技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及卟啉色素作为免疫佐剂和疫苗的用途。
背景技术：
现代免疫治疗和免疫预防中的难题不是疫苗本身的免疫原性问题，而是疫苗制剂（非污染因素）的安全性问题。传统疫苗为低毒或灭活的病源微生物，免疫效果好，但危险性高；因此，现代疫苗通常采用病原微生物的某种无毒标志性成分或其人工模拟物作为抗原，称为亚单位疫苗或表位疫苗。现代疫苗在排除了危险性的同时大大减弱了免疫原性，需要免疫佐剂来弥补其免疫原性的不足，导致现代疫苗的研究实质上变成了免疫佐剂的研究，同时也将应用的安全性问题转嫁到免疫佐剂上。
免疫佐剂是指与抗原混合使用，以增强抗原免疫效果的物质。免疫佐剂的使用可以加速、延长、增强特异性免疫反应，增加抗体以及效应T细胞的数量，因此可以减少疫苗的使用剂量和免疫次数，也可以改善疫苗的免疫途径。
免疫佐剂促进抗原免疫效果的机理包括下列的一项或多项：（1）促进抗原在注射部位的吸收，抗原递呈细胞对抗原的捕获、加工和向淋巴结的转运（地理效应）；（2）储存并不断释放抗原，延长抗原对淋巴组织的刺激（仓库效应）；（3）模拟细菌或病毒的组分与病原识别受体结合，激活天然免疫细胞释放必要的细胞因子，上调抗原递呈细胞表达免疫共刺激信号分子；（4）产生或模拟组织损伤和危险应急信号，上调抗原递呈细胞表达免疫共刺激信号分子；（5）人工重组的细胞因子或共刺激信号分子作为免疫佐剂的直接作用。可见，免疫佐剂的核心机制是激活天然免疫系统，以弥补亚单位疫苗对天然免疫系统刺激的不足。
现有被用作免疫佐剂的物质百种之多，比如油脂来源的弗氏佐剂（FA）和MF59，细菌来源的胞壁酰三肽MTP和胞壁酰二肽MDP，细菌DNA，植物来源的皂角苷QuilA，细胞因子等等，但绝大多数免疫佐剂的作用机理以及在体内的代谢途径不明确，并且存在一定的毒副反应和安全性风险。
弗氏佐剂，包括弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂（CFA），是在实验动物中所使用的经典免疫佐剂。弗氏不完全佐剂由低黏度的矿物油及乳化剂组成，主要诱导Th2型免疫应答，仅能刺激体液免疫，诱导生成抗体。弗氏完全佐剂是在弗氏不完全佐剂中添加一定量减毒的分枝杆菌而成，主要诱导Th1型免疫反应，可以同时刺激体液和细胞免疫，显著增强细胞介导的免疫反应。但弗氏佐剂的副作用大，矿物油成分会引起肉芽肿和局部脓肿，减毒的分枝杆菌可能导致肺结核，不能在临床上使用。
MF59由角鲨烯、Tween-80、span-85等组成，不含有其他的免疫刺激组分，可增强体液和细胞免疫应答。但MF59也存在不良反应，如局部疼痛、发热、红斑、硬结等。
细菌细胞壁成分肽聚糖，如胞壁酰三肽MTP、胞壁酰二肽MDP等能诱导机体分泌多种细胞因子，是较强的免疫刺激剂。因此，许多胞壁酰二肽的衍生物被制成免疫佐剂，且申请了相关专利，但这些衍生物对免疫系统的刺激作用比较弱，活性不如弗氏佐剂。
细菌DNA可以在体外刺激免疫细胞，如CpGs可激发先天免疫反应，用于粘膜免疫，当与蛋白质抗原共价结合形成免疫复合物时，佐剂效应更明显。但出于安全性考虑，CpGs主要用于啮齿类和鼠类动物的研究，还没有应用于人体。
皂角苷QuilA一直在兽医学中被用作佐剂，但QuilA是一种表面活性物质，容易引起红细胞溶血。
多数细胞因子，包括IL-1，IL-2，IFN-γ，IL-12及细胞集落因子GM-CSF，对机体免疫力具有良好的调节作用，但几乎所有的细胞因子都具有剂量依赖的毒性，不够稳定且成本高，作为免疫佐剂可行性不高。
出于安全性考虑，在人用的免疫佐剂中，应用比较成熟和广泛的是Al(OH)3佐剂，至今仍是美国食品药品监管局（FDA）准许用于人类疫苗的唯一佐剂。但Al(OH)3佐剂本身对免疫系统没有刺激作用，主要通过吸附、储存和缓释抗原的仓库效应来延长抗原对淋巴组织的刺激，增强效果有限。因此，寻找安全性好，作用机制明确的免疫佐剂，尤其是人用免疫佐剂，具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供卟啉色素（Porphyrins，PP）作为免疫佐剂（Adjuvants）的用途。
本发明的目的还在于提供卟啉色素作为疫苗（Vaccines）的用途。
本发明所述卟啉色素为含有卟啉环（如附图1所示）的系列化合物，并在卟啉环的中心螯合Fe2+/3+、Co2+/3+、Cu2+、Zn2+、Mg2+等二价或三价金属离子，且在卟啉环的2、3、7、8、12、13、17、18位上连接不同的烷烃、烯烃、醇和羧酸等基团。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：卟啉色素作为免疫佐剂的用途。
本发明中的卟啉色素在制备具有免疫预防和免疫治疗作用的免疫佐剂的药物中应用时：
（1）卟啉色素可以独立作为佐剂使用，以达到增强抗原或疫苗的免疫效果；
（2）为了增强卟啉色素的免疫佐剂效果，可以选择具有促进抗原吸收、储存、缓释、递呈功能的生物油脂（如膜脂、植物油、动物油）、生物多糖（如动物粘多糖）或其他生物相容性良好的物质作为辅助成分与卟啉色素联合使用。
本发明采用卟啉色素作为免疫佐剂的特点是：
（1）卟啉色素是一类生物色素，在动物心血管系统内可以被快速清除，但在心血管以外的组织可与病原识别受体TLR4结合，并且模拟组织损伤和危险信号，建立对免疫系统的高效刺激。
（2）卟啉色素与生物油脂、生物多糖或其他生物相容性良好的物质组合，能够促进抗原在注射部位的吸收、储存、缓释、递呈，延长抗原对淋巴组织的刺激。
（3）卟啉色素来源丰富，也是动物和人体的自身成分，体内代谢途径清楚，不存在安全性方面的不确定性，适合作为动物尤其是人用免疫佐剂。
本发明的第二个目的是通过如下技术手段来实现的：卟啉色素作为疫苗的用途。
本发明可以将卟啉色素作为免疫增强成分之一与免疫预防或免疫治疗的抗原混合制备疫苗。
本发明中，卟啉色素在免疫佐剂和疫苗中的使用浓度为毫摩尔浓度量级（推荐0.1-10mM），可根据不同的动物（包括人体）和动物体质进行调整。
本发明中，卟啉色素在使用中的剂量为每克体重微克量级（推荐0.1-1μg/g），可根据不同的动物（包括人体）和动物体质进行调整。
与现有技术相比，本发明的免疫佐剂具有如下优点：
(1)作用机理明确：在动物心血管系统内可以被快速清除，但在心血管以外的组织可与病原识别受体TLR4结合，并且模拟组织损伤和危险信号，建立对免疫系统的高效刺激；而目前大多数免疫佐剂的作用机理不太清楚；
(2)安全可靠：卟啉色素是动物和人体的自身成分，体内代谢途径清楚，不存在安全性方面的不确定性。
(3)免疫增强效果显著：本发明的免疫佐剂对产生抗体的增强效果显著，可以达到完全弗氏佐剂的水平。
附图说明
图1是卟啉环的化学结构式；
图2是铁卟啉的化学结构式；
图3是钴卟啉的化学结构式；
图4是实施例1中铁卟啉色素佐剂显著增强SD大鼠血清中抗牛血清白蛋白（BSA）IgG抗体的水平；
－◇－：阳性对照组，CFA(完全弗氏佐剂)+BSA，
－△－：实验组1，PC(卵磷脂)+FePP+BSA，
－○－：实验组2，FePP+BSA，
－□－：阴性对照组，BSA；
图5是实施例2中钴卟啉色素佐剂显著增强BALB/c小鼠血清中抗BSAIgG抗体的水平；
图6是实施例3中，含铁卟啉色素成分的乙肝疫苗对BALB/c小鼠的免疫效果。
具体实施方式
本发明的核心思想是将卟啉色素高效刺激免疫系统的特性（与病原识别受体TLR4结合，模拟组织损伤和危险信号）应用于制备免疫预防和免疫治疗药剂，具体涉及卟啉色素单独作为免疫佐剂、卟啉色素与其他辅助成分组合作为免疫佐剂、卟啉色素作为疫苗的成分三个方面；而卟啉色素是含卟啉环的一系列化合物，具有高度可变性，具体表现在（1）环的中心可以螯合不同的二价或三价金属离子和（2）环的2、3、7、8、12、13、17、18位可以连接不同的侧链基团，如烷烃、烯烃、醇和羧酸等，它们都可应用于本发明的上述三个方面；因此，本实施例不可能一一枚举它们的具体应用方式，仅以铁卟啉（Fe-PorphyrinIX，缩写FePP，结构如附图2所示）、钴卟啉（Co-PorphyrinIX，缩写CoPP，结构如图3所示）以及它们与卵磷脂组合来示例卟啉色素在上述三个方面的应用。
实施例1
测试铁卟啉、卵磷脂与铁卟啉组合对弱抗原牛血清白蛋白的免疫增强作用。
铁卟啉（FePP）：又称血红素，分子式为C34H32FeN4O4，分子质量为616.49，结构如附图2所示；本实施例中采用如下方法制备获得，当然，也可以采用市售的产品。
（1）收集动物或人抗凝血，4000转/分离心，收集红细胞，用0.1M的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）洗涤红细胞3次。
（2）向洗净的红细胞中加等体积去离子水，完全溶血后加入5倍体积的氯仿混匀，静置10分钟左右，在50mL离心管上层形成饼状血红蛋白沉淀（下层透亮的氯仿溶液可回收再利用）。
（3）取出饼状血红蛋白沉淀，加入5倍体积的丙酮，用稀盐酸调pH至3.0以下（以pH试纸检测），搅拌10分钟，血红蛋白中的FePP与珠蛋白分离，溶于酸性丙酮中，而珠蛋白则变性沉淀，4000转/分离心5分钟，取上清。
（4）向上清中滴加1M的NaOH调pH至中性，析出绿色沉淀，离心，收集沉淀，即得到FePP粗品。
（5）为获得较纯的FePP，利用FePP易溶于弱碱性溶液，珠蛋白不溶于其中的特性，用0.1M的NaOH溶解FePP粗品，离心后弃沉淀取上清。
（6）向上清中滴加1M的HCl调pH至酸性，析出大量沉淀，离心，水洗沉淀3次至中性，干燥，可获得纯度≥95%的FePP（铁为三价）。
（牛血清蛋白）溶液
用0.1M的磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）溶解BSA粉末（购自购自Sigma公司，纯度≥98%），配成15μM（1mg/mL）的BSA溶液，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
先用少量0.1M的NaOH溶解FePP粉末，再加PBS配成2mM（1.233mg/mL）的FePP溶液，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
将15μM的BSA溶液与等体积的2mMFePP溶液混合，使BSA、FePP终浓度分别为7.5μM和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
（1）30mg卵磷脂（PC）于玻璃试管中加2mL氯仿，涡旋振荡直至全部溶解。
（2）在通风柜中边用氮气吹扫边旋转试管，使PC在管壁形成透明均一的薄膜，继续吹扫直至氯仿彻底挥发干净。
（3）向试管中加入过滤除菌的FePP+BSA溶液1mL，缓慢吹打，将薄膜从管壁上冲洗下来。
（4）试管在水浴超声仪上超声3mins，50%的功率，工作10s，停10s，直至形成乳白色悬液，显微镜观察到脂质体大小基本均一，BSA、FePP终浓度分别为7.5μM和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
完全弗氏佐剂（CFA）购自Sigma公司，按使用说明将1份过滤除菌的15μMBSA溶液和1份CFA混合，涡旋振荡乳化至均一的悬浊液，BSA的终浓度为7.5μM，储存于4℃冰箱中备用。
动物实验
（1）32只6周龄（雄性，体重200g左右）SPF级SD大鼠分为4组，每组8只：
阳性对照组，CFA+BSA
实验组1，PC+FePP+BSA
实验组2，FePP+BSA
阴性对照组，BSA
（2）免疫注射2天前，采血检测血清中抗BSAIgG抗体，以此作为本底水平。
（3）免疫注射前，所有注射制剂在无菌条件下过滤除菌。
（4）在无菌环境下采用腹腔注射免疫，每只大鼠注射剂量为200μL，所有注射液含BSA1.5微摩尔（100μg），存在FePP的注射液含FePP0.2毫摩尔（123.3μg）。
（5）免疫后每隔7天采血检测血清中抗BSAIgG抗体。
抗体检测
使用酶联免疫法（ELISA），每个样品均为3个复孔。
（1）包埋BSA抗原：用包埋液配制成10μg/mL的BSA溶液作为抗原，每孔50μl抗原溶液加入酶标板中，用保鲜膜封好后于水平摇床中平缓摇动10分钟，使抗原溶液均匀覆盖酶标板底部，再置于4℃冰箱中过夜。
（2）封闭：取出酶标板，甩干包埋液。用每孔中加100μL体积的PBS洗板一次，5min，每孔加入100μL体积的明胶封闭液，保鲜膜封好置于水平摇床中平缓摇动，室温孵育2小时左右。
（3）一抗孵育：取出封闭后的酶标板，用PBS洗板一次，用一抗稀释液（1×明胶溶液）将大鼠血清稀释100倍，每孔50μL加入酶标板中（每份样品做一个复孔），水平摇床中室温孵育1小时。
（4）洗涤：一抗孵育后，甩干酶标板，每孔加入100μL体积的含0.05%Tween-20的PBST溶液，于水平摇床中平缓摇动5分钟，重复洗涤3次。
（5）二抗孵育：用二抗稀释液（1×明胶溶液）稀释二抗HRP-Anti-RatIgGH&L，比例为1/10000。每孔中加50μL体积的二抗溶液，保鲜膜封好后于水平摇床中孵育1小时。
（6）洗涤：二抗孵育后，甩干酶标板，每孔加入100μL体积的含0.05%Tween-20的PBST溶液，于水平摇床中平缓摇动5分钟，重复洗涤3次。
（7）显色：使用前应将TMB显色液恢复至置室温才能使用，用ddH2O以1：1稀释原液，每孔中加50μL体积的TMB显色液，用锡箔纸覆盖避光，于水平摇床中平缓摇动，显色10分钟，观察到各孔中显现深浅不一的蓝色即可终止。
（8）终止：每孔加50μL的0.5MH2SO4溶液终止反应，此时酶标板中溶液颜色会由浅蓝色变成黄色。
（9）读取OD值：检测波长设为450nm，用空白孔（未加一抗，其它实验条件一致）调零，于MK1酶标仪中读取OD450值，记录数据，免疫结果如图4中所示，其中横坐标是免疫后采血时间，纵坐标是检测SD大鼠血清中抗BSAIgG抗体的ELISA吸光度值。
免疫结果
如图4所示，免疫两周后抗体水平达到峰值，然后缓慢下降，铁卟啉（FePP）的佐剂效果非常明显，卵磷脂/铁卟啉组合的佐剂效果达到完全弗氏佐剂（已知最强的免疫佐剂）的水平。
实施例2
测试钴卟啉、卵磷脂与钴卟啉组合对弱抗原牛血清白蛋白的免疫增强作用。
钴卟啉（CoPP）：分子式为C34H32CoN4O4，分子质量为619.58，结构如附图3所示，本实施例CoPP购自Sigma公司，纯度≥98%。
溶液
用0.1M的磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）溶解BSA粉末（购自Sigma公司，纯度≥98%），配成15μM（1mg/mL）的BSA溶液，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
先用少量0.1M的NaOH溶解CoPP粉末，再加PBS配成2mM（1.239mg/mL）的CoPP溶液，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
将15μM的BSA溶液与等体积的2mMCoPP溶液混合，使BSA、CoPP终浓度分别为7.5μM和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
（1）30mg卵磷脂（PC）于玻璃试管中加2mL氯仿，涡旋振荡直至全部溶解。
（2）在通风柜中边用氮气吹扫边旋转试管，使PC在管壁形成透明均一的薄膜，继续吹扫直至氯仿彻底挥发干净。
（3）向试管中加入过滤除菌的CoPP+BSA溶液1mL，缓慢吹打，将薄膜从管壁上冲洗下来。
（4）试管在水浴超声仪上超声3mins，50%的功率，工作10s，停10s，直至形成乳白色悬液，显微镜观察到脂质体大小基本均一，BSA、CoPP终浓度分别为7.5μM和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
完全弗氏佐剂（CFA）购自Sigma公司，按使用说明将1份过滤除菌的15μMBSA溶液和1份CFA混合，涡旋振荡乳化至均一的悬浊液，BSA的终浓度为7.5μM，储存于4℃冰箱中备用。
动物实验
（1）32只6周龄（雌性，体重20g左右）SPF级BALB/c小鼠分成4组，每组8只：
阳性对照组，CFA+BSA
实验组1，PC+CoPP+BSA
实验组2，CoPP+BSA
阴性对照组，BSA
（2）免疫注射前，所有注射制剂在无菌条件下过滤除菌。
（3）在无菌环境下采用皮下注射免疫，每只小鼠注射剂量为20μL，所有注射液含BSA0.15微摩尔（10μg），存在CoPP的注射液含CoPP0.02毫摩尔（12.4μg）。
（4）初次免疫两周后增强免疫一次，再过两周后处死小鼠采血检测血清中抗BSAIgG抗体
抗体检测
使用酶联免疫法（ELISA），每个样品均为3个复孔，具体操作同实施例1，但第二抗体由HRP-Anti-RatIgGH&L替换为HRP-Anti-MouseIgGH&L，免疫结果如图5中所示，横坐标中表示阳性对照组：CFA(完全弗氏佐剂)+BSA；实验组1：PC(卵磷脂)+CoPP+BSA；实验组2：CoPP+BSA；阴性对照组：BSA；纵坐标为检测BALB/c小鼠血清中抗BSAIgG抗体的ELISA吸光度值。
免疫结果
如图5所示，与铁卟啉在大鼠实验中的结果类似，钴卟啉在小鼠中的佐剂效果非常明显，并且卵磷脂/钴卟啉组合的佐剂效果达到完全弗氏佐剂的水平。
实施例3
测试含铁卟啉色素成分的乙肝疫苗对BALB/c小鼠的免疫效果。
铁卟啉（FePP）
按实施例1相同的方法制备，纯度≥95%，当然，也可以采用市售的产品。
（乙肝表面抗原）溶液
上海叶民生物技术有限公司产品，纯度≥95%，浓度为2.5mg/mL.
FePP溶液
先用少量0.1M的NaOH溶解FePP粉末，再加PBS配成2mM（1.233mg/mL）的FePP溶液，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
取适量HBsAg原液稀释5倍后与等体积的2mMFePP溶液混合，HBsAg、FePP终浓度分别为0.25mg/mL和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
（1）30mg卵磷脂（PC）于玻璃试管中加2mL氯仿，涡旋振荡直至全部溶解。
（2）在通风柜中边用氮气吹扫边旋转试管，使PC在管壁形成透明均一的薄膜，继续吹扫直至氯仿彻底挥发干净。
（3）向试管中加入过滤除菌的FePP+HBsAg溶液1mL，缓慢吹打，将薄膜从管壁上冲洗下来。
（4）试管在水浴超声仪上超声3mins，50%的功率，工作10s，停10s，直至形成乳白色悬液，显微镜观察到脂质体大小基本均一，HBsAg、FePP终浓度分别为0.25mg/mL和1mM，储存于4℃冰箱中备用。
3溶液
按市售乙肝（HBV）疫苗配方，由浓度为40mg/mL的Al(OH)3胶体溶液与稀释5倍的HBsAg原液等体积混合而成，HBsAg终浓度为0.25mg/mL，储存于4℃冰箱中备用。
溶液
完全弗氏佐剂（CFA）购自Sigma公司，按使用说明将1份CFA与1份稀释5倍的HBsAg原液混合，涡旋振荡乳化至均一的悬浊液，HBsAg的终浓度为0.25mg/mL，储存于4℃冰箱中备用。
动物实验
（1）40只6周龄（雌性，体重20g左右）SPF级BALB/c小鼠分为5组，每组8只：
阳性对照组1：CFA+BSA，
阳性对照组2：Al(OH)3+HBsAg（市售HBV疫苗），
实验组1：PC+FePP+HBsAg（含FePP和PC的HBV疫苗），
实验组2：FePP+HBsAg（含FePP的HBV疫苗），
阴性对照组，HBsAg；
（2）免疫注射前，所有注射制剂在无菌条件下过滤除菌；
（3）在无菌环境下采用皮下注射免疫，每只小鼠注射剂量为20μL，所有注射液含HBsAg5μg，存在FePP的注射液含FePP0.02毫摩尔（12.4μg）；
（4）初次免疫两周后增强免疫一次，再过两周后处死小鼠采血检测血清中抗HBsAgIgG抗体；
抗体检测
使用酶联免疫法（ELISA），每个样品均为3个复孔，具体操作同实施例1，但包埋抗原由BSA替换为HBsAg抗原，第二抗体由HRP-Anti-RatIgGH&L替换为HRP-Anti-MouseIgGH&L，检测结果见图6中所示，横坐标：阳性对照组1：CFA(完全弗氏佐剂)+HBsAg（乙肝表面抗原）；阳性对照组2：Al(OH)3(铝盐佐剂)+HBsAg；实验组1：PC(卵磷脂)+FePP+HBsAg；实验组2：FePP+HBsAg；
阴性对照组，HBsAg；纵坐标：检测BALB/c小鼠血清中抗BSAIgG抗体的ELISA吸光度值。
免疫结果
如图6所示，铁卟啉（FePP）对乙肝表面抗原的免疫增强效果优于Al(OH)3佐剂，尤其卵磷脂（PC）/铁卟啉组合对乙肝表面抗原的佐剂效果可以达到完全弗氏佐剂的水平，说明卟啉色素在疫苗制备具有优秀的实用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。