人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明提出了人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中应用的技术方案。本发明的研究结果表明在人脂肪细胞中过表达miR-26b可以明显抑制脂肪细胞的增殖速度和细胞个数，可用于制备抑制脂肪细胞增殖的药物及减肥的药物。
【专利说明】人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肥胖，是一种常见的能量代谢性疾病，是目前在全世界范围内增长最为迅速的慢性疾病。肥胖与冠心病、高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管意外等多种疾病系密切相关，严重危害着患者的身心健康。加强对肥胖病因、发病机制及防治药物的研究己成为21世纪面临的最大公共卫生挑战之一。目前肥胖的治疗策略包括刺激中枢肾上腺素能受体或者阻止5-羟色胺再吸收的食欲抑制剂、消化性脂肪酶抑制剂以及激素调节剂。在这 些药物中，仅阻止5-羟色胺再吸收的脂肪酶抑制剂、奥利司他和西布曲明是FDA许可的药物，但是会导致包括脂肪泻、头痛以及血压升高等副作用。因此，肥胖的治疗和预防依然是医学领域和预防领域里的热点问题之一。
[0003]已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢失衡的结果，在细胞水平，肥胖表现为脂肪细胞的数目增多和体积增大，脂肪细胞的增多是由于前脂肪细胞的不断增殖和分化所引起，而脂肪细胞的体积反映了在特定细胞中脂质分解和合成之间的平衡。此外，随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性已倍受重视。近些年来，有关肥胖的病因学研究结果表明，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70%，因此开展肥胖病因的遗传学研究，从基因工程方面入手，寻找一种能够抑制脂肪细胞增殖和分化的药物对于肥胖症的防治将起到非常重要的作用。
[0004]miR_26b是我们采用微流体芯片技术检测人原代脂肪前体细胞及诱导分化的成熟脂肪细胞miRNAs表达谱时发现的一条高表达于成熟脂肪细胞的miRNA,该miRNA位于人染色体2q35、CTDSPl基因的第4内含子，其成熟序列“UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU”在物种间高度保守。但该miRNA与脂肪细胞增殖之间的关系如何尚未知晓。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供人miR_26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。
[0006]本发明另一个目的是提供人miR_26b在制备减肥药物中的应用。
[0007]本发明经研究发现，人miR_26b过表达组的脂肪细胞增殖速度明显慢于空载对照组脂肪细胞，细胞个数明显减少，且人miR-26b过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例明显少于空载对照组，表明染色质合成期细胞减少，细胞增殖速度变慢。因此，本发明提出人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用，进一步，可用于制备抑制脂肪细胞增殖药物。这些影响脂肪细胞增殖的药物既可以作用于全身的脂肪组织，也可以与靶向定位物质结合，从而作用于特定部位，抑制特定部位的脂肪细胞增殖。
[0008]本发明的有益效果
[0009]本发明检测了人miR_26b过表达对脂肪细胞增殖功能的影响，显示过表达miR-26b能抑制脂肪细胞增殖(细胞个数减少且增殖速度变慢)，可用于制备抑制脂肪细胞增殖的药物及减肥药物，为肥胖的预防和治疗提供了新的手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:pGLV-Hl-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR_26b过表达慢病毒载体酶切
及测序鉴定。
[0011]图2:人miR_26b过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定。
[0012]图3:人miR_26b过表达脂肪细胞和对照细胞生长曲线图。
[0013]图4:人miR_26b过表达脂肪细胞和对照细胞24、48小时细胞各周期分布图(Gl:染色质合成前期，S:染色质合成期，G2/M:染色质合成后期及分裂期)。
【具体实施方式】
[0014]以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0015]实施例1
[0016]I材料和方法
[0017]1.1 试验材料:人前体脂肪细胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)购自美国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-Hl_GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒 Pcgvp、Rev、Vsvg 购自美国 Allele Biotech & Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-26b-GFP/Puro慢病毒载体由本实验小组自行构建；DNA、RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司,miRNA逆转录试 剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表达mix II购自美国 ABI 公司，TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 试剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物由美国Invitrogen公司合成。
[0018]1.2 (一)人miR_26b minigene的扩增及人miR_26b慢病毒过表达载体(pGLV-Hl-miR-26b-GFP/Puro)的构建
[0019](I).DNA提取:按照以下步骤提取基因组DNA(德国Qiagen公司QIAamp DNA MiniKit)
[0020]I)取4ml离心管一只，加入600 μ I核裂解液，冰上冷却。
[0021]2)加入10_20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心
管中。65°C孵育30分钟。
[0022]3)待样品达到室温后，加入200 μ I蛋白沉淀液，润旋震汤20秒，直于冰上冷却5分钟。
[0023]4) 13，OOOXg离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。
[0024]5)加入600 μ I异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13，000Xg离心I分钟，弃去上清。
[0025]6)加入600 μ I室温70%乙醇,轻轻颠倒离心管数次,13，000 X g离心I分钟,小心
弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。
[0026]7)向离心管中加入50 μ I双蒸水，65°C孵育I小时，以充分溶解DNA，4°C保存，得基因组DNA。[0027](2).人 miR_26b minigene 的扩增
[0028](2.1)通过miRBase数据库获得人miR-26b的前体pre-miRNA_26b的序列；在从1blast中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primerf软件设计扩增包括pre-miR-26b在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物(含BamHI位点，下划线区域)5’ -GCCGGATCCAGGCTCTTCCCACCAATCCG-3’ ;下游引物(含EcoRI 位点，下划线区域)5’ -ACCGAATTCGGCCAGCTACCCTGACCACT-3’。目的基因长度为 451bp。(PCR 试剂盒:TaKaRa LA '< DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
[0029]
【权利要求】
1.人miR-26b在制备抑制脂肪细胞增殖药物中的应用。
2.人miR-26b在制备减肥药`中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103432595SQ201310361481
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】郭锡熔, 季晨博, 赵亚萍, 宋桂仙, 徐广峰, 史春梅, 顾平清, 沈亚卉, 李慧 申请人:南京市妇幼保健院