猪瘟病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、环状病毒科、嗜肝DNA病毒科、细小病毒科、双RNA病毒科、呼肠孤病毒科、沙粒病毒科、raraaririi/ae、布尼亚病毒科、D型肝炎病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、动脉炎病毒科、星状病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、HEV-样病毒、野田村病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科以及逆转录病毒科。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒为所述细小病毒MVM、所述逆转录病毒MuLV或所述布尼亚病毒CVV。
10.如权利要求1所述的方法，其中以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将所述保护剂添加至所述样品中。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述UV光的波长在约200nm至约280 nm的范围内。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述UV光的波长为约254nm。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述目标剂量为以下各项中的一种或多种:约Imj/cm2、约 10 mj/cm2、约 25 mj/cm2、约 50 mj/cm2、约 75 mj/cm2、约 100 mj/cm2、约 125 mj/cm2、约 200 mj/cm2、约 250 mj/cm2、约 300 mj/cm2、约 350 mj/cm2、约 400 mj/cm2、约 450 mj/cm2、约500 mj/cm2、约600 mj/cm2、约700 mj/cm2、约800 mj/cm2、约900 mj/cm2、约1000 mj/cm2以及大于约1000 mj/cm2。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述方法提供了大于或等于约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5或大于约6.5的病毒对数减少值(LRV)。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述方法为自动化的。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
19.一种减少由UV暴露期间产生的反应性物种的存在而引起的蛋白质降解或修饰的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白质组分的样品，已知或怀疑所述蛋白质组分在存在反应性物种的情况下被降解或修饰； (b)鉴定UV光的目标剂量； (C)将保护剂添加至所述样品中以形成稳定的混合物； (d)使所述稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段； (e)评价所述稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述评价指出所述目标剂量的UV光尚未递送至所述稳定的混合物，则调制所述波长、所述UV光源功率以及所述UV光暴露时间中的一种或多种。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述样品包括色谱柱池。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述池包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的HIC柱池、包含所述蛋白质组分的SEC柱池、包含所述蛋白质组分的IEC柱池以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述样品包括色谱柱流出物流。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述流出物流包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质组分包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii) Fe结构域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
25.如权利要求19所述的方法，其中以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将所述保护剂添加至所述样品中。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；或(iii)酪氨酸和色氨酸。
28.如权利要求19所述的方法，其中所述UV光的波长在约200nm至约280 nm的范围内。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述UV光的波长为约254nm。
30.如权利要求19所述的方法，其中所述目标剂量为以下各项中的一种或多种:约Imj/cm2、约 10 mj/cm2、约 25 mj/cm2、约 50 mj/cm2、约 75 mj/cm2、约 100 mj/cm2、约 125 mj/cm2、约 200 mj/cm2、约 250 mj/cm2、约 300 mj/cm2、约 350 mj/cm2、约 400 mj/cm2、约 450 mj/cm2、约500 mj/cm2、约600 mj/cm2、约700 mj/cm2、约800 mj/cm2、约900 mj/cm2、约1000 mj/cm2以及大于约1000 mj/cm2。
31.如权利要求19所述的方法，其中所述方法为自动化的。
32.如权利要求19所述的方法，其中所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
33.一种减少经受UV光的蛋白质中的甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者的氧化的方法，所述方法包括: (a)提供包含蛋白质组分的样品，所述蛋白质组分包含甲硫氨酸残基、色氨酸残基或甲硫氨酸残基和色氨酸残基两者； (b)鉴定UV光的目标剂量； (C)将保护剂添加至所述样品中以形成稳定的混合物； (d)使所述稳定的混合物暴露于通过在选择的功率电平和选择的波长下操作的源来提供的UV光，持续选择的时间段； (e)评价所述稳定的混合物的UV-C暴露水平；以及 (f)如果所述评价指出所述目标剂量的UV光尚未递送至所述稳定的混合物，则调制所述波长、所述UV光源功率以及所述UV光暴露时间中的一种或多种。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述样品包括色谱柱池。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述池包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱洗脱液池、包含所述蛋白质组分的HIC柱池、包含所述蛋白质组分的SEC柱池、包含所述蛋白质组分的IEC柱池以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱池。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述样品包括色谱柱流出物流。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述流出物流包括以下各项中的一种或多种:包含所述蛋白质组分的蛋白A柱流出物流、包含所述蛋白质组分的蛋白G柱流出物流、包含所述蛋白质组分的HIC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的SEC柱流出物流、包含所述蛋白质组分的IEC柱流出物流以及包含所述蛋白质组分的羟磷灰石柱流出物流。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述蛋白质组分包括以下各项中的一种或多种:(i)抗原结合蛋白，其包括以下各项中的一种或多种:单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体以及其片段；(ii) Fe结构域；(iii)肽；Qv) Fe融合蛋白；以及(V)治疗性蛋白。
39.如权利要求33所述的方法，其中以大于I份保护剂比200份蛋白质的浓度比将所述保护剂添加至所述样品中。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项中的一种或多种:酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、吡哆醇以及核黄素。
41.如权利要求33所述的方法，其中所述保护剂包括以下各项之一:(i)酪氨酸；(ii)色氨酸；以及(iii)酪氨酸和色氨酸。
42.如权利要求33所述的方法，其中所述UV光的波长在约200nm至约280 nm的范围内。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述UV光的波长为约254nm。
44.如权利要求33所述的方法，其中所述目标剂量为以下各项中的一种或多种:约Imj/cm2、约 10 mj/cm2、约 25 mj/cm2、约 50 mj/cm2、约 75 mj/cm2、约 100 mj/cm2、约 125 mj/cm2、约 200 mj/cm2、约 250 mj/cm2、约 300 mj/cm2、约 350 mj/cm2、约 400 mj/cm2、约 450 mj/cm2、约500 mj/cm2、约600 mj/cm2、约700 mj/cm2、约800 mj/cm2、约900 mj/cm2、约1000 mj/cm2以及大于约1000 mj/cm2。
45.如权利要求33所述的方法，其中所述方法为自动化的。
46.如权利要求33所述的方法，其中所述方法作为蛋白质纯化操作中的一个步骤而进行。
【文档编号】A61L2/00GK104136047SQ201280064731
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2011年10月26日
【发明者】J.E.舒尔茨, R.哈特, B.威尔博恩 申请人:安姆根有限公司