专利名称：一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种软骨移植物，更具体的说是涉及一种用于软骨损伤的由脂肪干细胞和软骨细胞在三维胶原培养基共同培养形成的软骨组织移植物及其制备方法。
背景技术：
软骨损伤是比较难以治愈的病变，尤其是浅层性的软骨损伤。多种原因都可以造成软骨损伤，如外力冲击，自生免疫性疾病，老龄化导致的机体退化等。软骨的自身修复能力很弱，即使是很小的软骨缺损也很难愈合。因为软骨组织内没有血液供应，软骨内基质合成不是很活跃。但是如果伤口深到软骨下骨层，伤口反而有自我愈合的情况，这是因为由软骨下骨内的血液渗透出来形成血块，同时附近的干细胞有可能被激活来促进伤口的愈合。在临床治疗过程中，常通过钻孔至软骨下层导致出血或微骨折的方式来治疗软骨缺损。修复软骨缺损比较有效的方法之一是自体软骨细胞移植(ACT)，将自体软骨细胞在三维支架环境中培养，等到形成新的软骨样组织后再移植到缺损处修复软骨。这是最先由瑞典科学家提出的治疗骨性关节炎的一种方案。该方案的具体内容主要包括从体内的非负重部位取一块软骨组织，从中分离出软骨细胞，在体外特殊条件下培养增殖后，移植入损伤处，以达到修复目的。该方法已经在全世界范围内应用于20000多个患者身上，取得了不同程度的修复效果。但是该方法还是有一定的缺陷。该技术需要产生足够的软骨基质和软骨细胞来填充缺损处。可惜现有的方法产生的大部分是纤维状软骨，而不是天然的透明软骨组织，其修复以及机械性能较差。其它问题包括取样处发生病变、细胞供应量不足、细胞活性低、成熟的软骨增殖能力弱、软骨细胞在体外扩增时去分化状态均会导致植入体内后不能形成软
骨。 ACT技术的关键点是三维培养体系，需要采用合适的支架，给细胞的生长提供支持和营养，并能分化和保持特殊细胞表型的细胞。目前市面上已有产品在三维培养基的性能取得了很好的成果，三维培养基主要成分为成大鼠尾部肌腱，牛跟腱或小牛皮肤提取的胶原纤维，细胞在凝胶载体中可获得很好的生长支持。I型胶原纤维表面有特殊的细胞识别信号(特定氨基酸序列)，可促进细胞分化。I型胶原纤维构成的基质有利于保持软骨细胞的形态，加快细胞增殖。在临床应用中ACT存在的问题体现了这个培养体系目前存在的缺陷。主要问题是这个培养系统中只含有单一的软骨细胞成分，而在体内，细胞处于一个立体的空间，多种细胞共同存在、细胞间的相互作用、信号传导等对于细胞的功能影响很大。成分单一的培养系统会造成细胞成长缓慢，活性不高和去分化的状态，并且在植入体内后，没有持续的营养供应，会导致细胞存活率降低。基于对软骨细胞培养体系和脂肪干细胞的分化潜能和营养作用的认识，本发明将软骨细胞和脂肪干细胞共同三维培养来克服常规ACT细胞培养的不足。脂肪组织中含有一种具有间充质干细胞特性的细胞群体，被称作脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSC)。这种细胞具有自我更新和分化能力，大量的文献证实了 ADSCs不仅能分化成间充质细胞如脂肪，软骨，成骨，肌肉；还能分化成神经，血管来源的细胞。过去10年，脂肪干细胞在器官组织损伤的修复应用中逐渐受到重视，治疗的疾病包括类风湿性关节炎，软骨损伤，软组织填充和皮肤局部缺血等。自体脂肪干细胞的使用相比其它来源的间充质干细胞有较好的安全性，因为是自体组织，不会有排异反应，是理想的移植物。国内外已经有很多关于ADSCs的临床试验和相关的临床报告，大部分取得了让人满意的疗效。间充质干细胞除了具备很好的分化能力外，还能分泌各种生长因子来促进临近细胞的生长和损伤修复，如EGF、FGF、VEGF等。有研究表明，即使只采用这些生长因子也能够促进软骨损伤的自我修复或皮肤伤口的愈合。国外研究发现，将软骨细胞和骨髓间充质干细胞共同培养有助于软骨基质的生成。新生成的软骨基质大部分来源于软骨细胞，少部分是由干细胞分化形成的。所以在脂肪干细胞和软骨细胞共培养中，干细胞除了分化成软骨夕卜，还具有其他的补充作用。三维条件下培养的干细胞具有比平面培养更好的活性，分泌出更多的营养因子。这些生长因子能刺激软骨细胞的增殖和软骨基质的分泌，从而减少了对软骨组织取样量的要求。它们还有可能激活损伤处的自我修复机制，促进关节滑膜内自体干细胞的动员并向伤口迁移，达到协同的治疗效果。软骨细胞和脂肪干细胞共同培养产生的是一种高效的用于软骨修复的移植物。脂肪干细胞的加入不但提高了软骨细胞的增殖能力和活性，同时自身还是强有力的修复软骨的工具。该方法的优势还包括:对软骨细胞的需求量较低，软骨组织的培养密度在2-9xl05/ml，培养时间短，移植物存活的效率高，产生的透明软骨成分较多。
发明内容
本发明通过让脂肪干细胞与软骨细胞在三维胶原系统中共培养的形式，来克服现有ACT的培养系统的缺陷。软骨细胞和脂肪干细胞共同培养产生的是一种高效的用于软骨修复的移植物。脂肪干细胞的加入不但提高了软骨细胞的增殖能力和活性，同时自身还是强有力的修复软骨的工具。该方法的优势还包括对软骨细胞的需求量不是很大，细胞的培养密度在4xl05/ml左右，培养时间短，移植物存活的效率高，产生的透明软骨成分比较多。一种脂肪干细胞与软骨细胞的三维胶原共培养体系，包括从脂肪组织中分离培养脂肪干细胞，从软骨取样里分离软骨细胞，三维胶原培养基的制备及用含人体自身血清的培养基共同培养。本发明的具体技术方案是:I)从人的脂肪组织分离脂肪干细胞采用常规方法得到。简单的说，就是机械粉碎，胶原酶消化和过滤，然后平板培养。培养条件为37°C，5% CO2 (v/v)。当脂肪干细胞的生长密度达到70-90%时，进行传代培养。在和软骨细胞共同培养时，需要的干细胞数量在4xl05/ml左右。2)在准备共培养之前，收集脂肪干细胞，要用无菌PBS洗三次，以降低培养基中异源物带来的干扰。然后按照厂家说明将干细胞和软骨细胞以2:I的比例混入胶原培养基中。 3)在三维胶原培养中所采用的培养基采用自体血清替代传统的FBS，同时加有促脂肪干细胞成软骨转化的10ng/ml TGF β I和50ηΜ抗坏血酸_2_磷酸。4)本发明采用的三维培养基是大鼠胶原I型蛋白，是从大鼠尾巴中提取的胶原蛋白，它能够提高细胞的活性和功能，促进天然II型胶原的生成。我们使用ArthiOKinetics (Esslingen, Germany)生产纯度比较的产品，规格0.6mg/ml的0.1 %醋酸溶液。按照公司的产品说明书配制凝胶(I型胶原:DMEM=I: 1)，细胞接种密度2-9xl05/ml，接种好后的凝胶置于12孔板中培养。注:在选择培养基的过程中，要注意取新鲜制备的去除端肽和蛋白多糖的胶原纤维，也可以通过浸泡或添加TGF或BMP家族的生长因子的方式修饰胶原纤维。5)软骨组织的取样于非负重区取，例如膝关节股骨髁间窝。为了得到纯度高的软骨细胞，在距离滑膜5mm远的地方取软骨。软骨组织重IOOmg左右，大约米粒大小。这样分离出来的软骨细胞数量大约在2xl05/ml左右即可。6)软骨细胞分离后，不需要进行平面细胞培养，直接将准备好的脂肪干细胞和软骨细胞以2: I的比例混入凝胶进行共同培养。要确保细胞在凝胶中均匀的分布。7) 3D培养的血清采用患者自体血清。每3天更换一次培养基，培养2周后即可以应用于移植。
:图LA是人脂肪干细胞细胞第四天形态(xlOO) ;B是人脂肪干细胞细胞形态(xlOO)第一次传代。图2.hADSC细胞诱导成骨形成的软骨组织。图3.共培养促进11型胶原的生成:4周后，通过qPCR法来检测11型胶原的mRNA表达，为了便于在不同样本间进行比`较，我们采用mRNA对于GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的相对表达量，此图表明共培养的条件下，II型胶原表达的更多。图4.EdU检测表明共培养促进细胞的增殖生长能力:在收集细胞前一天，培养基改成含有IOmM EdU的成软骨诱导培养基，第二天，用PBS冲洗2次后再用含4% PFA的PBS溶液隔夜固定，用石蜡包埋，切IOmm的切片。用Edu-AleXa488染色，用Hoechst33342染细胞核，采用图像分析软件对Edu阳性的细胞进行计数，共同培养显著提高了软骨细胞的活性和增殖。图5.共培养促进糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)的产生:培养基质的切片去石蜡化后用含1，9_氯化二甲基亚甲基蓝(DMMB)的PBE溶液染色，然后用分光光度计测定GAG的含量，经过矫正，同样软骨细胞数目在共同培养条件下产生的GAG比软骨细胞单独培养高出3-4倍，GAG的量化证明了基质含量的增强。
具体实施方式
:为详细说明本发明的技术内容，所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的授权之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。所有用于细胞培养试剂均购自Gibco，Invitrogen公司，除非另有说明。常见的化学品购买自Sigma-Aldrich公司。一.脂肪干细胞的准备I)在软骨取样前10天左右，从患者大腿或腹部提取大约20ml脂肪，进行脂肪间质血管部分细胞分离和培养传代，直到需要和软骨细胞混合培养时，收集干细胞，计数。2)脂肪间质血管部分细胞(SVF)分离步骤:无菌条件下取脂肪组织，小心去除附着的纤维和血管，用灭菌的PBS充分洗脱以去除杂质和血细胞[I]。I型胶原蛋白酶(lmg/mL)消化(放入37°C震颤水浴槽中60min),产物通过100 μ m的尼龙筛过滤去除杂质，470Xg离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液，DMEM培养液(DMEM，Invitrogen ;含10%胎牛血清、0.2mM抗坏血酸，100μ g*ml-l青霉素和100μ g*ml-l链霉素)重悬细胞，470 Xg离心5min。去除上清液，重悬沉淀细胞，在37°C、5% C02培养箱中孵育。24小时后，用显微镜观察，没贴壁的细胞用PBS洗去，培养液换成Keratinocyte-SFM(Invitrogen),含0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/mLrEGF，and5%FBS)。细胞生长至75 % 90 %融合时传代，每2 3d更换培养液。3)需要使用时，将分离收集干细胞用灭菌生理盐水洗脱3次以上，去除FBS的影响。取一小部分进行细胞定量和质量监控的检测，根据培养基的大小，保留4xl05/ml进行和软骨细胞的共培养，多余的细胞进行冻存处理。二.软骨细胞的准备I)在征得风湿性关节炎患者同意后，活检期间，通过关节镜手术，从非负重区取一块所需量软骨组织，例如膝关节股骨髁间窝。为了得到纯度高的软骨细胞，没有其它类型细胞的污染，在距离滑膜5mm远的地方取一小块软骨，重IOOmg左右，大约米粒大小。2)用精细剪刀将其剪成 Imm3的小块，用PBS冲洗后将置于II型胶原酶(0.15% )中在37°C条件下消化20-22小时。用软骨细胞增殖培养基配置胶原酶溶液。该培养基成分是 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM),添力口 10% FBS, I %非必需氨基酸,0.2mM抗坏血酸-2-磷酸(AsAP) ,0.4mM脯氨酸，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素.
3)将软骨细胞收集起来，计数，根据培养基的大小，采用2xl05/ml的细胞进行和脂肪干细胞的共同培养。软骨细胞分离后，不需要进行平面细胞培养，直接混合脂肪干细胞和凝胶共同培养。三.三维培养体系的制备，软骨细胞和脂肪干细胞共培养I)我们使用Arthro Kinetics (Esslingen, Germany)生产纯度比较高的产品，规格0.6mg/ml的0.1%醋酸溶液。在4°C，为液体状，37°C为凝胶状。按照公司的产品说明书配制凝胶(I型胶原:DMEM=I: 1)，细胞接种密度2-9xl05/ml。接种好后的凝胶置于12孔板中培养，培养基中补充促脂肪干细胞成软骨转化的成分10ng/ml TGF β I和50ηΜ抗坏血酸-2-磷酸。2)脂肪干细胞和软骨细胞以2: I的比例混入凝胶进行共同培养。要确保细胞在凝胶中均匀的分布3) 3D培养时间是10-14天，血清采用患者自体血清。每3天更换一次培养基，培养2周后的可以应用于移植。四.成软骨诱导培养方法I) 1.计算实验所需颗粒(2.5 X 105ADSC的需要以形成每个软骨细胞的颗粒)的总数目。将这个量的细胞转移到一个适当的培养管中，以洗涤细胞。2)用不完全成骨培养基洗涤脂肪干细胞:室温下离心细胞，150g离心5分钟，吸弃上清，每7.5X105个细胞用Iml不完全成软骨培养基重悬，150g离心5分钟，吸弃上清。3)用完全成软骨培养基重悬细胞，使得ADSC的浓度为每毫升5.0X 105个细胞。4)等分试样，即将0.5毫升(2.5X105个细胞)的细胞悬浮到15mL的聚丙烯培养管中。室温下离心，150g离心细胞5分钟.此步骤禁止吸弃上清液和重悬。5)松开帽管一个半圈，让气体交换，并在37°C，5% C02饱和湿度条件下的孵化管。24小时内不要搅动到沉淀。6)每2-3天更换培养基(在吸弃培养基的时候，1-200 μ L无菌移液管的管尖应贴着上清液面，以避免吸走沉淀)。每管加入0.5mL新鲜完全成软骨培养基。7)更换培养基后，滑动每个管的底部以确保沉淀是游离的，松开管帽并放回37°C培养箱中培养。8)成软骨细胞团在培养14-28天后可以收样。用福尔马林固定，石蜡包埋后阿尔辛蓝染色 。
权利要求
1.一种用于软骨损伤修复的软骨移植物，其特在在于:脂肪干细胞和软骨细胞在三维胶原系统中共同培养。
2.根据权利要求1所述的软骨移植物，其特征还在于:三维胶原系统包括脂肪干细胞，软骨细胞，胶原纤维培养基。
3.根据权利要求2所述的软骨移植物，其特征还在于:培养基中含人体自身血清。
4.根据权利I所述的软骨移植物的制备方法，其特征在于:采用常规方法从人脂肪组织中分离脂肪干细胞，在和软骨细胞共培养前，需要的干细胞数量为4xl05/ml左右；在准备共培养之前，收集脂肪干细胞，用无菌PBS洗三次；从软骨组织中取样分离软骨细胞；采用大鼠胶原I型蛋白制备三维培养基，培养基中加有促脂肪干细胞成软骨转化的10ng/mlTGF β I和50ηΜ抗坏血酸_2_磷酸；将脂肪干细胞和软骨细胞以2: I的比例混入胶原培养基中共同培养；每3天更换一次培养基，培养2周后即可以应用于移植。
5.根据权利要求4所述的软骨移植物的制备方法，其特征还在于:胶原纤维取自新鲜制备的去除端肽和蛋白多糖的胶原纤维，也可以通过浸泡或添加TGF或BMP家族的生长因子的方式修饰胶原纤维。
6.根据权利要求4所述的软骨移植物的制备方法，其特征还在于:软骨组织取样于非负重区 取。
全文摘要
本发明公开了一种基于脂肪干细胞和软骨细胞共培养技术的软骨移植物。该方法更有效，更安全，能在较短的时间内得到足够多的软骨细胞用于移植，并且能高效的转化为软骨组织，提高了软骨组织移植的治疗效果。本发明利用了脂肪干细胞的营养功能，将它们与软骨细胞于三维培养系统中共同培养，由于干细胞和软骨细胞的相互作用，促进了软骨细胞的增殖和活性，同时脂肪干细胞也会受环境影响部分分化为软骨细胞，这样即使在软骨细胞取样不足或活性不够的情况下，也能得到高质量的软骨移植物，同时促进了移植物的存活，对浅层的软骨缺损也可以达到很好的效果。
文档编号A61L27/38GK103223194SQ20131001593
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者付擎昊, 康贤通, 章戴荣 申请人:广州莱德尔生物科技有限公司