专利名称：脱细胞纤维环基质的制备方法
技术领域：
本发明涉及动物细胞或组织领域，具体是一种脱细胞纤维环基质的制备方法。
背景技术：
椎间盘退变是一类常见病，严重影响人们的生活，也是骨科治疗难题之一。组织工程技术的出现为椎间盘疾病的治疗提供了新的思路和方法，有望为椎间盘修复或置换提供永久替代产品，其中，纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要解决的问题，只有纤维环得到修复才能让髓核组织保持在椎间隙，进而对退变髓核实施下一步治疗。近年来，用于构建组织工程纤维环的支架材料研究较多。如取向性电纺丝纳米支架，虽然结构规则、孔隙均匀，但成分与天然纤维环相差很大，生物相容性差；取向性藻酸盐 /壳聚糖复合支架，其力学性能与天然纤维环相差甚远；聚已酸内酯苹果酸三醇/脱钙骨基质明胶双相纤维环支架，双相支架的内外层结合不牢、容易脱落，且生物相容性差；国内潘勇等用脱矿脱细胞骨基质环作为纤维环支架，细胞相容性好，但其可塑性差，结构与天然纤维环的斜交叠层复杂结构相差甚远。综上，纤维环细胞外基质(ECM)生化成分与结构复杂，呈斜交叠层排列，而目前国内外无论人工合成还是天然仿生材料，很难真正模仿椎间盘复杂的天然结构、组成成分及生物力学特性。近年，脱细胞基质引起了国内外学者的广泛关注，脱细胞基质去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，保留了组织的天然成分和复杂结构，具有与体内组织相近的力学性能，因此，脱细胞基质是一种理想的支架载体，已得到广泛应用，并且异体脱细胞真皮基质、猪脱细胞心瓣膜、猪脱细胞膀胱已被批准应用于临床。目前尚无用脱细胞纤维环基质作为纤维环支架的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中，组织工程纤维环支架在材料成分、结构、力学性能的不足，而提供一种与天然纤维环十分接近的脱细胞纤维环基质的制备方法。一种脱细胞纤维环基质的制备方法，是按以下步骤进行的
(1)取健康成年猪的脊柱纤维环，无菌生理盐水充分漂洗；
(2)浓度为IOmM含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中4°C振汤 48 h ；
(3)浓度为IOmM含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中，加入I 5%的TritonX-1OO后，室温振荡12 96 h ；
(4)放入含O.05 O. 5 mg/ml脱氧核糖核酸酶、5 50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液，37°C振荡12 36 h ；
(5)无菌生理盐水振荡清洗24h，放在无菌PBS缓冲液中4°C保存。所述的健康成年猪为6 7月龄，雌雄不限。所述的脊柱纤维环是外径为5 20 mm,厚度为2 7 mm的尾椎纤维环。
所述的振荡频率均为80 250 r/min。本发明的主要优点如下
①本发明所采用的纤维环材料属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，且材料来源广泛，可批量生产。②通过脱细胞系列处理去处抗原成分，避免发生免疫排斥反应、传播疾病。③本发明的组成成分、结构、力学性能都与天然纤维环十分接近，为种子细胞提供一个与体内纤维环十分接近的生长环境。
图1是正常纤维环HE染色 图2是脱细胞纤维环基质HE染色 图3是正常纤维环Hochest33258染色 图4是脱细胞纤维环基质Hochest33258染色 图5是正常纤维环甲苯胺蓝染色 图6是脱细胞纤维环基质甲苯胺蓝染色 图7是正常纤维环I型胶原免疫荧光 图8是脱细胞纤维环基质I型胶原免疫荧光 图9是正常纤维环扫描电镜图； 图10是脱细胞纤维环基质扫描电镜图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。1、脱细胞纤维环基质的制备方法
(1)取材取6 7月龄(雌雄不限)健康成年猪的尾椎间盘，无菌生理盐水冲洗干净，去除中央髓核及外周肌肉组织，选取直径及厚度相近的尾椎纤维环，外径9 11 _，平均10 mm ;厚度4. 5 5. 5 mm,平均5 mm,用无菌生理盐水充分漂洗；
(2)脱细胞处理将上述处理后的纤维环组织放入IOmM含O.1% EDTAUO KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中，4°C 150r/min振荡48 h进行低渗处理，去离子水冲洗干净；用含3%TritonX-1OO 的 Tris 缓冲液(含 O. 1% EDTAUO KIU/ml 抑肽酶)室温 150r/min 振荡 72 h,每24 h换液一次,去离子水冲洗干净；用含O. 2 mg/ml脱氧核糖核酸酶(DNase I ) >20 ug/ml核糖核酸酶A (RNase A)的Tris缓冲液37°C 150r/min振荡24 h,去离子水冲洗干净；
(3)清洗用无菌生理盐水150r/min振荡24h进行清洗，清洗完后将脱细胞纤维环基质放在PH 7. 30无菌PBS缓冲液中保存。经上述处理的脊柱纤维环不含纤维环外周肌肉组织及纤维环/髓核交界区。本发明采用性质比较温和的去垢剂Triton X 一 100对天然纤维环进行脱细胞处理，去除了天然纤维环的细胞成分，但没有改变纤维环组织的组成、结构及力学性能。2、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的组织学及电镜观察
HE染色放大100倍可见大量细胞均匀的分布在正常纤维环基质中，脱细胞纤维环基质中无细胞及细胞碎屑残留(见图1、2)。Hochest33258染色放大100倍可见正常纤维环中细胞呈点状荧光，脱细胞纤维环基质呈阴性(见图3、4)。甲苯胺蓝染色放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均呈蓝色(见图5、6)。I型胶原免疫荧光放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均为阳性，呈红色荧光(见图7、8)。扫面电镜可见正常纤维环放大200倍及脱细胞纤维环基质放大80倍均排列有序，微观结构无差别(见图9、10)。3、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的生化成分分析
胶原及氨基葡聚糖(GAG)是纤维环的主要组成成分，经测定脱细胞纤维环基质的胶原含量为(150. 83 ±2. 43) ug/mg,与正常纤维环的胶原含量(143. 99 ±4. 86) ug/mg相比无统计学意义；脱细胞纤维环基质的GAG含量分别为(41. 07 ±2.54)ug/mg，稍低于正常纤维环的 GAG 含量(54. 01 土 2.84)%。4、正常纤维环脱及细胞纤维环基质的生物力学测定
经测定脱细胞纤维环基质的极限载荷为(24. 52±3. 83) N,极限应力为(6. 02±0. 83)MPa,极限应变为(O. 41 ±O. 05) %，韧度为(15. 58±1. 62) N/mm,弹性模量为(28. 89±5. 50)MPa,断裂功耗为(30. 85±5· 15) X 10_3J ;与对照组的极限载荷(22. 98±2· 10) N,极限应力(5. 86土L 13) MPa,极限应变(O. 34±0· 05)%，韧度(17·00±2· 89) N/mm,弹性模量(30. 71 ±5. 47)MPa，断裂功耗(29. 62 ±5. 26) X 10_3J相比均无统计学差异。
权利要求
1.一种脱细胞纤维环基质的制备方法，其是按以下步骤进行的 (1)取健康成年猪的脊柱纤维环，无菌生理盐水充分漂洗； (2)在浓度为IOmM,含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中4°C振荡48 h ； (3)在浓度为10mM，含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中，力口入I 5%的TritonX-1OO后，室温振荡12 96 h ； (4)放入含O.05 O. 5 mg/ml脱氧核糖核酸酶、5 50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液，37°C振荡12 36 h ； (5)无菌生理盐水振荡清洗24h，放在无菌PBS缓冲液中4°C保存。
2.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于所述的健康成年猪为6 7月龄，雌雄不限。
3.按照权利要求1所述脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于所述的脊柱纤维环是外径为5 20 mm，厚度为2 7 mm的尾椎纤维环。
4.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于所述振荡频率均为 80 250 r/mirio
全文摘要
本发明公开了一种脱细胞纤维环基质的制备方法，属于动物细胞或组织领域。本发明是取健康成年猪的脊柱纤维环，经无菌生理盐水充分漂洗；放入浓度为10mM，含0.05～0.5%EDTA、5～50KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡；再放入含1～5%TritonX-100的上述Tris缓冲液，室温振荡；放入含0.05～0.5mg/ml脱氧核糖核酸酶、5～50ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液中，振荡；最后，无菌生理盐水振荡清洗，放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。本发明的制备过程简单，细胞去除彻底，结构保留完整，基质含量及力学性能与天然纤维环相近，是一种良好的组织工程纤维环支架材料。
文档编号A61L27/36GK103007352SQ20131002097
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者徐宝山, 杨强, 许海委, 马信龙, 李秀兰, 夏群, 张春秋 申请人:天津市天津医院