专利名称：一种从光帽鳞伞中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从光帽鳞伞(Pholiota nameko,俗名:滑子菇)中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法。
背景技术：
近年来，蘑菇作为中药或功能性食品，在食品和医药行业备注关注。从蘑菇中分离获得的许多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物和免疫调节的作用。其中，有关多糖的研究最为广泛，然而，蘑菇中含量丰富的生物活性蛋白，包括凝集素，真菌免疫调节蛋白，核糖体失活蛋白，抗微生物蛋白，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和医药领域的应用上展现出巨大的潜能。光帽鳞伞(Pholiota nameko)属真菌门，担子菌纲,伞菌目，球盖燕科,鳞伞属。它是一种冬、春季发生的菌盖粘滑的木腐菌，因其菌盖表面有粘液而又被称为滑子菇，是世界上五大宗人工栽培的优质食用菌之一。光帽鳞伞(Pholiota nameko)具有滑、鲜、嫩、脆的特点，富含有益于人体健康的蛋白质、糖类、矿物元素(I丐、磷、铁)、维生素(维生素VB2、维生素C、烟酸)以及人体所必须的其他各种氨基酸等营养保健物质，是一种低热量的保健食品。据分析，每IOOg干菇含粗蛋白33.76g、纯蛋白15.13g、脂肪4.05g、总糖38.89g、纤维素14.23g、灰分8.99g。除食用价值外，也具有一定的药用价值。其子实体含丰富的多糖，能够提高机体的免疫力。目前，除了对光帽鳞伞(Pholiota nameko)生长特性，栽培技术的研究外，对其生物活性的研究主要集中在多糖上，而对其中含量丰富的生物活性蛋白研究尚浅。周蕊等(南京林业大学硕士学位论文2007 )从Pholiota nameko菌丝发酵液中分离纯化得到分子量为 55KDa的漆酶。Yasuko Kawamura-Konishi等(Biosc1.Biotechnol.Biochem., 71 (7): 1752-1760)从 Pholiota nameko 子实体中分离纯化得到酪氨酸蛋白酶，分子量约为 42KDa。Gu1-Ping Guan 等(Journal of Bioscience andBioengineering2011, 111 (6):641-645)从 Pholiota nameko 子实体中分离纯化得到丝氨酸蛋白酶，分子量约为19KDa。漆酶可用于降解木质素，酪氨酸蛋白酶主要用于环境治理包括含有酚类的废水和污染的土壤的处理。而本发明首次从Pholiota nameko中分离纯化得到一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白。
发明内容
本发明目的在于提供光帽鳞伞(Pholiota nameko)中的一种抗肿瘤蛋白及其制备方法，该蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用。本发明提供的从光帽鳞伞(Pholiota nameko)中提取的抗肿瘤蛋白，分子量为17KDa, N-端氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所不序列 Ala Gly Arg Thr Phe He Gly Tyr AsnGly，该抗肿瘤蛋白简称为 PNAP (Pholiota nameko Ant1-tumor protein)。本发明涉及的光帽鳞伞(Pholiota nameko)中的抗肿瘤蛋白是按照如下方法制备的:(I)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉,溶解于0.2 0.5M的NaCl溶液，2 6°C浸提8 16小时，5000"8000rpm离心2(T40min，收集上清液，即光帽鳞伞Pholiotanameko子实体粗提液；(2)向步骤(I)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为70 100%，2 6°C放置8 16小时，1000(T20000rpm离心l(T40min，收集沉淀，即光帽鱗伞Pholiota nameko蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用20 50mM、ρΗ6.(T9.0的PBS缓冲液溶解，然后在2 6°C、1飞倍重量的蒸馏水中透析8 16小时，反复3飞次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko )蛋白粗粉溶解于25 50mMMES、ρΗ5.0 6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用25 50mM MES、0.5 IM NaCl、ρΗ5.(Γ6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用 25 50mM MES、20(T500mM NaCl, ρΗ5.0 6.0 的 MES C
缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白。本发明中光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用，JC-1染色分析线粒体膜电位证明该蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡。本发明具有的优点和有益效果:
(I)本发明中光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白为天然提取物,具有良好的安全性；(2)本发明中抗肿瘤蛋白为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸及其编码基因提供了基础；(3)本发明中抗肿瘤蛋白具有良好的抗肿瘤效果；(4)本发明中抗肿瘤蛋白制备简单，成本低，适于大规模生产。
图1是本发明Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的离子交换层析图。图2是本发明Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的凝胶色谱层析图。图3是本发明Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的SDS-PAGE图。图4是本发明Pholiota nameko抗肿瘤蛋白对MCF7细胞生长的抑制作用。图5是本发明Pholiota nameko抗肿瘤蛋白对肿瘤细胞凋亡的诱导作用(A.未加抗肿瘤蛋白的MCF7细胞；B.511|1抗肿瘤蛋白处理的1 ^7细胞；C.10 μ M抗肿瘤蛋白处理的MCF7细胞；D.15 4] 抗肿瘤蛋白处理的]\077细胞)。
具体实施例下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1光帽鳞伞(Pholiota nameko)中抗肿瘤蛋白的制备(I)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉,溶解于0.5M的NaCl溶液，4°C浸提12小时，5000rpm离心20min,收集上清液，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液；
(2)向步骤(1)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为75%，4°C放置12小时，18000rpm离心40min，收集沉淀，即光帽鳞伞(Pholiotanameko )蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用50mM、pH8.0的PBS缓冲液溶解，然后在4°C、5倍重量的蒸馏水中透析12小时，反复3次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鱗伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉溶解于50mM MES、pH6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用50mM MES,0.8M NaCl、pH6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用50mM MES、500mM NaCl,pH6.0的MES C缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白，回收率约为0.05%。实施例2光帽鳞伞(Pholiota nameko)中抗肿瘤蛋白的制备(1)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉，溶解于0.2M的NaCl溶液，2°C浸提8小时,5000rpm离心40min,收集上清液，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液；(2)向步骤(I)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为70%，2°C放置8小时，IOOOOrpm离心40min，收集沉淀，即光帽鳞伞(Pholiotanameko )蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用20mM、pH9.0的PBS缓冲液溶解，然后在2°C、I倍重量的蒸馏水中透析16小时，反复5次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉溶解于25mM MES、pH5.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用25mM MES,0.5M NaCl、pH5.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用25mM MES、200mM NaCl,pH5.0的MES C缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白，回收率约为0.05%。实施例3光帽鳞伞(Pholiota nameko)中抗肿瘤蛋白的制备(1)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉，溶解于0.5M的NaCl溶液，6°C浸提16小时，8000rpm离心20min,收集上清液，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液；(2)向步骤(1)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为100%，6°C放置16小时，20000rpm离心l0min，收集沉淀，即光帽鳞伞(Pholiotanameko )蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用50mM、pH6.0的PBS缓冲液溶解，然后在6°C、5倍重量的蒸馏水中透析8小时，反复3次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鱗伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉溶解于50mM MES、pH6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用50mM MESUM NaCl、pH6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用50mM MES、500mM NaCl，pH6.0的MES C缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白，回收率约为0.05%。实施例4、本发明抗肿瘤蛋白的N-端氨基酸序列测定(I) SDS-PAGE电泳:15%胶浓度,加预染marker,上样20ug,上样量IOul ；(2)电泳结束后，将需要转膜的部分切下，水清洗2次，用转移缓冲液(CAPSbuffer:10mM CAPS, 10% 甲醇，pHll)平衡 5 分钟；(3)准备PVDF膜，剪成和胶一样大小，100%甲醇润湿后水中漂洗3分钟，用转移缓冲液中平衡15分钟；(4)将凝胶置于已被转移缓冲液浸润的厚滤纸上，将PVDF膜覆于凝胶上，再盖上一张浸润的厚滤纸，将他们一起夹入电转移槽中；(5)凝胶在负极，PVDF膜在正极，加入IL的电泳缓冲液，打开外循环制冷至10°C，并打开电转仪槽下的磁力搅拌器，低速运转。
(6)打开电源，设置为180mA，I小时；(7)转膜结束后，卸下膜，水清洗两次，放入丽春红染液中染色30min，将膜用水冲洗至背景较淡后晾干，剪下目的条带备用。Edman降解法测得本发明光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白N端十个氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所不序列 Ala Gly Arg Thr Phe He Gly Tyr Asn Gly。实施例5本发明抗肿瘤蛋白对MCF7细胞的抗增殖作用(I)将MCF7细胞按I X 105cfu/mL浓度，在96孔板中37 °C培养24小时，100 μ L/孔；(2)每孔加入IOyL用培养基依次梯度稀释的浓度为10μΜ、50μΜ、100μΜ、150 μ Μ、200 μ M的(实施例1、2或3获得的)抗肿瘤蛋白，每个浓度3个平行，并设空白对照，37°C培养24小时、48小时、72小时、96小时。(3)每孔加入25 μ L经4°C预冷的500g/L三氯醋酸，终浓度为100g/L，4°C放置I小时；(4)蒸馏水洗涤5次，空气干燥后每孔加入4g/L SRB染色30min ；(5)醋酸洗涤5次，空气干燥后每孔加入10mmol/L Tris缓冲液100 μ L溶解，490nm下酶联免疫检测仪测定吸光值。该蛋白对MCF7细胞的抗增殖作用如图4，PNAP处理MCF724小时、48小时、72小时、96小时后对MCF7细胞抗增殖作的IC50分别为15.52 μ Μ、9.97 μ Μ、4.99 μ Μ、3.23 μ Μ。说明PNAP对MCF7细胞具有很好的抗增殖作用。实施例6本发明抗肿瘤蛋白对肿瘤细胞凋亡的诱导作用(I)将MCF7细胞按lX105cfu/mL浓度，在12孔板中37°C培养24小时，ImL/孔；(2)每孔加入500μΜ、1000μΜ、1500μΜ的(实施例1、2或3获得的)抗肿瘤蛋白10 μ L，每个浓度3个平行，并设空白对照，37 °C培养24小时；(3)取IX IO5Cfu细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，加入0.5ml JC-1染色液，37°C孵育20min ；
(4) 4°C将步骤(3)中细胞在600g离心5min后收集沉淀，JC-1染色缓冲液洗涤2次，流式细胞仪检测(如图5)。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降。图中的右下象限代表绿色荧光。5μΜ、10μΜ、15μΜ光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白处理的MCF7细胞，发出绿色荧光细胞的比率分别为4.56%、18.25%, 32.20%。从图中可以看出随着光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白浓度的增加，凋亡细胞的比率逐渐增加，表明本发明的光帽鳞伞(Pholiota namek·o)抗肿瘤蛋白对MCF7细胞凋亡具有诱导作用。
序列 表
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120> 一种从光帽鳞伞中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法<160> I
<210> I<211> 10<2I2> PRT
<213> !} Ho I iofa nameko<400> I
Ala Gly Arg Thr Phe He Gly Tyr Asn Glv
I510
权利要求
1.一种光帽鳞伞(Pholiota nameko)中提取的抗肿瘤蛋白PNAP,所述的抗肿瘤蛋白PNAP来自光帽鳞伞(Pholiota nameko)，分子量为17KDa，N-端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所不序列 Ala Gly Arg Thr Phe He Gly Tyr Asn Gly0
2.权利要求1所述的抗肿瘤蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将光帽鳞伞(Pholiotanameko)子实体研磨成粉，溶解于0.2^0.5M的NaCl溶液中，2 6°C浸提8 16小时，500(T8000rpm离心2(T40min，收集上清液，即光帽鳞伞(Pholiotanameko)子实体粗提液； (2)向步骤(I)中的光帽鳞伞(Pholiotanameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为70 100%，2 6°C放置8 16小时，1000(T20000rpm离心l(T40min，收集沉淀，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物； (3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiotanameko)蛋白粗提物用20 50禮、ρΗ6.0 9.0的PBS缓冲液溶解，然后在2 6°C、1飞倍重量的蒸馏水中透析8 16小时，反复3飞次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉； (4)将步骤(3)中的光帽鳞伞(Pholiotanameko)蛋白粗粉溶解于25 50mM MES、pH5.0 6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用25 50mM MES、0.5 IM NaCl,ρΗ5.(Γ6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰； (5)将洗脱峰上样凝胶层析柱，用25 50mMMES、20(T500mM NaCl，pH5.0^6.0的MES C缓冲液洗脱，获得光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白。
3.权利要求1所述的光帽鳞伞(Pholiotanameko)抗肿瘤蛋白在对人乳腺癌细胞株MCF7的生长抑制中的应用。\`
4.根据权利要求3所述的应用,光帽鳞伞(Pholiotanameko)抗肿瘤蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用，JC-1染色分析线粒体膜电位证明该蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡。
全文摘要
本发明公开了一种从光帽鳞伞(Pholiota nameko)中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法。本发明的抗肿瘤蛋白是将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换和凝胶层析而获得。该蛋白是分子量为17KDa的单体蛋白，N-端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示序列Ala Gly Arg Thr Phe Ile Gly Tyr Asn Gly；对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用。本发明中光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白为天然提取物，对人类和环境均无害；制备方法简单，成本较低，适于工业化生产。
文档编号A61P35/00GK103102399SQ201310064869
公开日2013年5月15日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者刘方, 张业尼, 刘赵昆 申请人:南开大学