专利名称：一种杜仲提取物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及一种杜仲提取物及其用途。
背景技术：
杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥树皮,是中国名贵滋补药材。具补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效。《神农本草经》列为上品。谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余浙。久服，轻身耐老。”杜仲是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。近年来，国内外专家对杜仲成分进行了反复细致的研究，杜仲游离氨基酸极少，含有的少量蛋白质，是和绝大多数食品类似的完全蛋白，即能够水解检出对人体必需的8种氨基酸。测定了杜仲所含的15种矿物元素，其中有锌、铜、铁等微量元素，及钙、磷、钾、镁等
宏量元素。杜仲具有补肝肾，强筋骨，清除体内垃圾，加强人体细胞物质代谢，防止肌肉骨骼老化，平衡人体血压，分解体内胆固醇，降低体内脂肪，恢复血管弹性，利尿清热，广谱抗菌，兴奋中枢神经，提高白血球数量，增强人体免疫力等显著功效。骨代谢疾病是指由多种因素引起骨组织中钙、磷等矿物质、成骨细胞和/或破骨细胞功能异常从而导致骨基质、骨细胞代谢紊乱。包括骨质疏松症、骨软化病、佝偻病等。其中最常见的骨质疏松症(Osteoporosis, 0P)已经成为世界范围的、日趋严重的重要问题。资料显示，美国、欧洲和日本受累人数大约有7500万，其中1/3为绝经后妇女。国内的情况亦不容乐观，据统计，60 69岁老年妇女骨质疏松发生率高达50% 70%，老年男性发生率约为30%左右。随着社会人口老龄化，世界 各国骨质疏松的发生率还会增加。骨质疏松因其引起的严重后果一骨折和巨额的医疗费用而受到了社会的高度重视。骨代谢疾病的细胞学本质是承担骨重建任务的成骨细胞(osteoblast，0B)和骨吸收的破骨细胞(osteoclast，0C)数量和功能比例的失调，因此成骨细胞数量上的补充和功能的强化，以纠正失调的比例就成为了学术界重点关注的热点之一，也是治疗骨质疏松的一个方向。骨髓间充质干细胞(bMSCs)具有多向分化的功能，在不同的因素调节之下，可向着不同细胞(成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肌细胞)方向分化。因此诱导和调节bMSCs向成骨细胞方向分化，同时抑制bMSCs的成脂分化，也成为目前治疗与成骨细胞功能异常相关疾病的热点。体外培养的bMSCs成骨/成脂分化的指标有多种，最有说服力的指标是已进入分化末端或接近末端出现的特异性标志物。标志物主要包括了形态学指标、化学特异性染色指标、分子指标(包括特异性基因表达、蛋白表达一Western blot法或免疫细胞化学法)。骨质疏松症在体检测指标也有多种，主要包括影像学的骨密度、生化的血清标志物、组织学的骨切片、物理学的骨重和抗破坏性力学数据，化学分析的无机元素含量和组成比率等。临床上治疗骨质疏松症药物普遍存在着毒副作用，如雌激素的长期使用将增加乳腺癌或子宫内膜增生发生的风险，二磷酸盐的使用容易导致骨残、骨关节或肌肉疼痛等，因而近年来中药及中药提取物对骨质疏松症的防治作用引起了广泛的关注。中药普遍具有双向调节作用，毒副作用较小，便于长期服用，因此应用前景广阔。目前已被证实对骨质疏松症治疗有效的单味中药主要有淫羊藿、杜仲、蛇床子、黄芪、红曲、骨碎补、葛根、牛膝、续断等，中药提取物(有效组份、有效部位)也有一些报道，目前尚无中药杜仲的药效成分用于骨代谢异常疾病的临床应用。
发明内容
本发明以杜仲为原料，提取得到一类具有抗骨质疏松药理活性的物质，开拓了杜仲的药用范围，也为骨质疏松病人提供了一种新的治疗用药选择。本发明具体技术方案如下
一种杜仲提取物，由如下步骤制备而成
(1)以杜仲为提取原料，用醇 与水的混合溶液进行提取；
(2)将步骤(I)的提取液经中性氧化铝层析柱除去色素，收集洗脱液，浓缩；
(3)使用有机溶剂萃取步骤(2)得到的洗脱液，得到杜仲提取物。上所述杜仲优选盐杜仲，由如下方法制得将杜仲干燥树皮浸入饱和NaCl溶液中15分钟，取出晾干，制成小块或小条，150-180°C烘烤4h，形成盐杜仲，此步骤为破坏杜仲胶，以使有效成分更多的溶出。上述杜仲可采用粉碎机粉碎，提高提取效率。上述醇与水的混合溶液为甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种与水任意比例的混合物。上述步骤(I)优选条件为取盐杜仲粉，60%乙醇室温浸泡10分钟，充分溶胀，60°C浸提30分钟，过滤，残渣再用60%乙醇60°C浸提30分钟，合并两次提取液。上述步骤(2)选用中性氧化铝层析柱，中性氧化铝可吸附去除提取液中无用的色素,优选100-200目的中性氧化铝，优选采用柱体积为Φ60πιπιΧ80πιπι，填料预先用乙醇饱和。收集过柱后的流出液,滤液全部过柱后,在用IOOml乙醇洗柱，并收集流出液。上述醚类有机溶剂为乙醚、氯仿、正丁醇中的一种或几种混合物。上述步骤(3)优选萃取次数为3次。本发明还提供了上述的杜仲提取物在制备预防和治疗骨代谢异常疾病的药物组合物中的应用。本发明所述骨代谢异常疾病包括骨质疏松症，包括绝经后的骨质疏松症，绝经后的骨损失，男性骨质疏松症，皮质类固醇诱导的骨质疏松症等；
药物疗法继发的或者由于药物疗法，如二苯乙内酰脲、甲状腺激素替代疗法，导致的骨损失；
或与不活动和空间飞行有关的骨损失和与类风湿性关节炎、骨质减少、成骨不全、甲状腺机能亢进、神经性厌食症、器官移植、人工关节松动有关的骨损失。本发明所述的药物组合物，包含本发明所述的杜仲提取物以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。本发明所述的杜仲提取物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐及可药用载体。较佳的，本发明的药物组合物有O. 1-99. 9%重量百分比的作为活性成分的本发明的化合物或其可药用盐。“可药用载体”不会破坏本发明的化合物或其可药用盐的药学活性，同时其有效用量，即能够其药物载体作用是的用量对人体无毒。“可药用载体”包括但不限于离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS^n d-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活性剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、环糊精如α-、β_、Y-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β -环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的化合物、其药用盐或前药的药物传递。其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬脂酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。上述本发明的杜仲提取物以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂等。给药途径包括皮下、皮内、动脉内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、病灶内、颅内注射或输注，或者，口服、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、皮内、粘膜、气管、尿道给药，或者通过吸入气雾或植入蓄积或者针刺方式给药。上述本发明的杜仲提取物以及药物组合物的治疗有效量为O. 001-100mg/kg/d之间，可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗，为本领域技术人员能够理解的范围。
图1为本发明杜仲提取物诱导bMSCs对ALP、PPAR- Y基因表达的影响。图2为本发明杜仲提取物进行去势大鼠灌胃3个月后，体重测定结果。图3为本发明杜仲提取物进行去势大鼠灌胃3个月后，胫骨抗弯曲力测定。图4为本发明杜仲提取物进行去势大鼠灌胃3个月后，血清ALP测定。
具体实施例方式以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1、杜仲提取物的制备
取杜仲干燥树皮，浸入饱和NaCl溶液中15分钟，取出晾干，制成小块或小条，150-180°C烘烤4h，粉碎机粉碎，制得盐杜仲粉。取100克盐杜仲粉，加入300ml 60%乙醇室温浸泡10分钟，充分溶胀，60°C水浴30分钟，抽滤漏斗滤纸减压过滤，残渣再一次60°C水浴30分钟，减压过滤，合并滤液。滤液加入到填料为中性氧化铝(100-200目)层析柱中，柱体积为Φ60mmX80mm,填料预先用乙醇饱和。收集过柱后的流出液,滤液全部过柱后,在用IOOml乙醇洗柱，并收集流出液。使用旋转蒸发仪60°C减压蒸发浓缩，直至剩余IOOml左右时结束。分别使用IOOml乙醚萃取浓缩液3次，收集合并乙醚萃取液，室温蒸发乙醚。使用30ml 80%甲醇溶解乙醚蒸发后的产物，搅拌，SOOOrpm离心5分钟，取上清得到杜仲粗提物。实施例2、杜仲提取物的制备诱导bMSCs实验
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是细胞成骨分化的标志分子,ALP的升高提示细胞已经完成了成骨分化的主要阶段。常用RT-PCR、RT-荧光定量PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法检测。1.大鼠 bMSCs 培养
1)2月龄SD大鼠(雌雄不拘)，颈椎脱白法处死，浸入70%乙醇消毒5-10分钟。无菌条件下剪开腿部皮肤和肌肉，取股骨和胫腓骨，剔净肌肉，骨两端剪去端部组织，暴露红骨髓。用无菌注射器吸取少许培养基，从骨的一段插入骨髓腔中，冲出骨髓细胞于无菌培养皿/培养瓶/培养板中，或用骨钳夹碎骨骼，释放细胞，用培养基调整细胞密度为I X 105/ml后，置培养瓶/培养板中，放入37 °C，5%C02培养箱中。48小时后首次换液，之后实时换液；
2)细胞生长融合达90%后传代。倾去培养基，PBS洗涤，加入O.25%胰酶，消化数分钟，倾去胰酶，加入培养基吹打，分瓶，补足培养基，放入37°C，5%C02培养箱中。2-3天后再次传代。培养基组成DMEM/F12(1:1)，含15%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml，适量 NaHCO3, pH7. 2-7. 4。2.杜仲提取物诱导
将bMSCs接种至6孔细胞培养板中培养，培养基血清浓度降为7. 5%，以2 μ g/ml浓度的杜仲提取物进行诱导，并设非诱导的阴性对照组，诱导时间为10天，期间实时换液。3. RNA提取、荧光定量PCR检测成骨和成脂标志基因表达
I)RNA提取
1.将ImlRNAiso Plus试剂加入到6孔培养板中，震荡I分钟，使其裂解培养细胞；
2.将裂解液转移到1.5ml EP管中，加入0. 2ml氯仿，震荡，室温静置5分钟；
3.1200rpm离心5分钟,转移上清液至另一1. 5ml EP管中(约400ul)；
4.加入400ul异丙醇，充分混匀，室温静置10分钟；
5.1200rpm离心5分钟,弃上清；
6.沉淀加入0.5ml 75%乙醇(DEPC水配制)，上下颠倒洗涤沉淀；
7.1200rpm离心5分钟，弃上清，室温充分挥发乙醇；
8.加入适量(一般20-50ul)DEPC水，溶解沉淀，-80°C保存。2)逆转录反应1.按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。
权利要求
1.一种杜仲提取物，其特征在于由如下步骤制备而成(1)以杜仲为提取原料，用醇与水的混合溶液进行提取；(2)将步骤(I)的提取液经中性氧化铝层析柱除去色素，收集洗脱液，浓缩；(3)使用有机溶剂萃取步骤(2)得到的洗脱液，得到杜仲提取物。
2.如权利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(I)醇与水的混合溶液为甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种与水任意比例的混合物。
3.如权利要求2所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(I)具体为取盐杜仲粉，60% 乙醇室温浸泡10分钟，充分溶胀，60°C浸提30分钟，过滤，残渣再用60%乙醇60°C浸提30 分钟，合并两次提取液。
4.如权利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(2)中性氧化铝为100-200目。
5.如权利要求4所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(2)采用95%的乙醇进行洗脱。
6.如权利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(3)有机溶剂为乙醚、氯仿、 正丁醇中的一种或几种混合物。
7.如权利要求6所述的杜仲提取物，其特征在于所述步骤(3)萃取次数为3次。
8.如权利要求1-7之一所述的杜仲提取物在在制备预防和治疗骨代谢异常疾病的药物组合物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的药物组合物中含权利要求1-7之一所述的杜仲提取物以及药学上可以接受的载体。
10.如权利要求8所述的应用，其中所述骨代谢异常疾病包括骨质疏松症、药物疗法继发的或者由于药物疗法导致的骨损失、与不活动和空间飞行有关的骨损失和与类风湿性关节炎、骨质减少、成骨不全、甲状腺机能亢进、神经性厌食症、器官移植、人工关节松动有关的骨损失。
全文摘要
本发明提供了一种杜仲提取物，由如下步骤制备而成(1)以杜仲为提取原料，用醇与水的混合溶液进行提取；(2)将步骤(1)的提取液经中性氧化铝层析柱除去色素，收集洗脱液，浓缩；(3)使用有机溶剂萃取步骤(2)得到的洗脱液，得到杜仲提取物。本发明还提供了本发明所述杜仲提取物在在制备预防和治疗骨代谢异常疾病的药物组合物中的应用。
文档编号A61P19/10GK103040915SQ20131002783
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者谭湘陵, 羌利民, 张艳红, 张谦, 钱晓伟 申请人:南通大学