一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的制作方法

一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的制作方法
【专利摘要】一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，主要成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯和维生素E；油溶性的维生素E与1体积的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2体积的蒸馏水混合；上述两种液体混合后，再加入质量为所述食用油质量10%的乳化剂，形成油水混悬液，EGCG的质量分数为0.02-0.1%，维生素E的质量分数为0.3%。本发明的优点：对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆障碍有明显的改善作用，并可降低其脑内Aβ1-40的沉积，通过升高抗氧化酶，降低氧化产物的抗氧化应激作用及抗凋亡和抗炎作用来发挥其抗阿尔茨海默病作用。成分简单、药效明确、制备容易，能够有效地发挥改善患者行为学和学习记忆功能的作用，且大剂量应用时不会产生其它不良反应。
【专利说明】一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，特别涉及了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病即老年痴呆症，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。随着老龄化速度的加快，阿尔茨海默病患者的人数将急剧增加，给家庭和社会带来沉重的负担，并逐渐上升为一种社会问题。因此，阿尔茨海默病的治疗也成为了科学界亟待解决的大问题。
[0003]如今阿尔茨海默病的病因及发病机制尚未阐明，且至今没有有效的治疗方法，其特征性病理改变为大脑皮质和海马区的细胞外老年斑形成、细胞内神经原纤维缠结以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。其中老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白，β淀粉样蛋白的大量沉积是由β -淀粉样肽前体蛋白在酶的作用下水解产生，并且通过氧化应激、钙超载和细胞调亡等方式启动了神经细胞发生退行性改变，出现阿尔茨海默病样病变。此外，根据近些年对阿尔茨海默病发病机制的研究，阿尔茨海默病患者脑内慢性炎症反应的发生也意味着阿尔茨海默 病可能是一种慢性的中枢神经系统炎症反应。星形胶质细胞作为中枢神经系统含量最多的一种细胞，参与构成了中枢神经系统的微环境，在阿尔茨海默病的病变中起重要作用。胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特异蛋白和骨架成分，其表达增强可以作为星形胶质细胞被激活的一种标志。
[0004]目前，用于阿尔茨海默病的临床治疗的常用药物很多，依照其作用机制包括胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、吡拉西坦和其他草药制剂等。但研究发现，这些治疗措施虽然能够短暂改善症状，但由于其自身的局限性而很难长期应用，如临床应用的西药在缓解症状的同时可能产生恶心、腹泻和呕吐等胃肠道不良反应；中医辨证的治疗方法也因成分复杂而降低了药物的安全性，因此研究开发新型有效的阿尔茨海默病治疗药物具有重要意义。

【发明内容】

[0005]本发明目的是有效治疗阿尔茨海默病，特提供一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂。
[0006]本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于:所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯和维生素E ；
[0007]油溶性的维生素E与I体积的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2体积的蒸馏水混合；上述两种液体混合后,再加入质量为所述食用油质量10%的乳化剂，形成油水混悬液，EGCG的质量分数为0.02-0.1%，维生素E的质量分数为0.3%。
[0008]所述的表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶中提取的多酚成分或化学合成。
[0009]所述的乳化剂为大豆磷脂或卵磷脂。[0010]EGCG (epigallocatechin-3-gallate,(-)表没食子儿茶素没食子酸酯)是绿茶的一种主要多酚成分，具有抗氧化、抗癌、抗突变等活性，能够保护细胞和DNA免受损害，并可通过抗神经细胞氧化和凋亡改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。维生素E (Vitamin E)是一种脂溶性维生素，又称生育酚，由于VE能捕获氧自由基使其成为最主要的抗氧化剂之一，在阿尔茨海默病相关的动物实验和细胞培养中，发现具有自由基代谢的神经保护作用，还可能通过抑制和清除脑内β -淀粉样蛋白沉积，产生延缓衰老的作用。综上，EGCG和VE因其有效的神经保护作用，在阿尔茨海默病的治疗过程中可能起到关键作用，目前国内尚未有联合应用EGCG和VE在整体水平抗阿尔茨海默病方面的报道。因此，本发明拟用EGCG和VE合用组成复合制剂，并根据临床有效剂量设计了几组EGCG和VE合用的剂量，用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠为对象，考察联合使用EGCG和VE对D-半乳糖所致模型小鼠的学习记忆能力的改善情况并对其进行评价。
[0011]所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型，分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法实验方法观察不同剂量的EGCG和VE合用构成的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及其抗氧化和抗炎作用。
[0012]本发明的优点:
[0013]本发明所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，通过试验的结果证实，用EGCG和VE (EGCGl-5mg/kg+VE15mg/kg)合用组成的复合制剂对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆障碍有明显的改善作用，并可降低其脑内Aii1,的沉积，通过升高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT),降低氧化产物(MDA)的抗氧化应激作用及抗凋亡和抗炎作用来发挥其抗阿尔茨海默病作用。
[0014]另外，与其它临床中应用的药物相比，用EGCG和VE合用组成的复合制剂不但成分简单、药效明确、制备容易，能够有效地发挥改善患者行为学和学习记忆功能的作用，且大剂量应用时不会产生其它不良反应，作为阿尔茨海默病患者日常生活中的用药更具安全性，因此可以广泛应用于阿尔茨海默病的治疗。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明:
[0016]图1为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠水迷宫定向航行试验中寻找平台潜伏期的影响示意图，n=10 ；
[0017]图2为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠水迷宫定向航行试验中寻找平台经过路径长度的影响示意图，n=10 ；
[0018]图3为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠水迷宫空间探索试验中目的象限停留时间的影响示意图，n=10 ；
[0019]图4为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠水迷宫空间探索试验中经过原平台所在位置的穿梭次数的影响示意图，n=10 ；
[0020]图5为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中避暗潜伏期的影响示意图，n=10 ；
[0021] 图6为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中明暗箱穿梭错误次数的影响示意图，n=10 ；
[0022]图7为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑皮质内APP沉积水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d =EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0023]图8为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑海马内APP沉积水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d =EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0024]图9为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑皮质内Αβ H0水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d =EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0025]图10为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑海马内Αβ H0水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d =EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0026]图11为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑皮质内GFAP水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d:EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0027]图12为免疫组织化学染色法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠脑海马内GFAP水平的影响示意图；a:空白组；b:模型组；c:VE组；d:EGCG组；e:高EGCG+VE组；f:低EGCG+VE组；放大倍数均为400 X，n=3 ；
[0028]图13为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中微量丙二醛(MDA)水平的影响示意图，n=4 ；
[0029]图14为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的影响不意图，n=4 ；
[0030]图15为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中总超氧化物歧化酶(T-S0D)水平的影响示意图，n=4 ；
[0031]图16为EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中过氧化氢酶(CAT)水平的影响示意图，n=4 ；
[0032]图17为蛋白质印迹法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中APP蛋白表达水平的影响示意图，n=3 ；
[0033]图18为蛋白质印迹法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中Αβ蛋白表达水平的影响示意图，η=3 ；
[0034]图19为蛋白质印迹法考察EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中GFAP蛋白表达水平的影响示意图，η=3 ；
[0035]图20为比较例中EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中微量丙二醛(MDA)水平的影响示意图，η=4 ；
[0036]图21为比较例中EGCG 和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的影响示意图，η=4 ；
[0037]图22为比较例中EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的影响不意图，η=4 ；[0038]图23为比较例中EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中过氧化氢酶(CAT)水平的影响示意图，n=4 ；
[0039]以上各图中:
[0040]EGCG为表没食子儿茶素没食子酸酯的英文缩写；
[0041]*P〈0.05, **P〈0.01,空白组及各实验组与模型组比；#P<0.05, ##P<0.01,低EGCG+VE 组与高 EGCG+VE 组比；+P〈0.05，++P〈0.01，高 EGCG+VE 组、低 EGCG+VE 组与 VE 组比；Δ Ρ〈0.05, ΔΔ Ρ〈0.01，高 EGCG+VE 组、低 EGCG+VE 组与 EGCG 组比。
【具体实施方式】
[0042]实施例1
[0043]本实施例提供了一种治疗阿尔 茨海默病的药物复合制剂，其特征在于:所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯和维生素E ；
[0044]油溶性的维生素E与I体积的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2体积的蒸馏水混合；上述两种液体混合后,再加入质量为所述食用油质量10%的乳化剂，形成油水混悬液，EGCG的质量分数为0.1%，维生素E的质量分数为0.3%。
[0045]所述的表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶中提取的多酚成分或化学合成。
[0046]所述的乳化剂为大豆磷脂或卵磷脂。
[0047]所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠具有减少β淀粉样蛋白聚集的作用。本发明拟用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠为对象，考察EGCG和VE联合应用改善D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力以及其作用机制。试验分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法考察不同剂量的EGCG和VE合用构成的药物复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并初步从抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探讨了其治疗阿尔茨海默病作用的机理。
[0048]试验方法:
[0049]实验动物分组及给药方法:
[0050]取昆明系小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组:空白对照组(生理盐水)、模型组(D-半乳糖)、VE处理组(VE-15mg/kg)、EGCG处理组(EGCG-lmg/kg)、高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg;VE-15mg/kg)。每组10只小鼠。具体给药方法如下:模型组:每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3%的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的大豆油及蒸馏水混悬液一次，连续灌胃4周；药物处理组每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3%的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始分别按以下处理对各组小鼠进行灌胃，连续给药4周:VE处理组(VE-15mg/kg)每日给小鼠按15mg/kg灌胃0.3%的VE 一次；EGCG处理组(EGCG-lmg/kg)每日给小鼠按lmg/kg灌胃0.02%的EGCG 一次；高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg;VE_15mg/kg)每日给小鼠按 5mg/kg 和 15mg/kg 灌胃 0.1% 和 0.3% 的 VE和EGCG的混悬液一次；空白对照组:每日给小鼠皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的生理盐水一次，连续灌胃4周。
[0051]其中用于灌胃的油水混悬液制法如下:油溶性的维生素E与I体积的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2体积的蒸馏水混合；上述两种液体混合后，再加入质量为所述食用油质量10%的乳化剂,形成油水混悬液。
[0052]行为学观察:
[0053]Morris水迷宫试验=Morris水迷宫为不锈钢圆形水池，直径120厘米，高60厘米，水池水深为30-40厘米，一个圆形平台直径为9厘米，藏匿于2厘米的水面下。水池内部不得有任何标记，水中加入适量的牛奶或奶粉，使水池成为不透明的乳白色。在圆筒的上缘等距离的设定东南西北4个标记点(E、S、W、N),作为动物入水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分均等的分为4个象限。按实验要求，可任意地将平台设置于某一象限的中间，适当的恒温设备使水温保持在25°C。水迷宫水池应配有良好的注水和排水设备，水池的位置一旦确定，就不要轻易变动，尤其在同一轮水迷宫的测试中。水迷宫的图像自动采集和系统，能自动地采集动物的入水位置、游泳的速度、搜索目标的所需时间、运行轨迹和搜索策略等参数，并可对所采集的各种数据进行统计和分析。实验前一天，水池中不放置平台，使小鼠在水中自由游泳2分钟，使其适应环境。正式实验包括2个部分:定向航行试验和空间探索试验。
[0054]定向航行试验:进行定向航行试验时，将平台放在固定的第二象限，不再移动。该试验训练 小鼠每天4次，共5天。训练时，将小鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，记录鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，用秒表示，并记录从小鼠如水至找到平台通过路径的总长度，用米表示。小鼠找到平台后，让其在平台上站立30秒。若入水后60秒若小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中引导拖上平台，并停留30秒，然后进行下一次训练。每只鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔120秒。
[0055]空间探索试验:在定向航行试验结束后，也就是试验的第6天，将原来平台撤去，使其在水中寻找原平台所在位置，时间共120秒，记录小鼠在原平台所在目的象限的停留时间，用秒表示，以及小鼠穿越原平台的次数，来评价小鼠记忆重现的能力。
[0056]被动避暗实验:BA-200避暗自动测试仪，62厘米X 30厘米X 23厘米的活动箱分明暗两室，两室之间有一直径为3.0厘米的洞口，箱底有铜栅。试验分为训练期和正式试验期。训练前将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3分钟，然后给暗室铜栅通36V电流，小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5分钟，此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间(避暗潜伏期)，以秒表示；并记录5分钟内小鼠进入暗室的次数(避暗错误次数)。若小鼠5分钟内未进入暗室，其潜伏期计作300秒计算。
[0057]病理组织形态学观察:
[0058]各组小鼠断头处死，迅速取出每组3只小鼠的大脑，放入4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化的检测。
[0059]生物化学指标的检测:
[0060]脑内SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的测定:取每组4只小鼠的脑组织，加入预冷的生理盐水制成10%的脑匀浆，2000rpm/分钟离心10分钟，取上清。蛋白定量后，采用羟胺法按试剂盒说明测定脑组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按试剂盒说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法测定脑组织丙二醛(MDA)含量；采用可见光法按试剂盒说明测定脑组织过氧化氢酶(CAT)活性。[0061]蛋白质印迹法观察D-半乳糖模型小鼠的ΑΡΡ、Αβ、GFAP蛋白表达水平:
[0062]分别取各组3只小鼠的大脑皮质和海马，立即放入预冷的RIPA裂解缓冲液(RIPA:PMSf=1000:1)中，冰上超声匀浆3次，放置5分钟，4°C，12000 X g离心5分钟，取上清，用BCA试剂盒测定总蛋白含量，以BSA为标准品。用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量为每孔50yg。中央泳道加入彩虹Maker5 μ L，用于蛋白带分子量的确定。浓缩胶电泳约I小时，分离胶电泳约I小时后，将凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后以磷酸盐吐温缓冲液(PBS中加入0.1%(v/v)吐温20)洗膜液洗膜10分钟X 3次，将膜放入含5%脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液中，摇床上室温封闭120分钟；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟X 3次后，将膜放入一抗APP (1:1000)、Α β (1:1000) ,GFAP (1:1000)、摇床上室温孵育过夜；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟X3次；辣根酶标记山羊抗兔IgG(1:3000)、山羊抗鼠IgG(1:3000)室温摇床上孵育振荡120分钟，磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟X3次；使用发光液(A:B=1:1)发光并显影。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成FluorChemV2.0软件(Alpha InnotechCorp., USA)对蛋白带进行灰度值(分别以目的蛋白的整合密度值比内参β-tubulin (1:3000)的整合密度值)分析。
[0063]统计学分析:实验数据用I + s表示，数据采用SPSS16.0统计分析软件包进行统
计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey HSD post hoc test法进行统计学分析；对于不服从正态分布的数据，如动物活动次数，穿梭次数等指标，使用非参检验Kruskal - Wallis H test法进行统计学分析；设定检验水准为α =0.05, ρ>0.05差异无显著性，Ρ<0.05差异具有显著性。
[0064]结果:
[0065]1.EGCG与VE联用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠Morris水迷宫结果的影响
[0066]通过对各组小鼠进行为时5天的训练，可得到各组小鼠在训练连续5天期间逃避潜伏期(图1)和寻找平台路径长度(图2)的趋势图。试验结果显示，试验开始第I天，高EGCG+VE组的寻找平台潜伏期和寻找平台路径长度相对于模型组显示明显差异(P〈0.01)。从试验开始第2天至第5天，随着训练次数的增加，各组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度有缩短趋势，且与空白组相比，模型组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度均有显著差异(P〈0.01)，并且随着训练时间的延长，模型组小鼠的这两项指标并未呈现出学习记忆过程的特征，这意味着D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠产生了明显的学习记忆障碍。另外，与模型组相比，高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)的寻找潜伏期和寻找平台路径长度显著缩短(P〈0.05)，且高剂量EGCG+VE处理组效果明显优于VE处理组、EGCG处理组(Ρ〈0.05)，结果表明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)联合处理可以改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习与记忆障碍。
[0067] EGCG对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠空间探索试验结果的影响:通过对各组小鼠进行为时5天的训练后，于第6天撤去原来的平台，分别对小鼠在原平台所在目的象限时间(图3)以及原平台所在位置的穿梭次数(图4)进行观察，以考察EGCG与VE联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠记忆再现能力的影响。模型组小鼠的在原平台所在目的象限的停留时间(P〈0.01)以及对原平台所在位置的穿梭次数(P〈0.01)均较空白组小鼠显著减少，说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力出现明显障碍；而高剂量EGCG+VE组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠在目的象限的停留时间(P〈0.01)和在原平台所在位置穿梭次数(P〈0.01)均比模型组小鼠明显延长，且明显优于VE组、EGCG组(P〈0.05),这说明经过EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)联合处理后可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力低下状况。
[0068]2.EGCG和VE联合处理对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠被动避暗试验结果的影响
[0069]通过被动避暗试验对各组小鼠避暗潜伏期(图5)和明暗箱穿梭错误次数(图6)的检测，对各组小鼠学习记忆能力的影响进行了考察。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(p〈0.01)，错误次数也明显增加(P〈0.01)，这提示了 D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠存在学习与记忆障碍；而与模型组相比，高EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠避暗潜伏期明显延长(Ρ〈0.01)，进入暗室的次数明显减少(Ρ〈0.01)，且高 EGCG+VE 组明显优 于 VE 组、EGCG 组(P〈0.05)，说明 EGCG (5mg/kg)和 VE(15mg/kg)联合应用可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍。
[0070]3.EGCG和VE联合处理对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP、A β n GFAP表达的影响
[0071]APP蛋白免疫组化染色结果显示(图7~8)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型组小鼠皮质和海马内均可见大量APP阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(Ρ〈0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在APP的异常沉积。与模型组相比，高EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠的脑皮质和海马区APP阳性细胞表达明显减少(P〈0.01)，胞浆着色变浅，且高EGCG+VE组明显优于VE组、EGCG组(P〈0.05)，说明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)联合应用可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP的异常沉积。
[0072]Ai^4tl蛋白免疫组化染色结果显示(图9~10)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马均可见大量棕黄色阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P〈0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在Aii1,的异常沉积。与模型组相比，高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠的脑皮质和海马区A β H0阳性细胞表达明显减少(Ρ〈0.01)，且胞浆着色变浅，明显优于VE组和EGCG组(Ρ〈0.05)，说明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)联合应用可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内Αβ !_40的异常沉积。
[0073]GFAP蛋白免疫组化染色结果显示(图11~12)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马均可见大量GFAP细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(Ρ〈0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在星形胶质细胞的异常激活。与模型组相比，高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠皮质和海马区GFAP阳性细胞表达明显减少(P〈0.01)，且高EGCG+VE组明显优于VE组、EGCG组(P〈0.05)，说明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)联合应用可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内异常的炎症反应。
[0074]4.EGCG和VE联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠生物化学指标的影响
[0075]如表1及图13~16所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT、GSH-Px活性明显降低(P〈0.01)，SOD活性也有所降低(P〈0.05)，MDA含量明显升高(P〈0.01)，与模型组相比，高剂量EGCG+VE处理组(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)能显著提高小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性(Ρ〈0.05)，显著降低MDA含量(Ρ〈0.01)，且高EGCG+VE组优于VE组、EGCG组(P〈0.05)，说明EGCG (5mg/kg)和VE (15mg/kg)联合应用可以通过抗神经细胞的氧化应激改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。
[0076]表1EGCG和VE联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠生物化学指标的
影响(-1 +S, n=4)
[0077」
【权利要求】
1.一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于:所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯和维生素E ； 油溶性的维生素E与I体积的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2体积的蒸馏水混合；上述两种液体混合后，再加入质量为所述食用油质量10%的乳化剂,形成油水混悬液，EGCG的质量分数为0.02-0.1%，维生素E的质量分数为0.3%。
2.按照权利要求1所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于:所述的表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶中提取的多酚成分或化学合成。
3.按照权利要求1所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于:所述的乳化剂为大豆磷脂或卵磷脂。
【文档编号】A61P25/28GK103948584SQ201310356333
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】魏敏杰, 刘明妍, 钟欣, 姚维范, 王爽, 王崴, 赵琳, 何苗, 赵海山 申请人:魏敏杰