专利名称：降低嗜酸性粒细胞水平的方法
技术领域：
本发明涉及降低人对象的嗜酸性粒细胞水平的方法。
背景技术：
嗜酸性粒细胞与多种疾病有关，包括变应性疾病，认为这种细胞在变应性疾病，如慢性支气管哮喘和特应性皮炎的发病中起到重要作用[Adv.1mmunol.，39，177 (1986)，Immunol.Today, 13，501 (1992)]。除上述疾病外，嗜酸性粒细胞也涉及通常称为嗜酸性粒细胞过多综合征(HES)的疾病，如嗜酸粒细胞增多、嗜酸性粒细胞性肠胃炎、嗜酸性粒细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性肉芽肿和基穆拉病[Ann.1ntern.Med.，97，78 (1982)]。嗜酸性粒细胞性肉芽肿是非成瘤性隐原型病变，它是溶骨性病灶，已知与显著的组织嗜酸粒细胞增多相关联[U.S.Armed Forces Med.J.，2，1085 (1951)]。按照日本的骨肿瘤患者记录(1972-1984)，404位骨肿瘤患者中379位(93.8%)出现嗜酸性细胞性肉芽肿。嗜酸性粒细胞性肉芽肿早期主要包括嗜酸性粒细胞和组织细胞，晚期的肉芽肿包括纤维化，或者可发展成纤维性肺。因此，除炎性疾病如变态反应外，嗜酸性粒细胞可引起其它各种疾病。白介素-5 (下文称为IL-5)、白介素-3 (下文称为IL_3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(下文称为GM-CSF)是细胞 因子家族成员，它们参与调节嗜酸性粒细胞的分化、增殖和活化。在这些细胞因子中，已知IL-5特异性作用于嗜酸性粒细胞，并特异性诱导终末分化[Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，85，2288 (1988)]。体外，IL-3和/或GM-CSF可激活嗜酸性粒细胞或延长其存活期[J.Cl in.1nvest.，81，1986(1988)]。而且，IL-3和/或GM-CSF的主要作用还有从髓细胞样干细胞诱导不成熟的嗜酸性粒细胞[Blood，76，1956 (1990)]。而且，趋化因子如嗜酸性粒细胞趋化蛋白和RANTES (受激活调节正常T细胞表达和分泌因子)诱导嗜酸性粒细胞向发炎部位的趋化性[Clin.Exp.Allergy，26，1005 (1996)]。在变应性支气管炎中，干细胞因子(下文称为SCF)参与嗜酸性粒细胞的累积。除IL-5外，有许多因子影响嗜酸性粒细胞功能。嗜酸性粒细胞分为以下亚组，即正常密度嗜酸性粒细胞和低密度嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞活化后是低密度嗜酸性粒细胞[Immunology，47，531 (1982)]。低密度嗜酸性粒细胞也称为活化的嗜酸性粒细胞。已报道，在HES患者外周血中嗜酸性粒细胞除发生数量改变外，也发生性质改变[Clin.Exp.1mmunol.，24，423 (1976)]。活化的嗜酸性粒细胞与HES症状的严重性有关[Am.J.Cardiol.，52，321 (1983)]。除HES患者外，也在支气管哮喘患者的外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中发现活化的嗜酸性粒细胞[Am.Rev.Respir.Dis，132，981 (1985)]。活化的嗜酸性粒细胞(低密度嗜酸性粒细胞)上表达各种受体，如细胞因子受体[J.1mmunol.，142，4416 (1989)]。与正常密度嗜酸性粒细胞相比，这些低密度嗜酸性粒细胞对 IL-5 的敏感性升高[Clin.Exp.1mmunol., 85, 312 (1991) ；J.Exp.Med.，172，1347(1990)]。也知道上述活化的嗜酸性粒细胞在没有诱导嗜酸性粒细胞分化和增殖的细胞因子的体外条件下能够存活[J.Exp.Med.,170, 343 (1989) J0因此，活化嗜酸性粒细胞的性质类似于浸润组织，例如肺泡的那些嗜酸性粒细胞[Int.Arch.Allergy Immunol., 120,91(1999)]。尚不了解活化的嗜酸性粒细胞变成细胞因子依赖性的原因的详细解释，然而，其脱粒和存活期延长可能是由除IL-5以外的各种重要功能分子诱导的。对参与嗜酸性粒细胞分化或增殖的细胞因子或趋化因子有抑制活性的物质被认为是抑制嗜酸性粒细胞功能的物质。然而，在大多数情况下，这些物质对被激活并浸润到发炎区域的细胞因子依赖性嗜酸性粒细胞不起作用。因此，嗜酸性粒细胞特异性抑制和诱导活化嗜酸性粒细胞的细胞死亡是抑制任何嗜酸性粒细胞功能的必需步骤。然而，迄今为止没有任何消炎剂能诱导活化的嗜酸性粒细胞凋亡。目前，嗜酸性粒细胞疾病患者的治疗包括给予类固醇。然而，给予类固醇常常伴有副作用。具体说，这种治疗产生一些其它问题，例如类固醇给药停止后患者的病理状况可能回复到初始状态，和长期给予类固醇可诱导类固醇抗性。因此，需要针对嗜酸性粒细胞介导的疾病和失调的安全有效的治疗。发明概述本发明提供一种减少人对象中嗜酸性粒细胞数量的方法，包括给予所述患者IL-5R结合分子，该结合分子包含(a)特异性结合IL-5R的区域和(b)免疫球蛋白Fe区。附图简述出于阐述本发明 的目的，附图中描述了本发明的某些实施方式。然而，本发明不仅限于附图中描述的实施方式的精确安排和手段。
图1.血清嗜酸性粒细胞阳离子性蛋白质(ECP)减少:ECP是嗜酸性粒细胞产生的标记物。在患者组I中，这种ECP水平降低表明嗜酸性粒细胞的减少,如图1所示。y_轴表示ECP水平(ng/ml)，χ-轴表示时间(天)。图2.可逆的外周嗜碱性粒细胞消耗:测定患者组I中的循环嗜碱性粒细胞。y_轴表示嗜碱性粒细胞计数(嗜碱性粒细胞/毫米3)，χ-轴表示时间(天)。给药后24小时观察到外周血中嗜碱性粒细胞快速减少。图3.患有嗜酸粒细胞增多的对象中hsCRP (高敏感型c反应性蛋白)基线水平升高(可逆)。在患者组I中测定这种标记物表明，如期发生对IL-5R表达细胞的免疫介导反应。y-轴表示hsCRP水平(mg/dl), χ-轴表示时间(天)。图4.血清IL-6的最小增加值。小结了在患者组I中测定的IL-6细胞因子。y_轴表示IL-6水平(pg/ml), χ-轴表示时间(小时)。图5.循环嗜中性粒细胞发生可变的降低。测定患者组I中的嗜中性粒细胞水平，小结于两幅图中。图6.循环淋巴细胞发生可变的降低。测定患者组I中的淋巴细胞水平，小结于两幅图中。图7.在第一天％NK —致地发生适度降低。在治疗前、给药后第I天和给药后第28天检测患者组I中的NK细胞水平。图8.基线较高的对象中FEmj降低。在患者组I中测定呼出一氧化氮的比例。此实验是非侵入性肺炎测定方法，数据表示炎症减轻的趋势。图9.体外细胞毒实验:在体外细胞毒实验中，与不结合IL-5R的对照抗体㈧和岩藻糖基化MED1-563的额外对照(B)相比，测定MED1-563。KC1333效应细胞以5:1的比例用于对抗CTLL2靶细胞。4小时时测定细胞毒性。Y轴表示细胞毒百分数，X轴表示抗体浓度。图10.MED1-563与rhuIL_5R α的结合:通过表面等离振子共振，在三个单独实验中测定MED1-563与重组人IL-5Ra的结合亲和力，小结于该图中。图11.MED1-563与rhuFcyRs的 结合:测定MED1-563与几个不同批次的重组人Fe Y R的结合亲和力，并与同种型匹配的岩藻糖基化对照抗体作比较，小结于该图中。需要注意，MED1-56与huFcyRIIIa和muFcyRIV的结合亲和力是(对照的)5-10倍。图12.通过免疫组化分析IL_9tg小鼠肺部的IL_5Ra表达，并绘制成该图。图13.通过免疫组化，用MED1-563分析鼻息肉中的IL_5Ra表达，并绘制成该图。MED1-563能够对鼻息肉中的所有嗜酸性粒细胞染色。图14.对象中的最小瞬时嗜中性白血球减少症:对第一组的对象进行绝对嗜中性粒细胞计数，并小结于该图中。Y-轴代表嗜中性粒细胞计数(嗜中性粒细胞/毫米3)和X-轴代表时间天数。图15.MED1-563与健康捐献者全血中的嗜酸性粒细胞结合:如本文实施例6所述，对全血样品进行流式细胞术分析。这三组FACS数据，特别是第三组题为“MED1-563结合嗜酸性粒细胞”的数据表明MED1-563与嗜酸性粒细胞结合。图16.来自IL-5转基因小鼠的白细胞的FACS分析:如实施例7所述，对来自IL_5转基因小鼠的白细胞进行流式细胞术分析。图16A小结了 SiglecF+CCR3+嗜酸性粒细胞的FACS分析。图16B用抗-1L-5RamAb H7证明，骨髓、脾、血液和肺中的所有嗜酸性粒细胞(SiglecF+CCR3+)均表达 IL_5Ra +。图17.在体外ADCC实验中MED1-563消耗来自骨髓的IL_5Ra阳性单核细胞。在CFSE染色的效应细胞存在下使分离的非贴壁骨髓单核细胞接触MED1-563，或同种型对照抗体(R347)。通过KM1257抗体/PE偶联的山羊抗-μ IgG观察IL_5Ra阳性细胞。利用1A7同种型对照抗体/PE偶联的山羊抗-μ IgG对样品进行对照染色。进行MED1-563或R347介导的消耗后，样品细胞群的染色概况显示为ΚΜ1257/ΡΕ与CFSE或1Α7/ΡΕ与CFSE散点图。比较由MED1-563和R347处理样品获得的ΚΜ1257/ΡΕ与CFSE散点图揭示出，MED1-563介导的ADCC基本耗尽样品中的所有IL-5Ra阳性细胞。图18.MED1-563可逆地消耗轻微哮喘患者的外周血嗜酸性粒细胞。患有轻微特应性哮喘的六位志愿者接受单次IV给予的(A)0.03mg/kg或(B)0.lmg/kg MED1-563。在筛选时、给药前第O天和以规则间隔到第84天以及随访期间通过流式细胞术对外周血嗜酸性粒细胞计数。I—轴表示嗜酸性粒细胞计数(嗜酸性粒细胞/毫米3)，X-轴表示时间(天)。给药后24小时观察到外周血中嗜酸性粒细胞快速减少。MED1-563诱导的嗜酸性细胞减少是可逆的。图19.用MED1-563进行免疫组化分析时发现正常人肺中的所有嗜酸性粒细胞上均表达IL-5Ra，绘制该图。图20.用MED1-563进行免疫组化分析时发现哮喘患者的肺活检样品中所有嗜酸性粒细胞上均表达IL-5Ra，绘制该图。图21.通过流式细胞术分析分离自健康捐献者的原代嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的IL-5Ra表达。显示利用MEDI563抗-1L5Ra抗体和无关特异性的同种型对照抗体获得的染色概况，CTLLh5r细胞(IL_5Ra/i3转染的肿瘤细胞)用作阳性对照。图22.体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)实验:在体外ADCC实验中比较非岩藻糖基化和岩藻糖基化MED1-563的活性。分离的原代NK细胞和嗜酸性粒细胞分别用作效应细胞和靶细胞，比例为5:1。在lng/ml人IL-2存在下进行该实验。根据膜联蛋白V染色，通过流式细胞术评估细胞死亡。Y和X轴分别表示最大细胞毒性百分数和抗体浓度。非岩藻糖基化MED1-563抗体的EC50为0.965pM。图23.体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)实验:在体外ADCC实验中分析非岩藻糖基化MED1-563的活性。分离的原代NK细胞和嗜碱性粒细胞分别用作效应细胞和靶细胞。Y和X轴分别表示最大细胞毒性百分数和抗体浓度。在该实验中非岩藻糖基化MED1-563 抗体的 EC50 为 0.561pM。图24.在体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)实验中嗜酸性粒细胞的脱粒:使用不同水平的岩藻糖基化(MED1-563F)和非岩藻糖基化(MED1-563)抗_IL5Ra抗体进行体外ADCC实验，以分析嗜酸性粒细胞释放的EDN (嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素)。该实验使用新鲜分离的嗜酸性粒细胞和NK或PBMC细胞，分别用作靶细胞和效应细胞。显示用1%曲通X-100处理时检测到的嗜酸性粒细胞脱粒最大值以便比较。图25.MED1-563特异性结合人IL_5Ra胞外区Dl结构域中的表位。通过流式细胞术确认抗体与瞬时表 达嵌合IL-5Ra蛋白的转基因细胞的结合。显示了荧光染色概况。“多克隆”和“MED1-563”指分别利用多克隆抗-人IL-5Ra和MED1-563抗体观察到的染色概况。“双染”指“多克隆”(χ轴)和MED1-563 (y轴)抗体的荧光染色概况。㈧瞬时表达一系列人-小鼠嵌合IL-5Ra转基因。“敲除”转基因是在人背景中包含单个小鼠胞外结构域的嵌合IL-5Ra构建物。“敲入”转基因是在小鼠背景中包含单个人胞外结构域的嵌合IL-5Ra构建物。(B)MED1-563特异性结合表达人IL-5Ra的转基因细胞。MED1-563不结合表达小鼠IL-5Ra的转基因细胞。(C)MED1-563不结合表达包含小鼠Dl和人D2-D3胞外结构域(“敲除D1”)的嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。MED1-563特异性结合表达在人背景中包含小鼠D2或D3胞外结构域(“敲除D2或D3”)的嵌合IL_5Ra转基因的转基因细胞。(D)MED1-563特异性结合表达包含人Dl和小鼠D2-D3胞外结构域(“敲入D1”)的嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。MED1-563不结合表达包含人D2或D3胞外结构域(“敲入D2或D3”)的小鼠IL-5Ra基嵌合转基因的转基因细胞。图26.MED1-563特异性结合人IL_5Ra胞外区Dl的区段B中的表位。通过流式细胞术确认抗体与表达嵌合IL-5Ra蛋白的转基因细胞的结合。显示了荧光染色概况。“多克隆”和“MED1-563”指分别利用多克隆抗-人IL-5Ra和MED1-563抗体观察到的染色概况。“双染”指多克隆(χ轴)和MED1-563 (y轴)抗体的荧光染色概况。(A)小鼠IL_5Ra胞外区Dl的氨基酸序列与人IL_5Ra蛋白75%相同。IL_5Ra胞外区Dl分成区段A、B和C。所示的人和小鼠IL-5Ra氨基酸序列分别是SEQ ID NO:5和6的残基1-102。⑶瞬时表达一系列人-小鼠嵌合IL-5RCI转基因。“敲除”转基因是在人背景中包含单个小鼠胞外结构域Dl的区段的嵌合IL-5Ra构建物。“敲入”转基因是在小鼠Dl-人D2-小鼠D3-小鼠TM背景中包含单个人胞外结构域Dl的区段的嵌合IL-5R a构建物。(C)MEDI_563特异性识别表达⑴人IL-5Ra转基因或(ii)包含人胞外区Dl的小鼠IL_5Ra嵌合转基因(“敲入D1”)的转基因细胞。MED1-563不结合表达(i)小鼠IL_5Ra受体转基因或(ii)包含小鼠胞外区Dl的人嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。(D)MEDI_563不结合表达在人背景中包含小鼠胞外结构域Dl的区段B( “敲除B”)的嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。MED1-563特异性结合表达在人背景中包含小鼠胞外结构域Dl的区段A或C( “敲除A或C”)的嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。(E)MED1-563特异性结合表达在小鼠Dl-人D2-小鼠D3-小鼠TM背景中包含人胞外结构域Dl的区段B ( “敲入B”)的嵌合IL_5Ra转基因的转基因细胞。MED1-563不结合表达在小鼠Dl-人D2-小鼠D3-小鼠TM背景中包含人区段A或C( “敲入A或C”)的嵌合IL-5Ra转基因的转基因细胞。图27.MED1-563特异性结合包含胞外区Dl的氨基酸残基Ile61的人IL_5Ra的表位。通过流式细胞术确认抗体与表达变异IL-5Ra蛋白的转基因细胞的结合。显示了荧光染色概况。“多克隆”和“MED1-563”指分别利用多克隆抗-人IL-5Ra和MED1-563抗体观察到的染色概况。“双染”指多克隆(χ轴)和MED1-563 (y轴)抗体的荧光染色概况。(A)人IL-5Ra胞外区Dl的残基50-61 (SEQ ID NO:5的残基40-61)。斜体表示的残基在小鼠IL-5Ra蛋白的相应区域不同。在转基因细胞中表达包含至少一个突变氨基酸残基的一系列IL-5Ra受体变体。“敲除”IL_5Ra变体是包含将人残基替换成相应小鼠残基的至少一个取代的突变的人蛋白。例如，“敲除DE”变体是包含D56E和E58D氨基酸取代的人IL-5Ra蛋白。“敲入”IL_5Ra变体是包含小鼠D1、人D2、小鼠D3和小鼠TM结构域的嵌合蛋白，其中小鼠Dl结构域包含突变的区段B，其具有将小鼠残基替换成相应人残基的至少一个取代。例如，“敲入DE”变体是包含突变的小鼠区段B的嵌合IL-5Ra蛋白，其中突变的小鼠区段B包含E56D和D58E氨基酸取代。(B)MEDI_563不结合表达突变的人IL-5R a蛋白的转基因细胞，所述突变的人IL-5R a蛋白包含K53Q、D56E、E58D、I61K氨基酸取代(“敲除-KDEI”)。MED1-563特异性结合表达突变的人IL-5Ra蛋白的转基因细胞，所述突变的人 IL-5Ra 蛋白包含 N40H、N42D、Q46H( “敲除-NNQ”)或 D56E、E58D( “敲除 _DE”)或N40H、N42D、D56E、E58D( “敲除-NNDE”)氨基酸取代。(C)MEDI_563特异性结合表达包含突变的小鼠区段B的嵌合IL-5R a蛋白的转基因细胞，其中所述突变的小鼠区段B包含Q53K、E56D、D58E、K61I氨基酸取代(“敲入-KDEI”)。(D)MEDI_563不结合表达突变的人IL_5Ra蛋白的转基因细胞，所述突变的人IL_5Ra蛋白包含I61K氨基酸取代(“敲除-161”)。MED1-563特异性结合表达突变的人IL-5Ra蛋白的转基因细胞，所述突变的人IL-5Ra蛋白包含K53Q( “敲除-K53”)氨基酸取代。(E)MED1-563特异性结合表达包含突变的小鼠区段B的嵌合IL-5Ra蛋白的转基因细胞，其中所述突变的小鼠区段B包含K61I氨基酸取代(“敲入-161”)。MED1-563不结合表达包含突变的小鼠区段B的嵌合IL-5Ra蛋白的转基因细胞，其中所述突变的小鼠区段B包含Q53K氨基酸取代(“敲入-K53”)。图28.嵌合抗-小鼠IL-5Ra (H7)与鼠Fe Y R结合:测定嵌合抗-小鼠IL-5Ra (H7)与 重组鼠Fe Y R的结合亲和力并与同种型匹配的岩藻糖基化对照抗体作比较，小结于该图中。显示解离常数(nM)。通过表面等离振子共振技术进行测定。
图29.(A)通过流式细胞术分析鉴定嗜酸性粒细胞，具有侧散射特征的细胞为CCR3和Siglec-F染色阳性。(B) IL_5Tg小鼠骨髓、血液、脾和肺组织中的嗜酸性粒细胞选择性表达IL-5R。图30.非岩藻糖基化和岩藻糖基化的H7能消耗IL_5Tg小鼠脾㈧、肺组织㈧和血液(B)中的嗜酸性粒细胞。在骨髓(B)中未检测到消耗。与岩藻糖基化H7相比，非岩藻糖基化的H7在去除嗜酸性粒细胞方面更有效，特别是在较低的抗体剂量下。数据表示为平均值土SEM，n=6-8只小鼠/组，抗体治疗组与对照IgG治疗组相比p〈0.05，Mann-WhitneyU检验。图31.在变应原刺激模型中非岩藻糖基化H7也消耗嗜酸性粒细胞。在气道内腔、肺组织、血液和骨髓中，非岩藻糖基化H7消耗嗜酸性粒细胞。最后一次刺激后72小时(抗体递送后96小时)，所有区室中的消耗水平最高。数据表示为平均值土SEM，n=6只小鼠/组，*抗体治疗组与对照IgG治疗组相比p〈0.05，Mann-Whitney U检验。发明详述如上所述并且不受任何特定假设或理论限制，嗜酸性粒细胞与多种疾病和失调的发病有关。许多这类疾病或失调的特征是嗜酸性粒细胞过多(嗜酸粒细胞增多)，称为嗜酸性粒细胞过多综合征。嗜酸性粒细胞起作用的疾病和失调的非限制性例子是:哮喘、免疫球蛋白(IgE)-介导的食物变态反应、嗜酸性粒细胞性食道炎(食道的炎症)、炎性肠病、C0PD、变应性结肠炎、胃-食管反流、嗜酸性粒细胞性胃肠疾病(EGID)、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、心内膜纤维化、吕弗勒心内膜炎、戴维病(Davies disease)、与嗜酸粒细胞增多有关的发作性血管性水肿、嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征/西班牙毒油综合征、肝硬化、疱疹样皮炎、大疱性类天疱疮、丘-施二氏综合征、急性骨髓性嗜酸性细胞白血病、急性淋巴细胞性嗜酸性细胞白血病、并发嗜酸粒细胞增多的系统性肥大细胞病、过敏性鼻炎、湿疹、韦格纳肉芽肿病、结节性多动脉炎、嗜酸 性粒细胞性筋膜炎和类风湿性关节炎。因此，本发明提供一种减少人对象中嗜酸性粒细胞数量的方法，包括给予所述患者IL-5R结合分子，该结合分子包含(a)特异性结合IL-5R的区域和(b)免疫球蛋白Fe区。在一个实施方式中，本发明提供减少人对象中嗜酸性粒细胞数量的方法，包括给予所述患者IL-5R结合分子，该结合分子包含(a)特异性结合IL-5R的区域和(b)免疫球蛋白Fe区。在一个具体实施方式
中，本发明方法减少血液、骨髓、胃肠道(如食道、胃、小肠和结肠)或肺中嗜酸性粒细胞的数量。在另一具体实施方式
中，本发明方法减少血液嗜酸性粒细胞的数量。在另一具体实施方式
中，本发明方法减少肺嗜酸性粒细胞的数量。在一个具体实施方式
中，本发明方法减少嗜酸性粒细胞前体细胞的数量。在另一实施方式中，本发明方法使嗜酸性粒细胞数量减少至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个具体实施方式
中，本发明方法使嗜酸性粒细胞数量降低到检测限以下。在另一实施方式中，本发明方法使嗜酸性粒细胞前体数量减少至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个具体实施方式
中，本发明方法使嗜酸性粒细胞前体数量降低到检测限以下。在另一实施方式中，本发明方法在单次给予IL-5R结合分子后消除所有可检测的嗜酸性粒细胞。在一个具体实施方式
中，单次给予IL-5R结合分子消除所有可检测的嗜酸性粒细胞至少约I天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约9周、至少约10周、至少约12周、至少约14周、至少约16周、至少约20周或至少约25周。在另一实施方式中，本发明方法在单次给予IL-5R结合分子后消除所有可检测的嗜酸性粒细胞前体。在一个具体实施方式
中，单次给予IL-5R结合分子消除所有可检测的嗜酸性粒细胞前体至少约I天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约9周、至少约10周、至少约12周、至少约14周、至少约16周、至少约20周或至少约25周。在一个具体实施方式
中，本发明方法包括给予对象一个剂量的0.03mg/kgIL-5R结合分子，该结合分子包含(a)特异性结合IL-5R的区域和(b)免疫球蛋白Fe区，其中给予该IL-5R结合分子导致消耗该对象循环中至少约99%嗜酸性粒细胞，给药后24小时完成消耗，该消耗作用在给药后持续至少约28天。在一个具体实施方式
中，本发明方法包括给予对象一个剂量的0.lmg/kg IL-5R结合分子，该结合分子包含(a)特异性结合IL-5R的区域和(b)免疫球蛋白Fe区，其中给予该IL-5R结合分子导致消耗该对象循环中至少约99%嗜酸性粒细胞，给药后24小时完成消耗，该消耗作用在给药后持续至少约84天。
在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子包括融合蛋白。在某些实施方式中，该融合蛋白包含特异性结合IL-5R的多肽区，还包含免疫球蛋白Fe区。特异性结合IL-5R的多肽区的非限制性例子可参见美国专利7，109，299和5，677，280，美国专利申请公开号2006/0014680A1。在其它实施方式中，特异性结合IL-5R的多肽区的是人IL-5 (参见例如，Tanabi 等，Journal of Biological Chemistry, 1987,第 262 卷，第 34 期，第 16580-16584页)，或者其片段、衍生物或变体(参见例如，美国专利号6，465，616)。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子包括抗体。本发明抗体包括但不限于:单克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’ )片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和它们的表位结合片段。具体说，本发明抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有能特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明免疫球蛋白分子可以是任何类型(如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类(如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或小类的免疫球蛋白分子。本发明的有用抗体可来自任何动物，包括鸟类和哺乳动物(例如但不限于，人、鼠、驴、绵羊、兔，山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在特定实施方式中，所述抗体是人或人源化单克隆抗体。本发明所用抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的抗体。多特异性抗体可以特异性结合于多肽的不同表位，或者可以特异性结合于多肽和异源表位，如异源多肽或固体支持物材料。参见例如，国际公开号W093/17715、W092/08802、W091/00360和 W092/05793 ;Tutt，等，1991，J.1mmunol.147:60-69 ;美国专利号 4，474，893,4, 714, 681、4，925，648,5, 573，920 和 5，601，819 ;和 Kostelny 等，1992，J.1mmunol.148:1547-1553。本发明所用抗体可以是单链抗体。单链抗体的设计和构建参见Marasco等，1993,Proc Natl Acad Sci90:7889-7893。本发明抗体的非限制性例子可参见美国专利7，179,464,6, 538, 111,6,018,032和美国专利申请公开号2004/0136996Α1、2005/0226867Α1。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子包括抗体。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是包含SEQ ID NO:1_4中任何一个氨基酸序列的抗体。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和3的抗体。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和4的抗体。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合表位与MED1-563相同的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一具体实施方式
中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合表位与MED1-563相同的抗体，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ IDNO:5残基1-102的表位的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ ID NO:5残基1-102的表位的抗体，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ IDNO:5残基40-67的表位的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ ID NO:5残基40-67的表位的抗体，但该抗体不是MED1-563。
在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ IDNO:5残基52-67的表位的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ ID NO:5残基52-67的表位的抗体，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ ID NO:5残基61的表位的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合包含SEQ ID NO:5残基61的表位的抗体，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合第一抗原但不特异性结合第二抗原的抗体，所述第一抗原包含SEQ ID NO:5残基1-102，所述第二抗原包含SEQ IDNO:5残基1-102的变体，其中所述变体包含I61K取代。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一具体实施方式
中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合第一抗原但不特异性结合第二抗原的抗体，所述第一抗原包含SEQ ID NO:5残基1-102，所述第二抗原包含SEQ ID NO:5残基1-102的变体，其中所述变体包含I61K取代，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合第一抗原但不特异性结合第二抗原的抗体，所述第一抗原包含SEQ ID NO: 5残基40-67，所述第二抗原包含SEQ IDNO:5残基40-67的变体，其中所述变体包含I61K取代。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一具体实施方式
中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合第一抗原但不特异性结合第二抗原的抗体，所述第一抗原包含SEQ ID NO:5残基40-67，所述第二抗原包含SEQ ID NO:5残基40-67的变体，其中所述变体包含I61K取代，但该抗体不是MED1-563。在一个实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合人IL-5Ra (SEQ IDNO: 5)但不特异性结合包含I61K取代的人IL-5Ra突变体(SEQ ID NO: 5)的抗体。在一个具体实施方式
中，所述抗体是MED1-563。在另一实施方式中，本发明IL-5R结合分子是特异性结合人IL-5Ra (SEQ ID NO:5)但不特异性结合包含I61K取代的人IL-5Ra突变体(SEQ ID NO: 5)的抗体，但该抗体不是MED1-563。本发明提供效应功能增强的IL-5R结合分子。提高效应功能的方法的非限制性例子可参见美国专利5，624，821、6，602，684、7，029，872 ;美国专利申请公开号2006/0067930AU2005/0272128AU2005/0079605AU2005/0123546AU2004/0072290AU2006/0257399A1,2004/0261148A1,2007/0092521,2006/0040325A1,和 2006/0039904A1 ；和国际专利申请公开号 W004/029207、W003011878、W005044859、W006071856、和W006071280。本领域了解工程改造抗体Fe区以改变效应功能的方法(例如，Koenig等的美国专利公开号20040185045和PCT公开号W02004/016750，它们描述了改变Fe区以便与FC Y RIIA结合亲和力相比，提高与Fe Y RIIB的结合亲和力；也参见Armour等的PCT公开号TO99/58572、Idusogie等的W099/51642和Deo等的美国6，395，272 ;通过引用将其全文纳入本文)。本领域也了·解修饰Fe区以降低与Fe YRIIB的结合亲和力的方法(例如，Ravetch等的美国专利公开号20010036459和PCT公开号W001/79299，通过引用将其全文纳入本文)。也记载过具有与野生型Fe区相比，与Fe Y RIIIA和/或Fe Y RIIA结合亲和力提高的变异Fe区的修饰抗体(如，Stavenhagen等的PCT公开号W02004/063351,通过引用将其全文纳入本文)。也可通过产生糖基化模式改变的抗体来调节抗体的效应功能。例如，可制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基减少的非岩藻糖基化/低岩藻糖基化抗体或截开型GlcNAc结构增加的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。可通过例如在糖基化机器改变的宿主细胞中表达该抗体来实现这类糖修饰。本领域已经描述过糖基化机器改变的细胞，它们可用作表达本发明重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，Hanai等的EP1，176，195记载了具有功能破坏的FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，以使该细胞系表达的抗体具有低岩藻糖基化水平。Presta的PCT公开冊03/035835记载了将岩藻糖连接于八811(297)连接糖的能力降低的变异CHO细胞系、Lecl3细胞，这也导致该宿主细胞表达的抗体的低岩藻糖基化水平(也参见Shields, R.L.等(2002) J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana 等的 PCT 公开 W099/54342 记载了经工程改造表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(如β (1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III (GnTIII))的细胞系，使该工程改造细胞系表达的抗体的截开型GIcNAc结构增加，导致该抗体的ADCC活性提高(也参见 Umana 等(1999) Nat.Biotech.17:176-180)。本领域已知产生糖形改变的抗体的方法，包括但不限于Umana等，1999, Nat.Biotechnoll7:176-180 ；Davies 等，20017Biotechnol Bioeng74:288-294 ;Shields 等，2002, J Biol Chem277:26733-26740 ;Shinkawa等，2003，J Biol Chem278:3466-3473 ;美国专利号 6，602，684 ;美国序列号 10/277，370 ;美国序列号 10/113，929 ；PCT W000/61739A1 ；PCT W001/292246A1 ；PCT W002/311140A1 ；PCT W002/30954A1 所述的方法；Potillegent 技术(新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa, Inc.Princeton, N.J.)) ;GlycoMAb 糖基化工程技术(瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司(GLYCART biotechnology AG，Zurich, Switzerland)) ο 参见例如 W000061739 ；EA01229125 ;US20030115614 ；0kazaki 等，2004，JMB，336:1239-49。也可通过翻译后去除岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)制备岩藻糖基化模式改变的抗体。本发明提供体内半衰期延长的特异性结合IL-5R的抗体和抗体片段。具体说，本发明提供的抗体和抗体片段在哺乳动物(例如但不限于人)体内的半衰期大于3天、大于7天、大于10天、大于15天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月，大于3个月，大于4个月或大于5个月。为了延长抗体(例如但不限于，单克隆抗体和单链抗体)或抗体片段(例如但不限于Fab片段)的体内血清循环时间，例如，可利用或不利用多功能接头通过抗体的N或C末端位点特异性与PEG结合或通过赖氨酸残基上的ε -氨基将惰性多聚物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)与抗体(包括其抗体片段)连接。可利用导致生物活性损失最小的线型或分支聚合物衍生化。通过SDS-PAGE和质谱密切监测偶联程度，以确保PEG分子适当地偶联于所述抗体。可通过大小排阻或离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG偶联物分离开。可利用本领域技术人员已知的方法，例如本文所述的免疫实验检测PEG-衍生抗体(包括其抗体片段)的结合活性及体内功效。也可通过在IgG恒定区或其FcRn结合片段(例如Fe或铰链-Fe区片段)中引入一个或多个氨基酸修饰(即取代、插入或缺失)，产生体内半衰期延长的抗体。参见例如，国际公开号W098/23289 ;国际公开号W097/34631 ;和美国专利号6，277，375，通过引用将其全文纳入本文。另外，可将抗体(包括其抗体片段)偶联于清蛋白，以制备体内更稳定或体内半衰期更长的抗体(包括其抗体片段)。本领域熟知这些技术，参见例如国际公开号W093/15199.W093/15200和W001/77137 ;和欧洲专利号EP413, 622，通过引用将所有这些文献纳入本文。本发明提供特异性结合IL-5R的IL-5R结合分子，其中该结合分子重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)于异源蛋白质或多肽(或至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽片段)，以产生融合蛋白。具体说，本发明提供含有本文所述抗体的抗原结合片段(例如但不限于Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab) 2片段、VH区、VH CDR、VL区或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白的制剂。本领域已知将蛋白质、多肽、肽与抗体(包括其抗体片段)融合或偶联的方法。参见例如，美国专利号 5，336，603,5, 622，929,5, 359，046,5, 349，053,5, 447，851 和5，112，946 ;欧洲专利号 EP307, 434 和 EP367, 166 ;国际公开号 W096/04388 和 W091/06570 ；Ashkenazi 等，1991, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10535-10539 ；Zheng 等，1995,J.1mmunol.154:5590-5600 JPVil 等，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:11337-11341 (所述参考文献通过引用全文纳入本文)。 可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总称为“DNA改组”)的技术产生其它融合蛋白。可使用DNA改组改变本发明抗体或其片段(例如但不限于，更高亲合力、更低解离率的抗体或其片段)。通常参见美国专利5，605，793 ;5，811，238 ；5，830，721 ;5，834，252 ;和 5,837, 458 ；Patten 等，1997, Curr.0pinion Biotechnol.,8:724-33 ；Harayama,1998, Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson 等，1999, J.Mol.Biol.，287:265-76 ;和 Lorenzo 和 Blasco, 1998，Biotechniques24 (2): 308-313 (这些专利和发表物各自通过引用纳入本文)。可通过易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法随机诱变，然后进行重组，从而改变抗体(包括其抗体片段)或编码抗体或其片段。编码抗体(包括其抗体片段)的多核苷酸可与一种或多种异源分子的一个或多个组件、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。而且，可将抗体(包括其抗体片段)与标记序列如肽融合，以便纯化。标记氨基酸序列可以是六组氨酸肽，例如PQE载体(凯杰公司(QIAGEN，Inc.)，伊顿大街(EtonAvenue)9259号,查茨沃斯(Chatsworth),CA,91311)提供的标签等,其中许多标记可购得。如Gentz等，1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:821-824所述,六组氨酸提供了方便的融合蛋白的纯化方法。用于纯化的其它肽标签包括但不限于:血凝素(“HA”)标签，它对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell37:767)以及“flag”标签。在其它实施方式中，本发明抗体或其片段偶联于诊断或检测试剂。此类抗体可作为如测定特定疗法的效果的临床测试步骤的一部分，用于监视或预测疾病或失调(例如但不限于，自身免疫病)的发作、发展、进展和/或严重性。可通过将该抗体偶联于可检测物质进行这类诊断和检测:所述可检测物质包括但不限于:各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物发光物质，例如但不限于荧光素酶、萤光素和发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(1311、1251、123I 和 121I)、碳(14C) M (35S)、氣(3H)、铟(115Ιη、113Ιη、112Ιη 和 111In)和锝(99Tc)W (201Ti)、镓(68Ga^67Ga)、钯(103Pd)、钥(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188 Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153GcU 169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Sn ;采用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属以及无放射性(noradioactive)顺磁金属离子。或者，抗体可偶联于第二抗体，形成异源抗体偶联物，如Segal在美国专利号4，676，980中所述，通过引用将其全文纳入本文。选择与感兴趣的抗原(如IL-5R)或其片段偶联的治疗部分或药物以达到对特定疾病或失调所需的预防或治疗效果，所述特定疾病或失调是(例如)对象中与干扰素α多肽表达和/或活性异常相关或以其为特征的疾病或失调、与干扰素α受体或其一个或多个亚基表达和/或活性异常相关或以其为特征的疾病或失调、自身免疫病、自身免疫病、移植物排斥、移植物抗宿主病或其一种或多种症状。当临床医生或其它医学专业人员决定将何种物质偶联于感兴趣抗体，如特异性结合干扰素α多肽或其片段的抗体时，应考虑如下因素:疾病的特性、疾病的严重程度和对象的总体状况。可通过本领域已知任何合成抗体的方法，具体是化学合成或重组表达技术产生特异性结合抗原的抗体(包括其抗体片段)(参见美国专利公开号2007/0014724Α1)。
可通过本领域熟知的各种方法产生某抗原的特异性多克隆抗体。例如，可将人抗原给予各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有该人抗原特异性多克隆抗体的血清。可根据宿主的种类采用各种佐剂提高免疫应答，这些佐剂包括但不限于:弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物质凝胶，如氢氧化铝，表面活性剂，如溶血卵磷脂、普流罗尼多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔滅血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域熟知的。可采用本领域已知的各种技术制备单克隆抗体，这些技术包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，可采用杂交瘤技术产生单克隆抗体，该技术是本领域已知的，参见例如Harlow等，《抗体:实验室手册》(Antibodies:A LaboratoryManual),(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),第 2版，1988)；Hammerling等，刊于:《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas) 563-681 (艾思威尔出版社(Elsevier),纽约，1981以及Harlow等,《使用抗体:实验室手册》(Using Antibodies:A laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(1999),其全文通过引用纳入本文。本文所用术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单个克隆，包括真核、原核或噬菌体克隆的抗体，并不限定其产生方法。用杂交瘤技术产生和筛选特定抗体的方法是常规方法，并且为本领域所熟知。简要说，可用非鼠抗原免疫小鼠，一旦检测到免疫应答后，例如在小鼠血清中检测到该抗原的特异性抗体后，就收获小鼠脾，分离脾细胞。然后，通过熟知技术将脾细胞融合于任何合适的杂交瘤细胞，例如购自ATCC的细胞系SP20的细胞。选择杂交瘤，通过有限稀释克隆。此外，可利 用RMMS(多位点重复免疫)技术免疫动物(Kilpatrack等，1997，Hybridomal6:381—9,通过引用全文纳入本文)。然后,用本领域已知方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合本发明多肽的抗体的细胞。可通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生通常含有大量抗体的腹水。本发明提供产生单克隆抗体的方法以及该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中通过将非鼠抗原免疫小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，然后筛选融合得到的杂交瘤选择分泌能够结合该抗原的抗体的杂交瘤克隆。可通过本领域技术人员已知的任何技术产生特异性识别特定表位的抗体片段。例如，可利用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)等酶对免疫球蛋白分子进行蛋白酶水解切割，产生本发明Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CHl结构域。另外，也可通过本领域已知的各种噬菌体展示法产生本发明抗体。在噬菌体展示法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。具体说，由动物cDNA文库(如人或鼠患病组织的cDNA文库)扩增编码VH和VL区的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL区的DNA与scFv接头重组在一起，克隆到噬菌粒载体中。将该载体电穿孔到大肠杆菌中，用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将VH和VL区重组融合于噬菌体基因III或基因VIII。可以利用抗原，如标记抗原或者结合或捕获在固体表面或珠上的抗原来选择或鉴定表达能够结合特定抗原的抗原结合域的噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展不法的例子包括 Brinkman 等，1995, J.1mmunol.Methodsl82:41-50 ；Ames 等，1995，J.TmMino1.Methodsl84:1 77-1 86 ；Kettleborough 等，1994, Eur.J.1mmunol.24:952-958 ；Persic 等，1997, Genel87:9-18 ；Burton 等，1994, Advances in Immunology57:191-280 ；国际申请号 PCT/GB91/01134 ;国际公开号 W090/02809、TO91/10737、TO92/01047、W092/18619、TO93/11236、TO95/15982、TO95/20401 和 TO97/13844 ;以及美国专利号 5，698，426,5, 223，409,5, 403，484,5, 580，717,5, 427，908,5, 750，753,5, 821，047、5，571，698、5，427，908、5，516，637、5，780，225、5，658，727、5，733，743、5，969，108、6，33，187,5, 824，520和5，702, 892所述的方法，上述文献全文通过引用纳入本文。如上述参考文献所述，噬菌体选择后，可分离噬菌体的抗体编码区，并用于产生完整抗体，包括人抗体或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中表达,如下所述。也可采用通过本领域已知方法,例如 PCT
发明者小池正道, G·L·施皮塔尼, A·惠勒, B·怀特 申请人:米迪缪尼有限公司, 百讴瓦股份有限公司