专利名称：用于hla-a2阳性人群的来自磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (gpc3)的癌症排斥抗原肽以及含有 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及可有效用作肝细胞癌、恶性黑色素瘤(黑素瘤)等高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3(GPC3)的癌症的疫苗的新型肽，以及含有该肽的肿瘤治疗和预防的药物。
背景技术：
原发性肝细胞癌是在世界各国发生频率很高的恶性疾病之一。随着乙型和丙型肝炎的世界性流行，亚洲或欧洲各国的肝细胞癌发生率急剧升高，考虑到由肝炎病毒感染至发病的较长的潜伏期，可以预想今后的五十年内该倾向会持续升高。病状发展的肝细胞癌预后不良，迫切需要开发新的治疗方案。另一方面，随着近年来分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已经了解到:细胞毒性(杀伤)T细胞和辅助性T细胞可识别经HLA分子呈递于癌细胞或抗原呈递细胞的表面、并在癌细胞中特异性高表达的蛋白质分解得到的肽，显示破坏癌细胞的免疫反应。并且，对很多刺激攻击上述癌症的免疫反应的肿瘤抗原蛋白、以及来自该肿瘤抗原蛋白的肽都进行了鉴定，抗原特异性的肿瘤免疫疗法的临床应用得到了进展。HLA-1类分子在身体的所有有核细胞的表面表达，与肽结合，在细胞表面表达，其中，所述肽是在细胞质或核中产生的蛋白质在细胞内分解得到的。在正常的细胞表面，来自正常的自身蛋白的肽与HLA-1类分子结合，免疫系统的T细胞并不对该分子进行识别及破坏。另一方面，在癌细胞形成癌的过程中大量表达在正常细胞中几乎不表达或者很少表达的蛋白质。上述在癌细胞中特异性高表达的蛋白质在体内分解成的肽与HLA-1类分子结合，在癌细胞的表面表达，则杀伤T细胞识别该分子，只破坏癌细胞。将上述癌症特异性抗原或肽给予个体，不会对正常细胞产生危害，即可破坏癌细胞并抑制癌的增殖。将其称为使用癌症特异性抗原的癌症免疫疗法。另外，HLA-1I类分子主要在抗原呈递细胞的表面表达，其与肽结合，在细胞表面表达，其中所述肽是抗原呈递细胞从细胞外摄入、在细胞内分解的来自癌症特异性抗原的肽。识别该分子的辅助性T细胞被激活，生成各种可激活其它免疫系统细胞的细胞因子，由此诱导或增强对肿瘤的免疫反应。因此，如果能够开发以在这些癌症中特异性高表达的抗原为靶的免疫疗法，则可能获得不对自身正常器官产生伤害、只有效排除癌症的治疗方法。还有望进行其它的治疗，成为对任何晚期癌症患者都可使用的治疗方法。另外，对于发生上述癌症的风险高的人群预先以疫苗的形式给予癌症特异性抗原和肽，可以预防癌症的发生。有报道称， 甲胎蛋白(AFP)是正常组织中只在胚胎期表达，但在很多肝细胞癌中其表达重新被激活，即，是所谓的癌胚胎性蛋白质。另外，在小鼠和人的T细胞中存在识别通过MHC-1类分子呈递的、来自AFP的肽表位物质。虽然胚胎在发育阶段暴露于在血浆中高水平存在的AFP中，但成熟T细胞不会获得对AFP的完全免疫耐受，AFP特异性T细胞可在末梢血中检测出。即，癌胚胎性蛋白可成为免疫治疗的靶。虽然肝细胞癌的治疗方法有多种，但与其它癌症相比，其预后差，是难治性癌症的一种。其原因在于:在肝细胞癌的基础上有肝硬化，患者的肝功能恶化；以及即使治疗了一处癌症，也会由其它的器官生成癌的特征，人们要求尽快开发新型的治疗方案。如果可以开发以在肝细胞癌中特异性高表达的抗原为靶的免疫疗法，则可以得到不伤及自身的正常器官、只有效地排除癌症的治疗方法。有望获得对于任何晚期癌症患者、进一步说对于肝功能过于恶化、无法进行其它治疗的患者均可使用的治疗方法。目前在日本，据称肝细胞癌的后备人群一丙型肝炎感染者有200万人以上。对于这些感染者的肝细胞癌的预防，可以采用上述免疫疗法。黑素瘤是被称为恶性黑色素瘤的皮肤癌的一种。皮肤癌有多种，它是恶性度最高的皮肤癌，非常可怕。构成皮肤的细胞中有生成黑素的细胞，将其称为色素细胞(黑素细胞)，该细胞癌化成黑素瘤。日本黑素瘤发生人数是每10万人口中约有1.5-2人左右，由此推测每年有1500人-2000人左右发病。在欧美每10万人口中有10多人或以上发病,在澳大利亚每10万人口中有20多人或以上的发病，可以说是世界第一的发病人数。仅此，欧美或澳大利亚的人们对黑素瘤有很大的关心程度，非常注意黑素瘤的发生。另外，由于环境破坏导致大气中臭氧层减少，暴露在紫外线中的机会增加，因此，特别是在白种人中发生频率增加。在日本，黑素瘤的发生每年有增加倾向。最近的调查中，日本的黑色素瘤年死亡人数增加至450人左右。黑素瘤在任何年龄的人群中均发生，特别是40岁或以上发生增多，在60岁-70岁左右最多。儿童的发生非常少，但是并不是不发生，最近在20-30岁左右年轻人中的发生有增加倾向。在性别方面，并没有某一方多的倾向，在男女人群均有发生。在日本，容易发生黑素瘤的部位最多的是在足底(脚底面)，约占三成左右。在足或手指尖的部分较多，这是日本人的特征。除此之外，与欧美人同样，在身体、手、足、面部、头等任何皮肤上都有发生。本发明人首先利用cDNA微阵列分析，对包括23，040种人类基因的全基因组的基因表达分析，对20例原发性肝细胞癌和包括胚胎期的各种正常器官中这些基因的表达概况进行了研究，发现磷脂酰肌醇蛋白`聚糖3(GPC3)在胚胎期的肝脏、肾脏、肺中表达，在成人的正常器官中除胎盘以外几乎不表达，而在很多肝细胞癌中高表达。并且报道，该GPC3为分泌蛋白，使用ELISA法，可以在40%的肝细胞癌症患者的血清中检测出GPC3,这可用作肝细胞癌的新的肿瘤标志(Nakatsura, T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.306, 16-25 (2003))。还报道了，GPC3也在黑素瘤患者的血清中检测出，可用作黑素瘤的肿瘤标志(Nakatsura, T.等人，Clin.Cancer Res.10:6612-6621(2004))。本发明人已经鉴定出在以HLA-A24阳性肝细胞癌或黑素瘤患者为对象的免疫疗法中有用的、与HLA-A24结合并呈递在人杀伤T细胞上的GPC3肽。并在使用表达小鼠Kd分子的BALB/c小鼠的动物实验中证明使用该肽有效，并已报道(国际申请编号PCT/JP2004/016374 ;国际申请日2004年10月28日)，其中所述Kd分子与一种肽结合，该肽与同HLA-A24结合的肽具有同样的结构。GPC3在正常器官中只在胎盘和胚胎期的肝脏中表达，因此，通过小鼠实验可确认:进行以GPC3为靶的免疫疗法，可抑制肿瘤的增殖但不会发生自身免疫疾病等有害状况。
本发明人还对于目前为止作为肿瘤排斥抗原的磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3(GPC3)，对于主要通过HLA-A24向杀伤T细胞呈递的肽进行了鉴定(国际申请编号PCT/JP03/10459 ；国际申请日2003年8月19日)。但是，如果只是通过HLA-A24呈递在杀伤T细胞上的肽，日本人群中只有60%具有HLA-A24，因此无法作为肽疫苗给予对象。并且，如果可以鉴定出日本人群的40%所具有的阳性HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，将两者合并则可以以日本人群的约85%作为对象，不仅如此，HLA-A2在欧美白种人中阳性的频率高，因此也可应用于很多欧美白种人。因此，通过HLA-A2向杀伤T细胞呈递的肽的鉴定成为重要课题。特别是黑素瘤在欧美白种人中较多，是可有效应用免疫疗法进行治疗的癌症，并且肝细胞癌在欧美也急速增加，因此可以推定:使用HLA-A2结合性GPC3肽的免疫疗法可以适应很多患者。
发明内容
本发明要解决的课题在于:鉴定通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，由此提供可以进行以日本人中高表达GPC3的各种癌症患者的约40%为对象的免疫疗法的方法。本发明人首先根据cDNA微阵列分析鉴定了人肝细胞癌中特异性过量表达的新型癌胚胎性蛋白一磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3 (GPC3)，又在肝细胞癌患者血清中检测出可溶性GPC3蛋白，明确了 GPC3可成为肝细胞癌的新的肿瘤标志。本发明人发现GPC3在小鼠黑素瘤细胞株B16中表达，GPC3在黑素瘤中与肝细胞癌中同样高表达，从而考虑其是否可以作为有用的肿瘤标志，在为了确认该推测而进行的实验中发现，GPC3在黑素瘤中是目前尚未被确认的可早期诊断的肿瘤标志。本发明人通过在体外将人CD8阳性杀伤T细胞与通过脉冲导入了具有HLA-A2结合基序的人GPC3肽的、来自人.末梢血单核细胞的树状细胞共培养，进行刺激，诱导GPC3肽特异性杀伤T细胞。判断各GPC3肽是否诱导了特异性的杀伤T细胞，是使用ELISP0T法，对杀伤T细胞所生成的Y -干扰素(IFN- Y )进行检测，该T细胞可识别通过HLA-A2呈递的肽并被激活，由此鉴定出可作为可应用于免疫治疗的候选靶抗原的新型的GPC3肽。S卩，本发明提供以下内容。(I)以下的任意一种肽:(A)SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨基酸序列组成的肽；(B)在SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨基酸序列中有I个或2个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列组成的、具有杀伤T细胞诱导能力的肽。(2)癌症免疫诱导剂，该癌症免疫诱导剂含有至少一种或以上(I)的肽。(3)肿瘤的治疗和/或预防的药物，该药物含有至少一种或以上⑴的肽。(4)用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有⑴的肽，其中该抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高。(5)用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有编码以下任意一项肽的基因，其中该抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高:(A)SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨基酸序列组成的肽；(B)在SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨 基酸序列中有I个或2个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列组成的、具有杀伤T细胞诱导能力的肽。(6)用于诱导肿瘤反应性T细胞的药物，该药物含有(I)的肽。
(7)抗体，该抗体是抗⑴的肽的抗体。(8)辅助性T细胞、杀伤T细胞或含有它们的免疫细胞集团，上述细胞或免疫细胞集团是使用(I)的肽诱导的。(9)抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞呈递HLA分子和权利要求1的肽的复合物。(10) (9)的抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞由(4)或(5)的药物诱导。实施发明的最佳方式(I)本发明的肽、以及含有该肽的癌症免疫诱导剂本发明的肽可是下述任意一种肽:(A)SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨基酸序列组成的肽；(B)在SEQ ID N0.1-3中任一项所示的氨基酸序列中有I个或2个氨基酸置换或附加的、具有杀伤T细胞诱导能力的肽。本说明书中所述的具有杀伤T细胞的诱导能力的肽是指具有刺激杀伤T细胞(杀伤T细胞/CTL)的杀伤T细胞诱导活性的肽。本发明的肽的获得、制备方法并没有特别限定，可以是化学合成的蛋白质，也可以是通过基因重组技术制备的重组蛋白。获得化学合成肽时，例如可按照Fmoc法(芴甲氧基羰基法)，tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成方法合成 本发明的肽。还可利用各种市售的肽合成仪器合成本发明的肽。将本发明的肽以重组蛋白的形式生产时，可以获得具有编码该肽的碱基序列的DNA或其突变体或同源体，将其导入适当的表达系中来制备本发明的肽。表达载体只要是可在宿主细胞中自主复制，或者可以整合到宿主细胞的染色体中即可，还可使用在可使编码肽的基因表达的位置上含有启动子的载体。具有编码本发明的肽的基因的转化体可通过将上述表达载体导入宿主中制备。宿主可以是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞中任意一项。表达载体向宿主的导入可根据各宿主的不同而通过公知的方法进行。 本发明中，培养上述制备的转化体，使本发明的肽在培养物中生成并积累，由该培养物采集本发明的肽，由此可分离重组肽。转化体为大肠杆菌等原核生物、酵母菌等真核生物时，培养这些微生物的培养基只要是含有该微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等并可有效地进行转化体培养的培养基即可，可以是天然培养基、合成培养基的任何形式。培养条件也可以在培养该微生物时通常所采用的条件下进行。培养后，为了从转化体的培养物中分离纯化本发明的肽，可采用通常的肽的分离、纯化方法。含有在SEQ ID N0.1_3中任一项所示的氨基酸序列中有一个或两个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列的肽，可根据编码SEQ ID N0.1-3中任一项的氨基酸序列的DNA序列的碱基序列信息，由本领域技术人员适当制备或获得。S卩，编码在SEQ IDN0.1-3中任一项所示的氨基酸序列中有一个或两个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列组成的、具有杀伤T细胞诱导能力的肽的基因可通过化学合成、基因工程学方法或诱变等本领域技术人员已知的任意方法制备。例如，作为基因工程方法之一的位点专一诱变法是可向特定的位置上导入特定突变的方法，其可应用于本发明，可按照MolecularCloning:A laboratory Mannual，andEd.，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY.，1989 (以下简称为分子克隆第 2 版)、Current Protocols in MolecularBiology, Supplementl-38, John Wiley&Sons (1987-1997)(以下简称为分子生物学实验室指南)等记载的方法进行。后述实施例所述，上述本发明的肽如可以诱导对癌症的免疫。因此，本发明可提供含有本发明的肽的癌症免疫诱导剂。本发明的癌症免疫诱导剂可以体外或体内、优选体外使用，可诱导辅助性T细胞、杀伤T细胞或含有它们的免疫细胞集团，由此可以获得对癌症的免疫。(2)本发明的抗体本发明涉及以上述本发明的肽的部分或全部作为表位(抗原)进行识别的抗体，以及使用该蛋白质或肽进行体外刺激来诱导的杀伤T细胞。通常，杀伤T细胞显示比抗体更强的抗肿瘤活性。本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，其制备可按照常规方法进行。例如，多克隆抗体可以如下获得:以本发明的肽作为抗原来免疫致敏哺乳动物或鸟类，从该哺乳动物或鸟类采集血液，由采集的血液中分离、纯化抗体。例如可以免疫小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、牛等哺乳动物或鸟类。免疫致敏的方法是本领域技术人员所公知的，例如可以将抗原以例如7-30天的间隔给予2-3次。给予量每次例如可以是约0.05-2mg抗原左右。给予途径没有特别限定，可以适当选择皮下给予、皮内给予、腹膜腔内给予、静脉内给予、肌肉内给予等。抗原可溶解于适当的缓冲液、例如含有完全弗氏佐剂或氢氧化铝等通常使用的佐剂的适当的缓冲液中使用。将免疫致敏的哺乳动 物或鸟类饲养一段时间，如果抗体滴度升高，则可以用例如100 μ g-ΙΟΟΟμ g的抗原进行追加免疫。最后给予1-2个月后,从免疫致敏的哺乳动物或鸟类中采集血液，将该血液例如通过离心、使用硫酸铵或聚乙二醇的沉淀、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和层析等色谱等的常规方法进行分离纯化，由此可以获得识别本发明的肽的多克隆抗体作为多克隆抗血清。单克隆抗体可以制备杂交瘤获得。例如通过抗体生成细胞和骨髓瘤细胞株的细胞融合获得杂交瘤。生成本发明的单克隆抗体的杂交瘤可通过以下细胞融合方法获得。抗体生成细胞使用由被免疫的动物得到的脾细胞、淋巴结细胞、B淋巴细胞等。抗原使用本发明的肽。免疫动物可使用小鼠、大鼠等，可按照常规方法将抗原给予这些动物。例如将完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂等佐剂与作为抗原的本发明的肽的混悬液或乳液多次给予动物的静脉、皮下、皮内、腹腔内等，由此免疫动物。由被免疫的动物获得作为抗体生成细胞，例如脾细胞，可以按照公知的方法(G.Kohler等人.，Nature, 256495(1975))将其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。细胞融合所使用的骨髓瘤细胞株例如有小鼠的P3X63Ag8、P3Ul株、Sp2/0株等。进行细胞融合时，可使用聚乙二醇、仙台病毒等融合促进剂，细胞融合后进行杂交瘤选择时，可按照常规方法使用次黄嘌呤 氨基蝶呤.胸腺嘧啶核苷(HAT)培养基。由细胞融合得到的杂交瘤通过极限稀释法进行克隆。还可根据需要通过使用本发明的肽的酶联免疫测定法进行筛选，由此可以获得生产特异性识别本发明肽的单克隆抗体的细胞株。
从上述得到的杂交瘤中制备目标单克隆抗体时，可通过通常的细胞培养法或腹水形成法培养该杂交瘤，由培养上清或腹水纯化该单克隆抗体。由培养上清或腹水纯化单克隆抗体可按照常规方法进行。例如可将硫酸铵分组、凝胶过滤、离子交换色谱、亲和层析等适当组合使用。上述抗体的片段也包含在本发明的范围内。抗体的片段有F (ab’)2片段、Fab’片段等。(3)辅助性T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞集团本发明还涉及通过使用本发明的肽进行体外刺激而诱导的辅助性T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞集团。例如，使用本发明的肽体外刺激末梢血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，则可诱导肿瘤反应性激活T细胞，该激活T细胞可有效用于过继免疫细胞疗法。通过使本发明的肽在强力的抗原呈递细胞——树状细胞中体内或体外表达，然后给予该抗原表达树状细胞，则可以进行免疫诱导。优选使用本发明的肽和免疫激活剂，通过体外刺激，诱导辅助性T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞集团。这里所使用的免疫激活剂有细胞生长因子或细胞因子等。通过将上述得到的辅助性T细胞、杀伤T细胞或含有它们的免疫细胞集团转移到体内，可以抑制肿瘤，预防和/或治疗癌症。通过使用本发明的肽，如上所述，可以制备可抑制上述肿瘤的辅助性T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞集团。因此，本发明可以提供含有本发明的肽的细胞培养液。通过使用该细胞培养液，可以制备可抑制肿瘤的辅助性T细胞、杀伤T细胞、或包含它们的免疫细胞集团。并且根据本发明，还可以提供包含上述细胞培养液或细胞培养容器的、用于制备辅助性T细胞、杀伤T细胞或包含它们的免疫细胞集团的细胞培养试剂盒。(4)本发明的肿瘤·治疗和/或预防用的药物(癌症疫苗)本发明的肽可以诱导癌细胞特异性杀伤T细胞，因此有望用作癌症的治疗、预防齐U。例如，通过将编码本发明的肽的基因掺入适当的载体中、用该重组DNA转化的BCG菌的细菌，或者将编码本发明的肽的DNA掺入到基因组中得到的痘苗病毒可有效用作人癌症的治疗、预防用的活疫苗。癌症疫苗的给予量和给予方法与通常的接种或BCG疫苗相同。即，编码本发明的肽的DNA (可以直接或者以掺入到表达载体中的质粒DNA的形式)、含有该DNA的重组病毒或重组细菌直接或以分散于佐剂中的状态作为癌症疫苗给予包括人在内的哺乳动物。本发明的肽也同样可以以分散于佐剂中的状态、以癌症疫苗的形式给予。可在本发明中使用的佐剂有:弗氏不完全佐剂、BCG、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、月旨多糖(LPS)、明矾佐剂、二氧化硅佐剂等，从抗体的诱导能力等的关系考虑，优选使用弗氏不完全佐剂(IFA)。本说明书中所述的癌症的种类没有特别限定，具体例子有食道癌、乳癌、甲状腺癌、直肠癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤(黑素瘤)、恶性淋巴瘤、骨肉瘤、成嗜铬细胞瘤、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、脑瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、肾癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌或肉瘤等。本发明的肽作为T细胞的表位，可以诱导癌细胞特异性杀伤T细胞，因此可用作人癌症的预防、治疗药。本发明的抗体只要是可以抑制癌症抗原GPC3的活性的即可用作人癌症的预防、治疗药。实际的使用方法可以是将本发明的肽或抗体直接或者与药物可接受的载体和/或稀释剂一起，根据需要加入下述助剂，以注射剂的形式给予，还可以通过喷雾等方法由粘膜经过透皮吸收等给予。这里所述的载体例如是人血清白蛋白，稀释剂有PBS、蒸馏水等。给予量是成人每人例如以每次0.0lmg-1OOmg的范围给予本发明的肽或抗体，但并不限于该范围。制剂的形态没有特别限定，可以是冻干制剂，也可以加入糖等赋形剂制成颗粒。添加到本发明的药物中的用于提高肿瘤反应性T细胞诱导活性的助剂有胞壁酰二肽(MDP)，除此之外还有BCG菌等菌体成分、Nature, 344卷，873页(1990)记载ISC0M、J.1mmunol.148卷，1438页(1992)记载的阜苷系的QS-21、脂质体、氢氧化招等。还可以使用蘑菇多糖、裂裥菌素、溶血性链球菌制剂(E '> K一-一等免疫激活剂作为助剂。还可以使用增强IL-2、IL-4、IL-12、IL-U IL_6、TNF等T细胞的增殖、分化的细胞因子等，以及激活NKT细胞的α半乳糖神经酰胺或与Toll样受体结合并激活自然免疫系统的CpGJg多糖(LPS)等作为助剂。在试管内加入该抗原肽，在由患者采集的细胞或共有一部分HLA等位基因的其他人的(异体细胞)细胞中呈递抗原，然后给予患者血管内，在患者体内有效诱导杀伤T细胞。另外，向患者末梢血淋巴细胞中加入该肽，在试管内培养，在试管内诱导杀伤T细胞后再返回到患者血管内。这样细胞移植治疗已经作为癌症治疗方法得到实施，是本领域所熟知的方法。通过向体内注入本发明的肽，诱导激活杀伤T细胞，结果有望获得抗肿瘤效果。另外在体外用本发明的肽刺激淋巴细胞，则可诱导激活T细胞，将该激活的T细胞注入患部，可有效用于免疫细胞疗法。 通过以下的实施例进一步说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
实施例[实施例1](I)与HLA-A2显示结合性的GPC3肽的选择通过BIMAS系统检索人GPC3的氨基酸序列，选择4种与HLA-A2的推定结合力为20或以上的序列。
肽的位置_多肽的氨基酸序列一结合亲和性评分
GPC3 44- 52RLQPGLKWV879GPC3 144-152FVGEFFTDV828GPC3 155-163 YILGSDLNV 162
_GPC3 169-177__ELFDSLFPV_1055_[实施例2]通过HLA-A2结合性GPC3肽诱导人杀伤T细胞(I)采血由在熊本大学医学部消化器外科和国立癌症中心东病院进行治疗的HLA-A2阳性肝细胞癌患者获得知情同意书后，取得30ml血液样品，按照之前报道的方法(Nakatsura, T.等人，Eur.J.1mmunol.32，826-836 (2002)),利用 Ficoll-Conray 密度梯度离心法分离末梢血单核细胞。(2)由末梢血单核细胞分离⑶8阳性细胞和⑶14阳性细胞，以及诱导杀伤T细胞。采用之前报道的方法(Moni，M.等人，Clin.Cancer Res.10:6047-6057 (2004))，由分离出的末梢血单核细胞诱导杀伤T细胞。首先使用MACS，分离末梢血单核细胞中CD8阳性细胞和CD14阳性细胞，在GM-CSF(100ng/ml)和IL-4 (20ng/ml)存在下将CD14阳性细胞培养5天，分化诱导树状细胞，然后添加20ng/ml TNF- α，使其成熟，第7天再分别添加10 μ M GPC3肽，与⑶8阳性细胞共同培养。通过该来自自身⑶14阳性细胞的树状细胞每周反复进行3-4次抗原刺激，诱导肽特异性杀伤T细胞。诱导过程的培养基是每两天更换一半，以10U/ml的浓度添加IL-2。(3)通过ELISP0T法研究GPC3特异性杀伤T细胞活性通过ELISP0T法检测在这些诱导的杀伤T细胞中是否确实与GPC3特异性反应生成IFN- Y。IFN- Y的检测是使用ELISP0T人IFN- y ELI SPOT组(BD公司制备)进行。杀伤T细胞(效应细胞)与刺激细胞(靶)反应并生成IFN-Y，则可分别检测出红色的斑点。使用在HLA-A2阳性中不表达GPC3的亲株SK-H印-1细胞和导入了表达GPC3的基因的SK-H印-1/GPC3细胞作为靶细胞。首先，将抗人IFN-Y抗体铺于ELISP0T板(BD Bioscience制备)18小时。然后用10%FCS/RPMI封闭2小时。将效应细胞(100 μ I/孔)和靶细胞(ΙΟΟμΙ/孔)混合，在37°C下培养22小时。以效应/靶的比(E/T比)5:1进行实验。然后用灭菌水洗漆板，与生物素化抗人I FN- Y抗体反应2小时,再与链霉抗生物素-HRP反应I小时，用底物溶液检测IFN- Y阳性斑点。斑点的计数是使用MINERVA TECH公司的自动分析软件进行。结果，用GPC344-52、144-152、155-163肽诱导的杀伤T细胞中可见GPC3特异性杀伤T细胞活性差异，由GPC3169-177肽诱导的杀伤T细胞中则未见GPC3特异性杀伤T细胞活性(
图1和图2)。对代表性的用GPC3155-163肽诱导的杀伤T细胞的分析结果如图1所示。(4)通过细胞毒性实验研究杀伤T细胞的细胞毒性所诱导的杀伤T细胞的细胞毒性是以在HLA-A2阳性下不表达GPC3的亲株的SK-Hep-1细胞和导入表达GPC3的基因的SK-H印-1/GPC3细胞作为刺激细胞，通过细胞毒性实验进行研究。杀伤T细胞的细胞毒性通过Terra Scan VP的细胞毒性实验进行评价。首先，将靶细胞在37°C下用钙黄绿素AM(Calcein AM)染色液进行30分钟的荧光标记。将这些细胞在Coster Half Area96孔板上与杀伤T细胞共同培养，通过在不同时间检测荧光显色细胞来测定细胞毒的程度。分析是采用MINERVA TECH公司的荧光法，通过细胞毒实验计算处理软件CalCt-961进行。E/T的比以20:1进行实验。结果，在用GPC344-52、144-152、155-163肽诱导的杀伤T细胞中可见GPC3特异性细胞毒活性，由GPC3169-177肽诱导的杀伤T细胞中则未见GPC3特异性细胞毒活性(图2)。产业实用性以通过HLA-A24呈递的GPC3肽作为靶的癌症免疫疗法在小鼠的动物实验中可以确认其有效性，但是如果只是通过HLA-A24呈递于杀伤T细胞的肽，则只能以日本人的60%作为疫苗给予对象。本发明鉴定了通过HLA-A2呈递在杀伤T细胞上的肽，将两者相结合，则可以以日本人的85%作为疫苗给予对象。如果在使用通过HLA-A2呈递在杀伤T细胞上的肽进行的实验医疗中显示有效性，则对于欧美白种人的临床应用的可能性也提高。鉴定通过欧美白种人中阳性频率高的HLA-A2呈递在杀伤T细胞上的肽，由此不仅可应用于日本人肝细胞癌和黑素瘤患者的40%，还可应用于很多的欧美白种人。附图简述图1表示通过ELISP0T分析来检测被激活的、特异性识别GPC3肽的杀伤T细胞所生成的IFN-Y的代表性结果。用负载有GPC3 155-163肽的来自⑶14阳性单核细胞的树状细胞刺激肝细胞癌患者末梢血中的⑶8阳性细胞，诱导杀伤T细胞，以导入表达GPC3的基因的SK-1fep-1/GPC3细胞作为刺激细胞时(图右)，与以在HLA-A2阳性中不表达GPC3的亲株SK-Hep-1细胞作为刺激细胞时(图左)相比，上述杀伤T细胞的斑点数、斑点面积总和显著增大。由此判定GPC3 155-163肽是可诱导GPC3特异性杀伤T细胞的表位肽。图2表示ELISP0T分析和细胞毒性试验的结果。从来自HLA-A2阳性肝细胞癌患者的末梢血中筛选CD8阳性T细胞，用负载有各GPC3肽的来自单核细胞的树状细胞刺激，得到杀伤T细胞，通过ELISP0T测定，对于该杀伤T细胞是否与GPC3表达细胞特异性反应生成IFN- Y进行研究，通过细胞毒性试验研究是否特异性伤害GPC3表达细胞。使用在HLA-A2阳性中不表达GPC3的亲株SK-H印-1细胞和导入表达GPC3的基因的SK-H印-1/GPC3细胞作为靶细胞。结果，用GPC344-52、144-152、155-163肽诱导的杀伤T细胞GPC3特异性识别SK-Hep-1/GPC3细胞，生成IFN-Y，且显示高的细胞毒性，而GPC3169-177肽诱导的杀伤T细胞中不显示GPC3特异性杀伤T细胞活性。以上表明，GPC3 44-52、144-152、155-163肽是可诱导GPC3特异性杀伤T 胞的表位肽。
权利要求
1.以下㈧或⑶的任意一种肽: (A)肽，其具有SEQID N0.1或3所示的氨基酸序列； (B)肽，其具有在SEQID N0.1或3所示的氨基酸序列中有I个或2个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列、并具有细胞毒性(杀伤)T细胞诱导能力的肽。
2.癌症免疫诱导剂，该癌症免疫诱导剂含有至少一种权利要求1的肽。
3.肿瘤的治疗和/或预防的药物，该药物含有至少一种权利要求1的肽。
4.用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有权利要求1的肽，其中该抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高。
5.用于诱导抗原呈递细胞的药物，该药物含有编码以下以下(A)或(B)的任意一项肽的基因，其中抗原呈递细胞诱导肿瘤反应性T细胞的能力高: (A)肽，其具有SEQID N0.1或3所示的氨基酸序列肽； (B)肽，其具有在SEQID N0.1或3所示的氨基酸序列中有I个或2个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列、具有杀伤T细胞诱导能力的肽。
6.用于诱导肿瘤反应性T细胞的药物，该药物含有权利要求1的肽。
7.抗体，该抗体是抗权利要求1的肽的抗体。
8.辅助性T细胞、杀伤T细胞或含有它们的免疫细胞集团，上述细胞或免疫细胞集团是使用权利要求1的肽诱导的。
9.抗原呈递细胞 ，该抗原呈递细胞呈递由HLA分子和权利要求1的肽组成的复合物。
10.权利要求9的抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞由权利要求4或5的药物诱导。
全文摘要
本发明要解决的课题在于鉴定通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，由此提供可以进行以日本人中高表达GPC3的各种癌症患者的约40%为对象的免疫疗法的方法。即，本发明提供以下内容。以下的任意一种肽(A)SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基酸序列组成的肽；(B)在SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基酸序列中有1个或2个氨基酸置换或附加得到的氨基酸序列组成的、具有杀伤T细胞诱导能力的肽。
文档编号A61K48/00GK103242428SQ20131006428
公开日2013年8月14日 申请日期2006年8月8日 优先权日2005年8月9日
发明者西村泰治, 中面哲也, 小森宏之 申请人:肿瘤疗法.科学股份有限公司