高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用的制作方法
【专利摘要】高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用，涉及水产养殖。所述高空芽孢杆菌Bacillus?altitudinis1A08373的保藏编号为CCTCC?NO：M2013292，分离自印度洋深海表层沉积物，可用于制备高空芽孢杆菌制剂，所述高空芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。所制得的高空芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×109CFU/mL，最高可达到1×1010CFU/mL以上。提高对虾消化道酶活，促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。
【专利说明】高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖，尤其是涉及ー种应用于对虾养殖的制剂，具体是由高空芽孢杆菌制成的制剂在抑制弧菌，促进对虾生长，增强对虾抗病力，防治对虾弧菌病中的应用。
【背景技术】
[0002]集约化、高密度水产养殖的迅猛发展,使养殖生态环境遭到严重破坏,水产养殖病害越来越复杂，发病率越来越高，危害越来越严重，抗生素饲料添加剂的使用量日益増加。2010年，全国水产养殖面积764万公顷，其中有24万公顷遭受病害，产量损失近30万吨。在95%养殖面积中，为了防止疾病发生，生产中盲目、大規模地投放各类抗生素，如氯霉素、土霉素、呋喃唑酮等。氯霉素直接加入水中，土霉素拌饲料投喂或直接泼洒养殖水体。2000年抗生素用量约为16200吨，约70%用于畜牧业和水产养殖业。由于药物滥用、药物残留和细菌耐药性等问题日趋严重，引发了人们对食品和环境安全的关注。寻找ー种新型、安全、緑色的抗生素替代品成为当前水产研究的热点之一，其中益生菌因其具有抑菌、促生长、提高免疫等作用日益受到重视。
[0003]微生态制剂是通过“以菌治菌”达到防治水产养殖动物病害的目地。一方面，通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质来抑制或者杀灭病原菌，同时在养殖水体和养殖动物肠道中与病原菌竞争营养，占据生态位，形成优势菌群，达到防治病害的目的。另一方面，有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪的代谢，提高饲料的利用率和转化率，达到减少资 源消耗和增产的目的。
[0004]中国专利CN101993843A公开ー种坚强芽孢杆菌菌株及其应用。坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)SSL065菌株，保藏编号为:CCTCC NO:M2010192。该菌株制备的坚强芽孢杆菌SSL065菌粉，可用于增强对虾细胞和体液的免疫水平。该发明的坚强芽孢杆菌SSL065菌株筛选自对虾消化道，是ー种内源性的菌株，具有明显的提高养殖对虾非特异性免疫水平，大大增强养殖对虾抗病原菌感染力，特别是可以显著提高对虾抵御病毒病原感染能力等多种生物学功能。
[0005]中国专利CN102586144A公开ー种短小芽孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号:CCTCC NO:M2011411o该发明的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)LV149具有强的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作为发酵菌株，经固态发酵、干燥粉碎制得以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV149作为活性成分的短小芽孢杆菌益生菌制剂,将其添加到对奸饲料中，饲喂对虾，不仅可以起到抑制对虾肠道病原弧菌生长、減少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数、提高商品品质、缩短养殖周期，从而减少养殖风险、降低养殖成本，且生物安全性高，在水产养殖中具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供ー种对于对虾弧菌病害具有较好防治效果、井能促进对虾生长的高空芽抱杆菌Bacillus altitudinislA08373o
[0007]本发明的另ー目的在于提供高空芽孢杆菌在对虾养殖中的应用。
[0008]所述高空芽抱杆菌Bacillus altitudinislA08373已于2013年06月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学；保藏编号:CCTCC NO:M2013292。
[0009]高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373是从印度洋深海表层沉积物分离获得，高空芽抱杆菌Bacillus altitudinislA08373具有下述特征:
[0010]1、形态特征:高空芽孢杆菌 Bacillus altitudinislA08373CCTCC NO:M2013292为杆状，大小为(0.3~0.6) UmX (1.2~1.9) U m，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。在2216E固体培养基上28 °C培养48h，菌落呈白色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，菌落直径大小约为2~3mm。
[0011]2、生理生化特征:菌株生长盐度范围为0~15%，18%以上不生长，最适范围为1%~5%;生长pH范围为5~12，最适范围为6~8。氧化酶( + )，接触酶( + )，硝酸盐还原(-)，吲哚试验(_)，不能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化( + )，尿素酶(_)，^ -葡萄糖苷酶( + ), (6-半乳糖苷酶( + )，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-こ酰-葡萄糖胺、苹果酸、梓檬酸，不能利用麦芽糖、癸酸、己二酸、苯こ酸。
[0012]API ZYM结果显示，高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、a-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、(6-葡(萄)糖苷酶，a -甘露糖苷酶，不具有脂肪酶、缬氨酸氨肽酶、胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、a -半乳糖苷酶、^ -半乳糖苷酶、P -葡(萄)糖苷酸酶、a -葡(萄)糖苷酶、N-こ酰-葡萄糖胺酶、a -岩藻糖苷酶等酶活性。
[0013]3、16S rRNA、pyrE和aroE基因序列分析:按照常规方法抽提高空芽孢杆菌(Bacillus altitudinis) 1A08373 的基因组 DNA,并对 16S rRNA、pyrE 和 aroE 基因序列进行測定，高空芽孢杆菌1A08373的16S rRNA、pyrE和aroE基因序列如SEQ ID N0.USEQ IDN0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。
[0014]经BLAST 比对分析，高空芽抱杆菌 Bacillus altitudinislA08373 与Bacillusaltitudini41KF2b (T)的 16S rDNA 序列同源性为 99.93%,与 B.pumilusATCC7061(T)的 16S rDNA 序列同源性为 99.67%,与 B.safensis F0_036b (T)的 16SrDNA序列同源性为99.54%。pyrE基因序列的比对结果表明，高空芽孢杆菌BaciIIusaltitudinislA08373 与 B.altitudini41KF2b (T)、B.pumilus ATCC7061 (T)和 B.safensisF0-036b (T)三株模式种的同源性分别为98.53%,85.53%和83.70%。aroE基因序列的比对结果表明，高空芽抱杆菌 Bacillus altitudinislA08373 与 B.altitudini41KF2b (T)、B.pumilus ATCC7061(T)和 B.safensis F0_036b (T)三株模式种的同源性分别为 98.53%、85.89% 和 86.67%。
[0015]综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rRNA、pyrE和aroE基因序列分析结果，本发明的菌株1A08373鉴定为高空芽孢杆菌，具体为高空芽孢杆菌1A08373(CCTCC NO:M2013292)。
[0016]本发明的高空芽孢杆菌(Bacillus altitudinis) 1A08373对致病性弧菌有显著的抑菌效果，对对虾生长有明显的促进作用。本发明的高空芽孢杆菌BacillusaltitudinislA08373能产生蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等，并且具有较强的活性。
[0017]本发明的高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373对哈维氏弧菌SF1、坎贝氏弧菌VH1、鳗弧菌W1、副溶血弧菌1937、欧文氏弧菌VH2、需钠弧菌FS-1等对虾致病性弧菌具有广泛的抑制性。
[0018]本发明的高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373在提高对奸抗病力、促进对虾生长方面有显著效果。在用致病性坎贝氏弧菌VHl浸浴感染对虾的实验中发现，添加高空芽孢杆菌1A08373的实验组对虾存活率显著高于对照组，提高了 32%。将高空芽孢杆菌1A08373进行液体发酵，以107cfu/g (每g饲料的活菌含量)的浓度添加至饲料中投喂南美白对虾，同时以IO5CfuAiL (每毫升海水的活菌含量)的浓度泼洒至养殖水体中，结果发现，经过30天的饲养，投喂添加了高空芽孢杆菌1A08373饲料的实验组与不添加益生菌的对照组相比，对虾平均体重增长率提高了 18.7%，益生菌1A08373实验组的对虾肠道胰蛋白酶和脂肪酶均显著高于对照组(P〈0.05)。弧菌含量动态监测结果表明，1A08373实验组的养殖海水中弧菌含量低于对照组；菌株1A08373能在养殖海水和对虾肠道中存活,养殖海水中检测到的活菌含量在IO4CfuAiL以上，对虾肠道中芽孢杆菌含量在104cfu/g以上。
[0019]所述高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373可用于制备高空芽孢杆菌制剂，所述高空芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剤、对虫下养埴水质改良剂中的ー种。
[0020]所述高空芽孢杆菌制剂的制备方法的具体步骤为:将高空芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) 1A08373按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方(W/V):豆饼粉3%，淀粉1.5%，玉米浆1%，葡萄糖 0.5%, (NH4)2SO410Z70, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%, NaH2PO40.5%, MgSO40.05%, MnSO40.05%。
[0021]所制得的高空芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于lX109CFU/mL，最高可达到
IX 1010CFU/mL 以上。
[0022]所述高空芽孢杆菌制剂按对虾饲料重量的0.5~5%添加。
[0023]所述高空芽孢杆菌制剂在养殖水体中的接种浓度为IO3~104cfu/mL。
[0024]本发明所述高空芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)lA08373对水产养殖病原弧菌具有广泛抑制性。以高空芽孢杆菌1A08373发酵液作为活菌制剂，泼洒到养殖水体/添加到饲料中饲喂对虾，可以起到抑制养殖水体中病原弧菌的繁殖，提高对虾消化道酶活，促进对虾生长，提高对虾抗病力，減少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的増加具有很好的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373的胞外酶活检测图。1、蛋白酶；2、脂肪酶；3、纤维素酶。
[0026]图2为高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373抑菌活性检测图。1、指示菌:坎贝氏弧菌VHl ;2、指示菌:哈维氏弧菌SFl。
[0027]图3为高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373发酵上清液对坎贝氏弧菌VHl生长的抑制。在图3中，?为对照:VH1，为处理:VH1+1A08373。[0028]图4为养殖水体中弧菌含量的动态监测。在图4中，标记为1A08373，为空白对照。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例将结合附图对本发明作进ー步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述的实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0030]实施例1高空芽孢杆菌的分离、鉴定和抑菌谱測定
[0031](I)菌株分离:在无菌超净台中取印度洋深海沉积物样品lg，加入9ml无菌生理盐水(0.9%NaCl)制成悬浮液，依次10倍梯度稀释至lO'lO'lO—4，取梯度稀释液IOOy L涂布Marine Agar固体培养基(2216E培养基)，28°C培养48h后，挑取单菌落划线纯化，分离获得菌株BS1，保藏至中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号为MCCC1A08373。
[0032](2)菌株的生理生化特征和分子鉴定
[0033]形态特征:高空芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) 1A08373CCTCC NO:M2013292为杆状，大小为(0.3~0.6) mX (1.2~1.9) m，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。在2216E固体培养基上28 °C培养48h，菌落呈白色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，菌落直径大小约为2~3mm。
[0034]生理生化特征:菌株生长盐度范围为0~15%，18%以上不生长，最适范围为1%~5% ;生长pH范围为5~12，最适范围为6~8。氧化酶(+ )，接触酶(+ )，硝酸盐还原(-)，吲哚试验(-)，V.P试验( + )，不能发酵D-葡萄糖产酸，明胶液化( + )，尿素酶(-)，(6-葡萄糖苷酶( + )，(6-半乳糖苷酶( + )，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、苹果酸、柠檬酸，不能利用麦芽糖、癸酸、己二酸、苯こ酸。菌株1A08373和模式种Bacillus altitudini41KF2b (T)部分生理生化特性见表1。
[0035]API ZYM结果显示，菌株1A08373具有碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸氨肽酶、a-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、(6-葡(萄)糖苷酶，a-甘露糖苷酶，不具有脂肪酶、缬氨酸氨肽酶、胱氨酸氨肽酶、胰蛋白酶、a -半乳糖苷酶、^ -半乳糖苷酶、P -葡(萄)糖苷酸酶、a -葡(萄)糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、a -岩藻糖苷酶等酶活性。
[0036]分子鉴定:按照常规方法抽提高空芽孢杆菌(Bacillus altitudini) 1A08373的基因组DNA，并对16S rRNA,pyrE和aroE基因序列进行測定，高空芽孢杆菌1A08373的16SrDNA、pyrE 和 aroE 基因序列如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。
[0037]经BLAST 比对分析，高空芽抱杆菌(Bacillus altitudini) 1A08373 与Bacillusaltitudini41KF2b (T)的 16S rDNA 序列同源性为 99.93%,与 B.pumilusATCC7061(T)的 16S rDNA序列同源性为 99.67%，与 B.safensis F0_036b (T)的 16S rDNA序列同源性为99.54%。pyrE基因序列的比对结果表明，1A08373与B.altitudini41KF2b (T)、B.pumilus ATCC7061 (T)和 B.safensis F0-036b (T)三株模式种的同源性分别为 98.53%85.53% 和 83.70%o aroE 基因序列的比对结果表明，1A08373 与 B.altitudini41KF2b (T)、B.pumilus ATCC7061 (T)和 B.safensis F0-036b (T)三株模式种的同源性分别为 98.53%85.89% 和 86.67%。
[0038]综合菌株的形态特征、生理生化特性以及16S rRNA、pyrE和aroE基因序列分析结果，本发明的菌株1A08373鉴定为高空芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为 CCTCC NO:M2013292。高空芽孢杆菌 1A08373 的 16S rDNA、pyrE和 aroE 基因基因序列如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3。
[0039]表1:沙福芽孢杆菌1A07588的生理生化特性
【权利要求】
1.高空芽孢杆菌，其特征在于为高空芽孢杆菌BacillusaltitudinislA08373，已于2013年06月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学；保藏编号:CCTCC NO:M2013292o
2.如权利要求1所述高空芽孢杆菌在制备高空芽孢杆菌制剂中的应用，所述高空芽孢杆菌为高空芽抱杆菌Bacillus altitudinislA08373o
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述高空芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的ー种。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述高空芽孢杆菌制剂的制备方法的具体步骤为:将高空芽孢杆菌Bacillus altitudinislA08373按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方，W/V:豆饼粉 3%,淀粉 1.5%,玉米浆 1%,葡萄糖 0.5%, (NH4)2S041%, NH4Cl0.1%, KH2PO40.05%,NaH2PO40.5%, MgSO40 .05%, MnSO40.05%。
【文档编号】A61K35/74GK103497907SQ201310333942
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】邵宗泽, 王丽萍 申请人:国家海洋局第三海洋研究所