专利名称：一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制曲技术，特别涉及一种霉菌融合子用于添加到中药制曲的方法；该方法是利用非对称灭活技术构建霉菌融合子并将其用于添加到中药制曲中，得到同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的药曲，属于轻工生物技术领域。
背景技术：
药曲是酿造等行业的糖化发酵剂，传统药曲的制作方法类似于传统酿酒大曲或酿酒小曲的生产方法。药曲中的微生物来源于自然接种或原有曲粉传种，通过微生物的自然发酵对制曲原料的原有特性会产生一定程度的转化，而制备成的一类传统中药或药食两用的曲药产品[中药发酵的概况与关键技术.中国药业.2008,15(17): 15-17.]，但是，通过微生物育种技术获得高性能纯种药曲未见报道。
常用的微生物育种技术主要有自然分离、诱变筛选、细胞结合、原生质体融合、基因导入以及基因破坏等方法。原生质体融合方法是指通过人为因素使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。对原生质体的融合技术，传统方法多采用抗药性标记或营养缺陷标记亲本菌株，以便检出融合子菌株，其工作相当繁琐且工作量大[以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合.华东理工大学学报(自然科学版).2010,36 (I):36-41.J0因此，如能提供一种工艺更简单、操作方便且易于实现霉菌融合子构建、并能将其用于添加到中药制曲的方法中，这正是本发明的任务所在。发明内容
本发明的目的正是为了克服现有技术中所存在的缺陷和不足，而提供一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法，该方法是利用非对称灭活技术构建霉菌融合子，再将该霉菌融合子用于添加到中药制曲中，获得同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的、且具有一定保健功能因子的融合子中药曲。
本发明的基本思路是采用非对称灭活技术，根据“致死损伤互补”原则，非对称灭活使原生质体的部分细胞器特异性损伤，单独培养不能再生，只有损伤部分发生互补修复才能再生，这就减少了工作量。采用非对称灭活原生质体融合技术构建霉菌融合子，并将该霉菌融合子添加到中药制曲中，制备成同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的中药曲。该中药曲对酿造过程中增强产品保健等功能、提高酿酒原材 料中纤维质利用率具有重大意义。
为实现上述目的，本发明采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
本发明提供的一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法，依次包括以下工艺步骤:
( I)菌丝体的培养及预处理
将两亲本白曲霉(ZZH)与绿色木霉(TV)分别转接于培养基上，待其生长3(Γ48小时后，用无菌水制成107 109个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300 μ L霉菌孢子菌悬液接种于液体培养基中，置于温度3(T32°C，转数为10(Tl20rpm的气浴摇床中振荡培养18 24小时，得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经无菌擦镜纸抽滤、无菌水漂洗去除培养基；再用0.9mol/L的氯化钠渗稳剂在4°C离心机中离心洗涤3次，每次5分钟，即获得预处理后的湿菌丝体；(2)原生质体的制备①将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，白曲霉按
0.5^1.0g/10ml的量加入复合酶液，于温度3(T32°C、转数8(Tl00rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解2 3小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于250(T3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉(ZZH)原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；②将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，绿色木霉按
1.(Tl.5g/10ml的量加入复合酶液，于温度3(T35°C、转数8(Tl00rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解3飞小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于250(T3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉(TV)原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得绿色木霉原生质体悬浮液；(3)原生质体非对称灭活:①白曲霉(ZZH)热灭活取步骤(2)中①白曲霉原生质体悬浮液Iml于EP管中，在6(T65°C恒温水浴中灭活2(Γ30分钟，然后立即放入冰浴中完全冷却；②绿色木霉(TV)紫外灭活取步骤(2)中②绿色木霉原生质体悬浮液5ml置于带磁力搅拌子的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射；(4)融合子构建:将两亲本灭活后的原生质体悬浮液在离心管中等量混合，然后加入配比为3(Γ50%的聚乙二醇，0.0lmol/L的氯化钙和0.7^0.9mol/L氯化钠融合剂，混匀后放入恒温培养箱中于3(T32°C培养3(Γ40分钟，取出融合后原生质体悬浮液放入冷冻离心机中，用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟；将洗涤完成的原生质体重悬于0.7 0.9mol/L的氯化钠渗稳剂中，得到融合后的原生质体；(5)融合子的筛选:①融合子初筛在无菌条件下将融合完成的原生质体悬浮液稀释后涂布于淀粉再生平板中，于3(T32°C培养Γ3天，中间每隔12小时观察一次，挑选出透明圈大的融合子菌株用平板划线分离法纯化，再将分离 纯化后的融合子菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，于3(T32°C培养2 3天，挑选出能够生长的融合子(Z-TV)；②融合子复筛挑选多株上述初筛的融合子接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上，其中羧甲基纤维素钠用淀粉取代，无菌条件下于3(T32°C培养2 3天后加入碘液，挑选出淀粉利用情况好的融合子(Z-TV)，再将其接入含有无菌滤纸条的无机盐液体培养基中，于3(T32°C培养5 8天，再挑选出既能利用淀粉又能降解滤纸条的融合子，进行传代培养；
( 6 )融合子用于添加中药制曲:
将步骤(5)中得到传代稳定的融合子(Z-TV)进行扩大培养，再制成浓度为107 108 个/ml的融合子孢子悬浮液；制曲所用中药粉碎后过40目筛子；制曲大米经除杂、淘洗后蒸煮40分钟，将其摊凉后接入疒3% (v/w)的融合子孢子悬浮液和添加量为0.5 1% (w/w) 的中药粉，在无菌条件下使中药粉和融合子孢子悬浮液均匀分布于蒸米中；将蒸米堆积并加盖八层纱布，在温度36 38°C、湿度90 95%的条件下培养36 48小时，期间每隔12小时翻曲一次，再在温度3(T32°C、湿度90 95%条件下堆积培养24 36小时，培养完成后将中药曲摊平，在温度40°C、湿度50%条件下干燥15小时，即制得融合子中药曲。
上述技术方案中，所述白曲霉中加入的复合酶液为纤维素酶:蜗牛酶按7:3的比例混合溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，配成复合酶液，其浓度为10mg/ml ;以0.45 μ m滤膜过滤除菌后放置于4°C冰箱中备用。
上述技术方案中，所述绿色木霉中加入的复合酶液为溶壁酶:蜗牛酶按3:1比例混合溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，配成复合酶液，其浓度为20mg/ml ;以0.45 μ m 滤膜过滤除菌后放置于4°C冰箱中备用。
上述技术方案中，所述绿色木霉原生质体悬浮液的紫外灭活，其绿色木霉原生质体悬浮液液面距所用紫外灯垂直距离l(Tl3cm，紫外灯功率15W，其照射时间2 3分钟。
本发明中所用的白曲霉，简写为ZZH。
本发明中所用的绿色木霉，简写为TV。
本发明通过非对称灭活技术构建的霉菌融合子，简写为Z-TV。
本发明具有如下的特点及有益的技术效果:
1、本发明构建的霉菌融合子菌株同时具有糖化酶活力和纤维素酶活力，将它用于添加到中药制曲中，不仅可以提高酿造原材料中糖的转化率；而且制备的中药曲同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分。
2、本发明中霉菌融合子用于制曲后添加中药材，可以使得到的中药曲的糖化酶活力、液化酶活力有所提高。
3、使用本发明的霉菌融合子用于中药曲酿造等行业，所制得产品中含有中药材活性成分，使产品具有对人体健康有益的保健功能。
图1本发明白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、绿色木霉(TV)分解淀粉对比情况；
图2本发明白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、绿色木霉(TV)降解滤纸条对比情况。
具体实施方式
下面通过具体实 施例对本发明作进一步详细的描述，有必要在此指出的是本发明实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不应理解为是对本发明保护范围的任何限制， 该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调難iF.0
实施例1
本实施例1中，所用培养基为PDA茄子瓶培养基；液体培养基为PDA液体培养基锥形瓶；实验瓶为三角瓶；所用中药为枸杞；本发明的实施例1根据上述所述工艺步骤进行，具体操作步骤依次如下:( I)菌丝体的培养及预处理:将两亲本白曲霉(ZZH)与绿色木霉(TV)分别转接于PDA茄子瓶培养基上，待生长30小时后，用无菌水制成IO7个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300 μ L霉菌孢子菌悬液接种于50ml PDA液体培养基的250ml锥形瓶中，置于温度30°C、转数IOOrpm气浴摇床中振荡培养18小时得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经四层无菌擦镜纸抽滤，无菌水漂洗3次去除培养基,再用0.9mol/L的氯化钠渗稳剂在4°C、3000rpm的冷冻离心机中离心洗漆3次，每次5分钟，得预处理后湿菌丝体；(2)原生质体的制备:①将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于已灭菌的50ml三角瓶中，白曲霉(ZZH)按0.5g/10ml的量加入纤维素酶:蜗牛酶按7:3混合溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制成的复合酶液中，复合酶液浓度为10mg/ml，以0.45 μ m滤膜过滤除菌后放置于4°C冰箱备用，再于30°C、转数为SOrpm恒温气浴条件下进行酶解；酶解2小时后用4层无菌擦镜纸过滤，滤液于2500rpm离心机中离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉(ZZH)原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；②将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于已灭菌的50ml三角瓶中，绿色木霉(TV)按1.0g/10ml的量加入溶壁酶:蜗牛酶按3:1混合于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制成的复合酶液中，其浓度20mg/ml，以0.45 μ m滤膜过滤除菌后放置于4°C冰箱备用，于温度30°C，转数SOrpm恒温气浴条件下进行酶解；酶解3小时后用4层无菌擦镜纸过滤，滤液于2500rpm离心10 分钟，再用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉(TV)原生质体并悬于渗稳剂溶液中，即得绿色木霉原生质体悬浮液；(3)原生质体的非对称灭活:①白曲霉(ZZH)热灭活取步骤(2)中白曲霉原生质体悬浮液Iml于2ml EP管中，在60°C恒温水浴中灭活20分钟，然后立即放入冰浴中冷却；②绿色木霉(TV)紫外灭活取步骤(2)中绿色木霉原生质体悬浮液5ml移入直径5cm的培养皿中，将带磁力搅拌子的培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射，绿色木霉原生质体悬浮液面距紫外灯垂直距离10cm，紫外灯功率15W，其照射时间2分钟；(4)融合子构建:将两亲本灭活后的原生质体悬浮液在离心管中等量混合，然后加入配比为30%的聚乙二醇，0.0lmol/L的氯化钙和0.7mol/L氯化钠的融合剂，混匀后放入恒温培养箱中30 V培养40分钟，取出融合后原生质体悬浮液放入冷冻离心机中，于4 °C冷冻离心机中4000rpm离心5分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟；将洗涤完成的原生质体重悬于0.7mol/L的氯化钠渗稳剂中，得到融合后的原生质体；(5)融合子的筛选:①融合子初筛
将融合完成后的悬浮液稀释为IO4后涂布于淀粉再生平板中，30°C培养3天，中间每隔12小时观察一次，挑选出透明圈大的融合子菌株用平板划线分离法纯化；再将分离纯化后的融合子菌株用无菌牙签垂直点种于羧甲基纤维素钠培养基上，30°C培养3天，挑出能够生长的融合子(Z-TV)；
②融合子复筛
挑选多株上述初筛的融合子，挑出的融合子接种于羧甲基纤维素钠液体培养基， 其中羧甲基纤维素钠用淀粉取代，无菌条件下30°C培养3天后加入碘液，观察其中淀粉的利用情况；挑出淀粉利用情况较好的融合子，再将其接入无机盐液体培养基中，培养基中加入无菌滤纸条，30°C培养8天观察其对滤纸条的降解情况，挑选出既能利用淀粉又能降解滤纸条的融合子(Z-TV)。
表I是白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、绿色木霉(TV)分解淀粉的情况对比，通过颜色比对，表I中融合子(Z-TV)分解淀粉能力居于白曲霉(ZZH)和绿色木霉(TV)之间，为紫红蓝色。说明融合子(Z-TV)具有白曲霉(ZZH)降解淀粉的能力；图2是白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)、绿色木霉(TV)降解滤纸条所示图，从图2中可以看出，融合子(Z-TV)具有绿色木霉(TV)降解滤纸条的特性，说明融合子同时具有白曲霉产糖化酶和绿色木霉产纤维素酶的能力。
表I白曲霉(ZZH)、融合子(Z-TV)和绿色木霉(TV)分解淀粉对比
权利要求
1. 一种霉菌融合子的构建及其用于添加到中药制曲的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤(1)菌丝体的培养及预处理将两亲本白曲霉与绿色木霉分别转接于培养基上，待其生长3(Γ48小时后，用无菌水制成107 109个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300 μ L霉菌孢子菌悬液接种于液体培养基中，于温度3(T32°C，转数10(Tl20rpm的气浴摇床中振荡培养18 24小时，得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经无菌擦镜纸抽滤、无菌水漂洗去除培养基；再用O. 9mol/L的氯化钠渗稳剂在离心机中离心洗涤3次，每次5分钟，即得预处理后的湿菌丝体；(2)原生质体的制备①将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取O.5g置于50ml实验瓶中，白曲霉按·0.5^1. 0g/10ml的量加入复合酶液，于温度3(T32°C、转数8(Tl00rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解2 3小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于250(T3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；②将步骤(I)预处理后的湿菌丝体称取O.5g置于50ml实验瓶中，绿色木霉按·1.(Tl. 5g/10ml的量加入复合酶液，于温度3(T35°C、转数8(Tl00rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解3飞小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于250(T3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得绿色木霉原生质体悬浮液；(3)原生质体非对称灭活①白曲霉热灭活取步骤(2)中①白曲霉原生质体悬浮液Iml于EP管中，在6(T65°C恒温水浴中灭活 2(Γ30分钟，然后立即放入冰浴中完全冷却；②绿色木霉紫外灭活取步骤(2)中②绿色木霉原生质体悬浮液5ml置于带磁力搅拌子的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射；(4)融合子构建将两亲本灭活后的原生质体悬浮液在离心管中等量混合，然后加入配比为3(Γ50%的聚乙二醇，O. 01mol/L的氯化钙和O. ·7^0. 9mol/L氯化钠融合剂，混匀后放入恒温培养箱中于3(T32°C培养3(Γ40分钟，取出融合后原生质体悬浮液放入冷冻离心机中，用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟；将洗涤完成的原生质体重悬于O. 7 O. 9mol/L的氯化钠渗稳剂中，得到融合后的原生质体；(5)融合子的筛选①融合子初筛将融合完成后的悬浮液稀释后涂布于淀粉再生平板中，于3(T32°C培养f 3天，中间每隔12小时观察一次，挑选出透明圈大的融合子菌株用平板划线分离法纯化，再将分离纯化后的融合子菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，于3(T32°C培养2 3天，挑选出能够生长的融合子；②融合子复筛挑选多株上述初筛的融合子接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上，其中羧甲基纤维素钠用淀粉取代，无菌条件下于3(T32°C培养2 3天后加入碘液，挑选出淀粉利用情况好的融合子，再将其接入无机盐液体培养基中，加入无菌滤纸条，于3(T32°C培养51天，再挑选出既能利用淀粉又能降解滤纸条的融合子，进行传代培养； (6)融合子用于添加中药制曲 将步骤(5)中得到传代稳定的融合子进行扩大培养，再制成浓度为IO7IO8个/ml的融合子孢子悬浮液；制曲所用中药粉碎后过40目筛子；制曲大米经除杂、淘洗后蒸煮40分钟，将其摊凉后接入疒3% (v/w)融合子孢子悬浮液和添加量为0.5 1% (w/w)的中药粉，在无菌条件下使中药粉和融合子孢子悬浮液均匀分布于蒸米中；将蒸米堆积并加盖八层纱布，在温度36 38°C、湿度90 95%的条件下培养36 48小时，期间每隔12小时翻曲一次，再在温度3(T32°C、湿度90 95%条件下堆积培养24 36小时，培养完成后将中药曲摊平，在温度40°C、湿度50%条件下干燥15小时，即制得融合子中药曲。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述白曲霉中加入的复合酶液为纤维素酶蜗牛酶按7:3的比例混合溶于O. 02mol/L磷酸盐缓冲液中，配制成复合酶液，其浓度为10mg/ml ;以O. 45 μ m滤膜过滤除菌后置于4°C冰箱中备用。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述绿色木霉中加入的复合酶液为溶菌酶蜗牛酶按3:1比例混合于O. 02mol/L磷酸盐缓冲液中，配制成复合酶液，其浓度为20mg/ml ;以O. 45 μ m滤膜过滤除菌后置于4°C冰箱中备用。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述绿色木霉原生质体悬浮液的紫外灭活，其绿色木霉原生质体悬浮液液面距所用紫外灯垂直距离l(Tl3cm，紫外灯功率15W，其照射时间2 3分钟。
全文摘要
本发明涉及一种霉菌融合子构建及其用于添加中药制曲的方法，属于轻工生物技术领域。该方法是利用白曲霉产糖化酶和绿色木霉产纤维素酶能力的差异，利用非对称灭活亲本及原生质体融合方式，使双亲本原生质体融合得融合子，将该融合子用于添加中药制曲，得到同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的中曲药。该方法包括菌丝体的培养与预处理、原生质体的制备、原生质体非对称灭活、融合子构建、融合子筛选、中药制曲等工艺步骤。本发明方法操作简单，过程易于实现，得到的融合子中药曲对后续的酿造原材料中纤维素成分的利用及产品保健功能的获得具有重要的意义。
文档编号A61K36/00GK103251656SQ20131017997
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者张文学, 刘跃红, 吴正云, 李丽, 钟霞, 罗芳 申请人:四川大学