技术领域
本发明涉及金针菇蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用。
背景技术：
金针菇（Flammulinavelutipes）又名朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，金针菇属。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩，形美，味鲜，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌，具有较高的营养价值和药用价值，有广阔的开发前景。金针菇因富含蛋白质以及多种矿物质和维生素，被称为“增智菇”。
孙艳艳将其栽培技术的各环节（包括栽培季节、品种选择、培养料配制、栽培管理、采收及采后管理等内容）进行了总结，以期为金针菇栽培提供参考。为筛选栽培金针菇的优良配方，程国林等比较分析了不同配方的金针菇农艺性状和商品性状，确定了栽培金针菇适宜的高产配方。金针菇菌株的选育一直受到人们的重视，常用的紫外线诱变方法能有效地改良菌株的生产性能，应用广泛。邹正等在对紫外线、微波单因子对金针菇J05Y-C单细胞悬液的诱变效应比较研究发现，微波诱变效应优于紫外线诱变效应。金针菇具有丰富的营养和独特的药理作用，可以用于相关功能食品和药品的开发。刘学铭等综述了金针菇的营养成分、功能成分及药理作用，并对金针菇的加工工艺作了概述。杜方岭综述了金针菇多糖的结构、功能和提取方法等方面的研究进展。张家辉等对野生金针菇和栽培金针菇体内氨基酸种类和含量进行了测定和比较，结果表明，野生金针菇体内总氨基酸和游离氨基酸含量均高于栽培金针菇。朱玉昌等对运用超声辅助提取金针菇菌丝体多糖，确定了多糖提取的最佳工艺，研究还发现，超声辅助法提取金针菇菌丝体多糖明显优于水浴法。芮汉明采用微波辅助乙醇回流法成功从金针菇中提取抗氧化物质，并对提取工艺进行了比较和优化，确定了金针菇抗氧化物质提取的最佳工艺，在此工艺条件下，金针菇提取液的自由基清除率达到84.85%。然而目前，从金针菇中分离蛋白类物质，研究其体外抑制肿瘤的研究尚属空白。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题是提供具有抗肿瘤活性的金针菇蛋白质提取物。
本发明所提供的金针菇蛋白质提取物，按照包括如下步骤的方法制备：
1）将金针菇子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到金针菇水溶性提取物；
2）对所述金针菇水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀，收集沉淀，对所述沉淀用去离子水透析后，得到所述金针菇蛋白质提取物。
上述步骤1）中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。
所述金针菇子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的金针菇子实体在常温（如20-25℃）下干燥得到的。
所述新鲜金针菇子实体和水的体积比可为1：4-6，如1：4。
上述步骤1）中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。上述步骤2）中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g（如12000g），离心时间可为10-20分钟（如15分钟）。
上述步骤2）中，在4℃对所述金针菇水溶性提取物进行饱和度为80%的硫酸铵沉淀。
上述步骤2）中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。
上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g（如6000g），离心10-20分钟（如15分钟），收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成金针菇蛋白质提取物干粉的步骤。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述金针菇蛋白质提取物的用途。
本发明所提供的上述金针菇蛋白质提取物的用途，为下述A或B：
A、抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品），其活性成分为上述金针菇蛋白质提取物；
B、上述金针菇蛋白质提取物在制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品（如药物、保健品和/或食品）中的应用。
上述用途中，所述肿瘤可为实体肿瘤。
所述实体肿瘤可为肝癌、乳腺癌和/或肺癌；所述肿瘤细胞可为肝癌细胞、乳腺癌细胞和/或肺癌细胞。所述肺癌可为肺腺癌，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞。
所述肝癌细胞可为人肝癌细胞，如HepG2细胞；所述乳腺癌细胞可为人乳腺癌细胞，如MCF-7细胞；所述肺癌细胞可为人肺腺癌细胞，如A-549细胞。
上文中，所述金针菇具体可为金针菇（Flammulinavelutipes）杂交19CFCC89540。
本发明的金针菇蛋白质提取物处理人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞72h后，HepG2、MCF-7、A-549细胞的增殖均明显受到抑制，且IC50值分别为8μg/mL，8μg/mL，8μg/mL,并且抑制率均随时间延长和浓度的增加而增加；光镜下可观察细胞凋亡形态的改变。说明金针菇蛋白质提取物对HepG2、MCF-7、A-549细胞均有显著的抑制增殖作用，可用于制备抗肿瘤或肿瘤细胞的产品。
附图说明
图1为BCA蛋白定量试剂盒制作标准曲线。
图2为MTT法测定金针菇蛋白质提取物处理HepG2细胞72h后细胞凋亡情况。
图3为MTT法测定金针菇蛋白质提取物处理MCF-7细胞72h后细胞凋亡情况。
图4为MTT法测定金针菇蛋白质提取物处理A-549细胞72h后细胞凋亡情况。
图2-图4中，0、3、6、9、12、15分别表示0μg/mL组、3μg/mL组、6μg/mL组、9μg/mL组、12μg/mL组、15μg/mL组；下方的培养板从左至右的列依次为0μg/mL组、3μg/mL组、6μg/mL组、9μg/mL组、12μg/mL组、15μg/mL组；数据结果以平均数±标准差表示（n=3），经单因素方差分析，其中*表示与0μg/mL组比较具有显著性差异（*P<0.05）的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的金针菇（Flammulinavelutipes）杂交19CFCC89540，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心（中国林业微生物菌种保藏管理中心,ChinaForestryCultureCollectionCenter英文缩写CFCC，简称林业微生物中心）获得。
实施例1、金针菇蛋白质提取物的制备
1、制备金针菇子实体
将金针菇（Flammulinavelutipes）杂交19CFCC89540斜面菌种接种到一级种培养基中进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满试管后将其接种到二级种培养基中，25℃恒温培养室培养至菌丝长满，将二级种接种到装有栽培培养基的栽培袋中25℃的条件下进行发菌，菌种长满栽培袋后进行搔菌并移入温室大棚，出菇条件保持湿度在90%以上，温度为10-15℃，收集第一潮子实体，得到金针菇（Flammulinavelutipes）杂交19CFCC89540子实体。
其中，该实验所用的培养基如下：
一级种培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉，3gKH2PO4,10mg维生素B1,5g蛋白胨，1.5gMgSO4，1000mL蒸馏水，经121℃，30min高压灭菌。
二级种培养基：棉籽壳80%，麸皮18%，石膏1%，糖1%.，料水比为1:1，经121℃，30min高压灭菌。
栽培培养基：棉籽壳38%，豆秸20%，玉米芯20%，麸皮20%，石灰2%，料水比为1:1。经121℃，30min高压灭菌。
2、制备金针菇水溶性提取物
用4倍体积的去离子水浸泡步骤1的新鲜金针菇（Flammulinavelutipes）杂交19CFCC89540子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提（即静置）12h后，12000g离心15min，收集上清溶液，该上清溶液即为金针菇水溶性提取物。
3、制备金针菇蛋白质提取物
在4℃向步骤2的金针菇水溶性提取物中加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的饱和度为80%，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻干燥36小时，得到金针菇蛋白质提取物，作为抑制肿瘤细胞增殖药物。
实施例2、金针菇蛋白质提取物抑制肿瘤细胞增殖实验
1.1供试细胞株
人肝癌HepG2细胞（购自美国ATCC）、人乳腺癌MCF-7细胞（购自美国ATCC）和人肺腺癌A-549细胞（购自美国ATCC）。
1.2实验方法
1.2.1细胞系及细胞培养
人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞按照常规培养方法进行活化和传代。其中，人肝癌HepG2细胞的传代和活化培养基是DMEM-高糖+1%双抗+10%FBS（在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的传代和活化培养基是RPMI1640+1%双抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前两者最终体积百分含量为1%，FBS的体积百分含量为10%得到的培养液）。
1.2.2细胞活性检测
采用噻唑蓝比色法（MTT）检测实施例1的金针菇蛋白质提取物对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的抑制活性，具体方法如下：
本实验选用步骤1.2.1的P8代（第8代）细胞，以每孔7×103个/mL细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，随机选18孔细胞分为6组，一个对照组和5个实验组，分别为0μg/mL组（对照组），3μg/mL组，6μg/mL组，9μg/mL组，12μg/mL组，15μg/mL组。每组三孔细胞。0μg/mL组的每孔细胞中加入200μL无血清培养液，3μg/mL组每孔加入200μL金针菇蛋白质提取物浓度为3μg/mL的含金针菇蛋白质提取物培养液；6μg/mL组每孔加入200μL金针菇蛋白质提取物浓度为6μg/mL的含金针菇蛋白质提取物培养液；9μg/mL组每孔加入200μL金针菇蛋白质提取物浓度为9μg/mL的含金针菇蛋白质提取物培养液；12μg/mL组每孔加入200μl金针菇蛋白质提取物浓度为12μg/mL的含金针菇蛋白质提取物培养液；15μg/mL组每孔加入200μL金针菇蛋白质提取物浓度为15μg/mL的含金针菇蛋白质提取物培养液。加完培养液在37℃培养72h后，每孔加入200μLMTT工作液（无菌水配制的5mg/mLMTT溶液：无血清培养液=1:9（体积比）避光继续培养4h，小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加200μLDMSO（二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分融解。用酶标仪在560nm波长处测吸光度，以对照组的细胞存活率为100%，计算实验组细胞的存活率：实验组细胞存活率=OD（实验组）/OD（对照组）%。各组细胞的凋亡率=100%-各组细胞的存活率。实验重复三次。
试验所有数据采用SPSS12.0（SPSSInc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。根据各组细胞的凋亡率计算金针菇蛋白质提取物对每种癌细胞的IC50值（使癌细胞的凋亡率为50%的含金针菇蛋白质提取物培养液中金针菇蛋白质提取物浓度）。
其中，人肝癌HepG2细胞的无血清培养液是DMEM-高糖+1%双抗；3μg/mL组，6μg/mL组，9μg/mL组，12μg/mL组，15μg/mL组中每孔加入的含金针菇蛋白质提取物培养液分别是向DMEM-高糖+1%双抗中加入金针菇蛋白质提取物母液得到的金针菇蛋白质提取物浓度分别为3μg/mL，6μg/mL，9μg/mL，12μg/mL，15μg/mL的液体。DMEM-高糖+1%双抗是在DMEM-高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。
人乳腺癌MCF-7细胞和人肺腺癌A-549细胞的无血清培养液是RPMI1640+1%双抗；3μg/mL组，6μg/mL组，9μg/mL组，12μg/mL组，15μg/mL组中每孔加入的含金针菇蛋白质提取物培养液分别是向RPMI1640+1%双抗中加入金针菇蛋白质提取物母液得到的金针菇蛋白质提取物浓度分别为3μg/mL，6μg/mL，9μg/mL，12μg/mL，15μg/mL的液体。RPMI1640+1%双抗是在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素和链霉素混合液（青霉素10000U/mL、链霉素10000μg/mL）使二者最终体积百分含量为1%的无血清培养液。
上述金针菇蛋白质提取物母液均是用各种细胞的相应无血清培养液溶解实施例1制备的金针菇蛋白质提取物，配制成蛋白质含量为100μg/ml的金针菇蛋白质提取物水溶液。
其中，金针菇蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量的测定方法如下：
1）标准曲线的制作：利用标准样品小牛血清蛋白（BSA）配置成不同浓度的蛋白溶液，采用BCA（北京博迈德科技公司）蛋白定量试剂盒制作标准曲线（图1）。
2）采用BCA蛋白定量试剂盒测定金针菇蛋白质提取物水溶液中蛋白质含量，该蛋白质含量即为金针菇蛋白质提取物水溶液中金针菇蛋白质提取物浓度。
2实验结果及分析
2.1金针菇蛋白质提取物抗肿瘤活性检测结果
MTT法测定结果表明，实施例1的金针菇蛋白质提取物对三株癌细胞均有抑制作用，抑制率均表现出剂量依赖性，与对照组相比，随着金针菇蛋白质提取物浓度的增加，HepG2细胞、MCF-7细胞和A-549细胞的凋亡率均增高，且IC50值分别为8μg/mL，8μg/mL，8μg/mL；光镜下可观察到细胞凋亡形态的改变。具体抑制效果见表1。
表1金针菇蛋白质提取物对三株癌症细胞体外抑制率