双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供的双特异性抗体是由一个完整抗体融合单链可变区片段（scFv）组成的，这两部分具有不同的抗原或抗原决定簇的特异性，完整抗体部分含有抗体恒定区或其修饰产物。在特定的实施方式中，完整抗体部分靶向表皮生长因子受体EGFR，单链可变区片段抗体部分靶向血管内皮生长因子VEGF。
【专利说明】双特异性抗体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及双特异性抗体，还涉及所述双特异性抗体的免疫偶联体、制备方法和 含有所述偶联体的药物组合物及其用途。 技术背景
[0002] 双特异性抗体（BsAb)或双特异性单克隆抗体（BsMAb)是由两种不同的抗体片段 构成的一种人工蛋白质。由于包含两种不同的抗原结合域，一个双特异性抗体能够识别和 结合两个不同的抗原或两个不同的抗原表位。在肿瘤免疫治疗中，双特异性抗体能够同时 结合肿瘤细胞表面受体和细胞毒性细胞表面的受体，如CD3,将细胞毒性细胞靶向到肿瘤细 胞，进而杀伤肿瘤细胞。
[0003] 双特异性抗体在各方面都面临着挑战。首先，他们难以工业化生产。更重要的是， 这类人工蛋白质在体外和体内的稳定性通常不高。当一个蛋白质中具有两个空间上非常接 近的抗原结合域，这两个抗原结合域能否保留彼此的结合活性是最需要关注的一个问题。
[0004] 为了克服工业化生产困难，第一代双特异性单克隆抗体，也被叫做三功能性抗体， 已经开发出来了。它是由两条重链和两条轻链组成，每条重链和轻链都来自于两个不同的 抗体。两个Fab区域靶向两个抗原。Fc区域则是由这两条重链共同组成，形成第三个结合 位点，因此得名三功能性抗体。
[0005] 其他类型的双特异性抗体也已被设计出来用于解决某些特定问题，例如半衰期 短、免疫原性和细胞因子释放引起的副作用。这些方法包括只有Fab区域的化学偶联Fabs， 以及各种类型的二价和三价的单链式可变区片段（scFvs)，模拟两个抗体可变区结构域的 融合蛋白。
[0006] 在过去的一段时间内，其他类型的重组抗体形式也一直在发展，例如通 过融合一个IgG抗体和单链结构域而形成的四价双特异性抗体(参见Coloma,M. J.等，NatureBiotechl5 (1997) 159-163;W02001/077342 和Morrison,S.L·，Nature Biotech25(2007)1233-1234)。
[0007] 同时其他几种新的形式也被开发出来，其中抗体核心结构（IgA、IgD、IgE、 IgG或IgM)不再保留，如二价、三价或四价抗体，小分子抗体，单链形式抗体（scFv， Bis-scFv)，它们都能够绑定两个或更多的抗原（Holliger,Ρ·等，NatureBiote ch23 (2005) 1126-1136;Fischer,N.,Leger,0.,Pathobiology74 (2007) 3-14;Shen ，J.等，JournalofImmunologicalMethods318(2007)65_74;Wu，C·等，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
[0008] 所有这些形式都是使用连接子来融合抗体核心部分（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和 另一个结合蛋白（如scFv)，例如融合两个Fab片段，或者scFvs(Fischer,N.，Leger, 0.，Pat hobiology74 (2007) 3-14)。其中通过维持与天然抗体的高相似性来保留抗体效应功能是非 常重要的，比如补体依赖细胞毒性（⑶C)或抗体依赖细胞的细胞毒性（ADCC)，这些都是通 过Fc受体结合介导的。
[0009] 专利W02007/024715报道了双可变结构域免疫球蛋白，该蛋白为多价和多特异性 结合蛋白。美国专利6897044报道用于制备具有生物活性的抗体二聚体的方法。美国专利 7129330报道至少具有四个通过肽连接子连接的可变结构域的多价F.sub.V抗体。在专利 US2005/0079170中报告二聚体和多聚体的抗原结合结构。美国专利6511663报道了三或四 价单特异性抗原结合蛋白，其包括3个或4个通过共价键连接的Fab片段，该蛋白不是天然 的免疫球蛋白。专利W02006/020258报道了可以在原核和真核细胞中高效表达的四价双特 异性抗体，用于治疗和诊断。专利US2005/0163782报道了从两种类型的多肽二聚体的混合 物中分离或选择性地合成至少由一个链间二硫键连接的二聚体和不是至少由一个链间二 硫键连接二聚体的方法。美国专利5959083报告了四价双特异性受体。专利W02001/077342 中报道了具有三个或更多抗原结合位点官能团的工程抗体。
[0010] 专利W01997/001580报道了具有多特异性和多价抗原结合的多肽。专利W01992/004053报道了一种同合物，通过合成交联共价连接具有相同的抗原决定簇的IgG 类单克隆抗体制备而成。专利W01991/06305报道了具有高抗原亲和力的IgG类低聚化单克 隆抗体，分泌表达两个或两个以上的免疫球蛋白单体，这些单体交联在一起以形成四价或 六价的IgG分子。美国专利6350860报道了羊源抗体和工程抗体的构建，可以用于治疗干 扰素Y活性相关疾病。专利US2005/0100543报道了双特异性抗体多价靶向载体的构建， 即靶向构建的每个分子可以作为两个或更多的双特异性抗体的载体。专利W01995/009917 报道了基因工程四价双特异性抗体。专利W0109254/2007报道了一种稳定结合分子，该分 子具有一个稳定的scFv。
[0011] 表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor;EGFR)是一种由 1186 个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白。在多种人实体瘤中EGFR基因都存在着过度扩增和表达。 多年来的研究结果显示，EGFR的这种过度表达与肿瘤的形成、发生和发展有着密切的关系。 因此，表皮生长因子受体（EGFR)已成为近二十年来最热门的抗肿瘤药物开发靶点之一。
[0012] 针对EGFR靶点有两类药物被开发。一类是针对EGFR胞外区的单克隆抗体，这一 类药物以已经上市的产品：爱必妥、帕尼单抗、尼妥珠单抗为代表；一类是针对胞内酪氨酸 激酶活性区的小分子激酶抑制剂，这一类药物以已经上市的产品：易瑞沙（Iressa)、吉非 替尼（erlotinib)为代表。这两类药物在临床应用中取得不错的效果，但也存在一个共同 的缺点：部分患者易产生耐药性或者说EGFR表达阳性的患者只有一部分受益，并且效果有 限。产生这种耐药性的原因是部分患者体内的KRAS基因发生突变，这样，虽然抗体或小分 子抑制剂阻止了EGFR胞内酪氨酸激酶的激活，但突变的KRAS蛋白使GTPase-直处于活性 状态，持续激活MAPK信号，产生了不依赖EGFR激活的MPK信号通路。
[0013] 多种疾病的发病机制都与血管生成有关，包括实体瘤、眼内新生血管综 合征，如增殖性视网膜病或年龄相关性黄斑变性（AMD)，类风湿关节炎和牛皮癣等 (Folkman，J.等，J.Biol.Chem. 267 (1992) 10931-10934;Klagsbrun，M.等，AnnuRev. Physiol. 53 (1991) 217-239)。血管生成能够使肿瘤细胞比正常细胞获得更大的生长 优势，实现自主增殖。人血管内皮生长因子（VEGF/VEGF-A)负责调控正常的和非正 常的血管生成以及与肿瘤和眼内疾病相关的新生血管生成（Ferrara,N.等，Endocr. Rev. 18(1997)4-25;Berkman，R.A.等，J.Clin.Invest. 91 (1993) 153-159;Brown，L. F.等,HumanPathol. 26 (1995) 86-91 ;Brown,L.F.等,Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735;Mattern,J.等，Brit.J.Cancer. 73 (1996) 931-934;和Dvorak,Η· 等，Am.J.Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。
[0014] VEGF是一种同型二聚体的糖蛋白，具有高度特异性的血管内皮细胞的促有丝分裂 活性，负责调控胚胎血管生成以及成年体内的血管生成（Carmeliet,P.等，Nature, 380 (199 6) 435-439;Ferrara,Ν·等，Nature, 380 (1996) 439-442;Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.，18 (1997) 4-25)。VEGF发挥着非常重要的功能，研究显示在灭活一个VEGF等位基因会 由于脉管生成失败而导致的胚胎致死（Carmeliet,P.等，Nature, 380 (1996) 435-439;Ferra ra,Ν·等，Nature, 380 (1996) 439-442)。
[0015] VEGF对单核细胞具有较强的趋化活性，在血管内皮细胞中可诱导血纤维蛋白溶酶 原活化因子以及纤溶酶原激活物抑制因子，并诱导微血管通透性，因此也被称为血管通透 因子（VPF)(参见Ferrara,N.等，J.CellularBiochem.，47 (1991) 211-218 和Connolly,J. CellularBiochem. ,47 (1991) 219-223)。VEGF基因通过可变剪切可产生5种异构体。
[0016] 在小鼠模型中，抗VEGF的中和抗体能够抑制多种肿瘤的生长（Kim,I.等，Nature 362(1993)841-844;Warren，S.R.等，丄（：1111.1鮮68七.95(1995) 1789-1797;8〇邝8^'〇111，？· 等，CancerRes. 56 (1996) 4032-4039;和Melnyk, 0·等，CancerRes. 56 (1996) 921-924)。 W094/10202、W098/45332、W02005/00900 和W000/35956 专利中提及到抗VEGF抗体。人源 化的单克隆抗体贝伐珠单抗(商品名Avastin)是临床上用于治疗肿瘤的抗VEGF单克隆抗 体（TO98/45331)。
[0017] 贝伐珠单抗联合氟尿嘧啶为基础的化疗方案，用于转移性结直肠癌的一线治疗。 西妥昔单抗，抗表皮生长因子受体（EGFR)的嵌合型IgGl单克隆抗体，作为单药治疗和联合 伊立替康治疗伊立替康耐药患者均有效。由此推测在卡培他滨、奥沙利钼、贝伐珠单抗联合 治疗中加入西妥昔单抗，同时阻断EGFR和VEGF的功能，一线治疗转移性结直肠癌（CAIR02 试验）患者会取得较好的疗效。
[0018] 然而，西妥昔单抗和贝伐珠单抗两个封闭抗体联合治疗组的整体生存期和反应率 并没有改善。西妥昔单抗治疗带有KRAS基因突变肿瘤的患者与西妥昔单抗治疗野生型 KRAS肿瘤的患者（Tol，J.等，NEnglJMed. 360(2009)563-572)相比，无进展生存期（PFS) 明显下降。
[0019] 帕尼单抗是全人源抗体，靶向表皮生长因子受体，批准用于治疗转移性结直 肠癌（mCRC)患者，在另一项试验中，通过添加贝伐珠单抗和化疗(奥沙利钼和伊立替 康）作为第一线治疗评估转移性结直肠癌，也得到类似的数据。贝伐珠单抗与奥沙利钼 或伊立替康为基础的化疗联合治疗中加入帕尼单抗会导致毒性增加，减少PFS。在临 床实践中，这些简单的药物组合不推荐用于治疗转移性结直肠癌（Hecht，J.等，JClin Oncol. 27 (2009) 672-680)。因此，通过靶向化学分子到肿瘤组织，同时阻断VEGF和EGFR的 信号转导通路，显然是一个更好的治疗实体肿瘤的方法。
[0020] 据报道，同时靶向VEGF和EGFR的人源结构域抗体是以双靶标IgG 抗体分子（DT-IgG抗体）的形式直接作用于两个抗原（Zhang,H.等，IntJ Cancer. 131 (2012) 956-69)。该DT-IgG抗体如西妥昔单抗一样有效地抑制EGFR阳性细胞的 生长，阻止EGFR的激活和诱导细胞凋亡，如贝伐珠单抗一样有效地中和VEGF。然而，DT-IgG 的形式是以单个结构域为基础的，半衰期很短，因此不适合用于治疗癌症。
【发明内容】
[0021] 一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包括一个由两条轻链和两条重链组成 的完整抗体，其特征在于，两条重链与单链可变结构域（SCFv)融合，其特征在于，所述完整 的抗体对第一抗原表位或抗原有特异性结合，而scFv对不同于第一个抗原表位或抗原的 第二个抗原表位或抗原有特异性结合。
[0022] -方面，完整抗体和/或scFv对肿瘤抗原有特异性结合。肿瘤抗原选自下列组成， 包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、 CIX、PSMA、folate-结合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、aVP3、a5Pl、ERBB2、 ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和Tenascin。
[0023] 在一个实施例中，提供了一种双特异性抗体，其包含（a)第一和第二条多肽，每一 个都包括一个免疫球蛋白轻链；以及（b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端都 包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域（scFv)，其特征在于每个所述第一和第二条 多肽，与来自第三和第四条多肽的N末端可变区形成抗原结合位点，能够特异性识别EGFR; 其特征在于，每一个scFv能够特异性地识别VEGF。
[0024] 在一个实施例中，提供了一种双特异性抗体，其包含（a)第一和第二条多肽，每一 个都包括一个免疫球蛋白轻链；以及（b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端 都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域（scFv)，其特征在于每个所述第一和第二 条多肽，与来自第三和第四条多肽的N末端的可变区形成抗原结合位点，能够特异性识别 VEGF的抗原结合位点；其特征在于，每一个scFv能够特异性地识别EGFR。
[0025] 在一些方面，第一和第二多肽的氨基酸序列为SEQIDNO: 1或者与SEQIDNO: 1 具有至少90%相似性。在一些方面，第三和第四多肽具有SEQIDNO: 2氨基酸序列或者与 SEQIDNO: 2具有至少90%相似性。
[0026] 在一个实施例中，提供了一种由两条轻链和两条长链组成的双特异性抗体，轻链 的氨基酸序列为SEQIDNO: 1，长链氨基酸序列为SEQIDNO: 2。
[0027] -方面，提供了一个双特异性抗体，该抗体包含由两条轻链和两条重链组成的完 整抗体，这里的两条重链由IgGl的恒定区构成，并且C末端融合了一个单链可变区结构域 scFv，这里完整的抗体具有EGFR特异性，而scFv具有VEGF特异性。
[0028] 在一些方面中，该抗体与类美登素化合物偶联，具有式la、Ib或Ic结构，
【权利要求】
1. 一种双特异性抗体，其包含： (a)第一和第二条多肽，每一条多肽都包括一个免疫球蛋白轻链；以及（b)第三和第 四条多肽，每一条多肽从N末端到C-末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域 (scFv), 其特征在于每个所述第一和第二条多肽，与第三和第四条多肽的一个重链可变区形成 特异性地识别EGFR的抗原结合位点；每一个scFv能够特异性地识别VEGF。
2. 根据权利要求1的抗体，第一和第二条多肽具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列或者与SEQ ID NO: 1具有至少90%相似性。
3. 根据权利要求1或2的抗体，第三和第四条多肽具有SEQ ID N0:2氨基酸序列或者 与SEQ ID NO: 2具有至少90%相似性。
4. 一种双特异性抗体，由两条轻链和两条长链组成，其中轻链的氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 1，长链氨基酸序列包含有SEQ ID NO: 2。
5. -种双特异性抗体，该抗体包含由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，其中重链 的恒定区与一个单链可变结构域（scFv)融合形成一条长链，这里完整的抗体具有EGFR特 异性，而一个单链可变结构域scFv具有VEGF特异性。
6. 权利要求1-5中任一项的抗体，该抗体与类美登素化合物偶联，具有式la、Ib或Ic 结构，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物， 其中 X为氢或卤素； Y选自氢J1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(=0) R5 ; R1 选自 H、OH、OC (=0) R5 和 OR5 基团； R2为H或C1-C6烷基； R3 为甲基、-CH2OH 或-CH2OC (=0) R6 ; R4 为-OH 或-SH ; R5为C1-C6烷基或苄基； R6为C1-C6烷基、苯基或苄基； R7为氢或氨基酸侧链； R8为氢或者CV6烷基； n 为 0、1、2、3、4、5、6、7 或者 8。 P 为 3、4、5、6、7、8、9 或者 10 ; BsAb为双特异性抗体。
7. 根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述类美登素的化合物通过一个连接子 与双特异性抗体连接，该连接子具有酸稳定性，肽酶组织蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫 键。
8. -种组合物，其含有第一条多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO :1和第二条多肽，其 含有氨基酸序列SEQ ID NO :2。
9. 一种多聚核苷酸，具有编码SEQ ID NO :2中氨基酸的核苷酸序列或与SEQ ID NO :2 具有至少90%的氨基酸序列一致性。
10. -种转基因细胞，其含有如权利要求9所述的多聚核苷酸。
11. 权利要求1-7中任一项所述的抗体在制备治疗EGFR阳性的癌症患者的药物中的应 用。
12. -种双特异性抗体，其包括一个由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，其特征在 于，两条重链与单链可变结构域（scFv)融合，其特征在于，所述完整的抗体对第一抗原表位 或抗原有特异性结合，而scFv对不同于第一个抗原表位或抗原的第二个抗原表位或抗原 有特异性结合。
13. 根据权利要求12所述的抗体，完整抗体和/或scFv具有肿瘤抗原特异性
14. 根据权利要求13所述的抗体，所述肿瘤抗原是选自下列组成：EGFR、Her2、EpCAM、 CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-结 合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、a VP 3、a 5P 1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、 EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和 Tenascin。
15. -种双特异性抗体，来自于一个IgG2的第一抗体和一个与第一抗体具有不同的抗 原表位特异性的第二抗体，其包含（a)第一和第二条多肽，每一个都包括一个第一抗体的免 疫球蛋白轻链；以及（b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端都包括，第一抗体的 可变区，一个IgGl的恒定区，和一个来自第二抗体的单链可变结构域（scFv)。
【文档编号】A61K39/395GK104341504SQ201310340679
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】吴晓云, 李胜峰, 徐臣超 申请人:百奥泰生物科技(广州)有限公司