黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明一种黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用，属于植物有效成分的提取领域。本发明将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮。实验证明，该黑青稞籽皮类黄酮具有预防和治疗缺氧损伤，特别是心、脑缺氧损伤的功效，可替代资源短缺的红景天用于制备预防和治疗缺氧损伤药物，有广阔的工业应用前景。
【专利说明】黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物有效成分的提取工艺，特别是涉及一种黑青稞籽皮中主要活性成分类黄酮的提取方法及其在制备预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)药物中的应用。
【背景技术】
[0002]青稞(Hordeum vulgare ssp.vulgare),又称裸大麦,是禾本科大麦属作物,在世界许多国家和地区作为主要粮食作物已有几千年历史。在西藏，青稞品种资源很丰富，不同颜色、不同形状的品种多达十几个，有时在同一地区能发现7-8个青稞品种。青稞分为白青稞、黑青稞、墨绿色青稞等种类，其中，黑青稞是西藏特有品种，喜马拉雅山北麓的山南地区措美县因气候、土壤特殊而盛产黑青稞，将其加工成糌粑后口感好，营养高，而且长期服用对治疗糖尿病、胃病等有明显的疗效，这是白青稞不具备的。
[0003]黑青稞富含膳食纤维、多种矿物质、维生素，能促进人体健康发育，所含的β -葡萄聚可预防结肠癌，有学者从黑青稞中提取花色素，而有关其中更丰富的类黄酮物质的相关研究至今未见报道。
[0004]随着食品科学的发展，黑色健康食品越来越受到人们的关注，黑色食品是指带天然黑色或紫红色的各种动植物食品，黑色食品的保健功能在我国古代的医学论著中有过许多论述:《本草纲目》中谈及黑米名为“粳谷奴”，具有滋养肝肾、健脾和胃、活血明目等功能，久食可延年益寿；在论述服黑豆时说它可“加气力、补虚损”、“又益阳道”;在《本经》上说到芝麻有“益气力、长肌肉、填髓脑”作用，对乌骨鸡、木耳、海带、香菇的健身评价也都很高。这些黑色健康食品所含有益于健康的成分黑色素成分就是类黄酮的一种。然而分析表明，更广泛的类黄酮具有保健功能，如抑制血小板凝固、预防血栓和心脏病、降血脂、抗癌、抗炎、保护视力、延缓衰老等。在黑青稞提取中，赵桃等介绍了一种黑青稞花色素的提取工艺(赵桃，马林，李嘉佳，杜静君.，杨娟，杨凡，《食品研究与开发》2010年09期)，以黑青稞为原料，考察提取溶剂、酸化剂、提取温度、提取时间、料液比、提取次数和籽粒粉碎度等7个单因素对其花色素提取率的影响，确定了青稞色素的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度50%，温度53°C，时间3h，此时最大提取率为108.33μ g/g。然该研究需将黑青稞籽粒粉碎，工艺复杂且影响提取率，且仅停留在花色素提取层面，只适于粗提，提取物难以分离，不适于工业化生产。迄今为止，尚未得到黑青稞籽皮类黄酮物质的提取方法及其应用的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是提供一种可工业化实施的从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法。
[0006]本发明一种黑青稞籽皮类黄酮的制备方法，将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮。
[0007]所述粗提，是将黑青稞籽皮加入浓度为20%-60% (体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1:6-10(g:ml)，调pH值为2.0-5.0，40_60°C水浴2_5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；优选粗提条件为乙醇浓度40%，pH2.0，水浴温度50°C，水浴时间3h。
[0008]所述絮凝剂为101絮凝剂；所述纯化为向乙醇粗提的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1% -2% (g/100ml)，在40-60°C水浴下搅拌，然后在3000_5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品。
[0009]具体的，该方法包括以下步骤:
[0010]I)粗提:将黑青稞籽皮加入浓度为20%-60%(体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1:6-10(g:mL)，调pH值为2.0-5.0，40_60°C水浴2_5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；
[0011]2)纯化:向类黄酮粗提物的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1% -2% (g/100ml)，在40-60°C水浴下搅拌，然后在3000-5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品；
[0012]3)萃取:用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取:先将类黄酮粗品与水按体积比1:5-1:10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1:5_1:10，振荡充分，静置，常温过夜，减压回收，馏出物为类黄酮精制物，在_20°C至_70°C下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；
[0013]4)富集:类黄酮精制物粉末溶于去离子水中配成溶液用于上样，用S印hadexLH-20柱进行梯度洗脱，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100:0、90:10、50:50、0:100，将洗脱物真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。
[0014]其中:所述步骤I)中优选的提取条件为乙醇浓度40%，pH2.0，水浴温度50°C，水浴时间3h。
[0015]所述步骤2)和步骤3)中减压回收条件为水浴50°C，压力0.09Mpa，冷水冷凝。
[0016]本发明的另一目的在于提供可替代花青素使用的食物来源的产品。该产品即为用以上方法获得的黑青稞籽皮类黄酮或中间品。所述中间品包括类黄酮粗提物的醇提液、类黄酮粗品、类黄酮精制物和类黄酮精制物粉末；所述黑青稞籽皮类黄酮纯度为95-98%。
[0017]本发明重要目的在于提供所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗缺氧损伤药物或中的应用，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状。
[0018]本发明重要目的还在于提供黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻。
[0019]实验证明，用本发明方法得到的黑青稞籽皮类黄酮具有预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)的功效，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状，所述心、脑缺氧损伤包括缺氧的一般表现为头晕、头痛、耳鸣、眼花、四肢软弱无力，继之有恶心、呕吐，呼吸浅快而弱，心跳快而无力。随着缺氧的加重，会渐次出现意识模糊，全身皮肤、嘴唇、指甲青紫、血压下降、瞳孔散大、昏迷，最后因呼吸困难、心跳停止、缺氧窒息而死亡。因此，黑青稞籽皮类黄酮在制备预防和治疗缺氧损伤药物，特别是预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020]应用中，所述药物含有黑青稞籽皮类黄酮或中间品，产品本身可成药，也可加入其它药用辅料；药物剂型可为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂；其中，口服制剂的剂型具体可为散剂、溶液剂、颗粒剂、片剂或胶囊等，口服制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为200mg-500mg/片；注射制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为50mg-100mg/ 支。
[0021]黑青稞籽皮类黄酮的有效治疗剂量为0.5_5g/kg体重，小鼠实验优选为
1.75-3.5g/kg体重，因此，上述口服药物的人的用量一般为300mg-800mg/kg体重/day，疗程一般为5-7天；注射药物的用量一般为0.83mg-l.66mg/kg体重/day,疗程一般为3-5天。用量和疗程可根据实际情况进行调整，本申请仅提供数据支持，不对具体使用给出任何限制。
[0022]采用以上方案，本发明提供了从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法、产品及其新用途。本发明制备工艺，直接使用原态黑青稞籽皮，未经粉碎，简化了工艺而能达到很好的提取效果；通过絮凝剂的纯化，有效除去了粗提物醇提液中的杂蛋白，并进而结合萃取和柱富集，能够得到纯度较高黑青稞籽皮类黄酮，使产业生产和应用成为可能。实验证明，本发明提供的黑青稞籽皮提取物(类黄酮)显著延长了小鼠密闭缺氧后的存活时间，说明对脑缺氧或心肌缺血有改善作用，小鼠灌胃3天既能看到显著延长常压耐缺氧的存活时间；在断头实验中，脑血液供应中断，但脑中原有的血和宫养物质尚能使脑功能维持一段时间，表现在小鼠规律地喘气，实验结果表明黑青稞籽皮提取物可明显延长小鼠的喘气时间，能够使脑耗能减少，对断头脑缺氧有保护作用；通过三种不同类型的细胞缺氧损伤实验，证明黑青稞籽皮提取物能够有效防治过氧化氢、百草枯、连二亚硫酸钠对H9C2(大鼠胚胎心肌)细胞的缺氧损伤，说明黑青稞籽皮提取物对大鼠心肌细胞各种缺氧损伤均具有保护作用，即具有心肌细胞保护作用；通过小鼠负重游泳实验说明黑青稞籽皮提取物还具有较好的抗疲劳功能。上述实验证明，黑青稞籽皮提取物(类黄酮)具有预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)的功效，所述缺氧损.伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻等。因此，可以黑青稞籽皮提取物(类黄酮)为活性成分制备预防和治疗缺氧损伤药物，特别是预防和治疗心、脑缺氧损伤药物，应用前景广阔。
[0023]本发明更实际意义及优势在于:本发明黑青稞籽皮类黄酮来源于食物，具有服用安全的特点，而在耐缺氧方面与红景天具备相似功效，由于红景天属于珍贵的藏药资源，资源有限，因此有望以天然、绿色、低成本食品来源的黑青稞替代藏药来源的红景天。目前，进藏防治高原缺氧主要采用提前服用红景天系列产品的方法，大多数以红景天复方为主，由于体质原因，服用后出现部分人群过敏现象，而本发明产品为单方成分，可以避免过敏现象发生，这是本发明产品黑青稞籽皮类黄酮的优势所在。
[0024]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为乙酸乙酯萃取后的醇提物的硅胶薄层层析结果[0026]图2为乙酸乙酯萃取后的醇提物的紫外-可见光谱图
[0027]图3A为黑青稞籽皮提取物的紫外-可见光谱全波长扫描图
[0028]图3B为类黄酮标准品的紫外-可见光谱全波长扫描图
[0029]图4A为黑青稞籽皮提取物的外观形态
[0030]图4B为黑青稞籽皮提取物分离单体的外观形态
[0031]图5A为常压耐缺氧实验中小鼠体重的变化情况
[0032]图5B为黑青稞籽皮提取物对小鼠常压耐缺氧实验中生存时间的影响
[0033]图6A为小鼠急性脑缺血实验中小鼠体重的变化情况
[0034]图6B为黑青稞籽皮提取物对小鼠急性脑缺血实验中存活时间的影响
[0035]图7A为黑青稞籽皮提取物预防过氧化氢(H2O2)对H9C2细胞损伤的结果
[0036]图7B为黑青稞籽皮提取物治疗过氧化氢(H2O2)对H9C2细胞损伤的结果
[0037]图8A为黑青稞籽皮提取物预防百草枯(PQ)对H9C2细 胞损伤的结果
[0038]图8B为黑青稞籽皮提取物治疗百草枯(PQ)对H9C2细胞损伤的结果
[0039]图9A为黑青稞籽皮提取物治疗连二亚硫酸钠(Na2S2O4)对H9C2细胞损伤2.5h的结果
[0040]图9B为黑青稞籽皮提取物治疗连二亚硫酸钠(Na2S2O4)对H9C2细胞损伤7.0h的
结果
[0041]图10为黑青稞籽皮提取物对H9C2细胞线粒体膜电位的影响
[0042]图11为黑青稞籽皮提取物对H9C2细胞凋亡的影响
[0043]图12A为黑青稞籽皮提取物对线粒体膜电位的影响
[0044]图12B为黑青稞籽皮提取物对BC1-2蛋白的影响
[0045]图13为黑青稞籽皮提取物对小鼠负重游泳抗疲劳的影响
【具体实施方式】
[0046]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0047]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0048]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0049]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0050]本发明提出的黑青稞籽皮类黄酮，是将原态黑青稞籽皮(无需粉碎)经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集后得到。
[0051]具体的，从黑青稞籽皮中提取类黄酮可包括以下步骤:
[0052]I)粗提:将黑青稞籽皮加入浓度为20% -60% (体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1:6-10，调pH值为2.0-5.0，40-601:水浴2-511，得到类黄酮粗提物的醇提液；
[0053]2)纯化:向类黄酮粗提物的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为I % -2 % (g/100ml),在40-60 V水浴下搅拌以40_80r/min搅拌2_4min，然后在3000-5000r/min条件下离心5_10min，取上清液，减压回收(减压回收条件为水浴50°C，压力0.09Mpa，冷水冷凝)，馏出物为类黄酮粗品；
[0054]3)萃取:用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取，萃取法方法为:先将类黄酮粗品与水按体积比1:5_1:10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1:5_1:10，振荡充分，静置，常温过夜(10-12小时)，减压回收(减压回收条件为50°C，压力0.09Mpa，冷水冷凝)馏出物为类黄酮精制物，在-20°C至-70°C下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；
[0055]4)富集:类黄酮精制物粉末溶于微量去离子水中配成溶液用于上样，用SephadexLH-20柱进行梯度洗脱(分离、浓缩)，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100: 0、90:10、50:50、0:100，将洗脱物真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。
[0056]在上述从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法中，本发明进一步优化了工艺参数:
[0057]步骤I)中将黑青稞籽皮用乙醇进行浸提是因为大部分类黄酮物质易溶于一定浓度乙醇，乙醇浓度选择20% -60% (体积百分比浓度)是因为本发明原料黑青稞籽皮中大部分水溶性及中等极性的类黄酮物质在此浓度下可被溶出；选择黑青稞籽皮与乙醇的体积比为1:6-10，是以最经济的溶剂获得最大提取率；pH值2.0-5.0 (优选2.0，用柠檬酸调pH值)，考虑类黄酮物质成分在酸性条件下可获得较为稳定的保护；40-60°C水浴2-5h条件下浸提，是因为某些类黄酮物质成分受到高温(60°C以上)易发生变化。进一步，步骤I)优选的提取条件为乙醇浓度40%，pH2.0，水浴温度50°C，水浴时间3h。
[0058]步骤2)中用絮凝剂絮凝纯化的目的主要是去除蛋白和鞣质，可选择的中药絮凝剂有鞣酸、明胶、蛋清、101絮凝剂、ZTC澄清剂、壳聚糖等，101絮凝剂可最大限度保留药液的类黄酮有效成分，去除蛋白和鞣质，因此为本发明的优选。101絮凝剂为商购产品，食品级，以天然铝硅酸盐粘土为原料，经精制、复配而成。其功效为:有效吸附提取液中的蛋白质、鞣质等成分。步骤2)中离心的目的是保留类黄酮物质，去除蛋白；减压回收的目的是浓缩提取物。
[0059]所述步骤3)中用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取的目的是精制类黄酮提取物；低温干燥的目的是不破坏类黄酮化学结构。
[0060]所述步骤4)用S印hadexLH-20柱进行分离、浓缩的目的是分离类黄酮单体确定功效成分，选择S印hadexLH-20柱的原因是其对类黄酮物质分离效果好；真空干燥的目的是合并浓缩提取物。
[0061]经检测，用上述方法从黑青稞籽皮中提取的类黄酮的纯度为95-98%。
[0062]本发明的粗提工艺以正交试验确定:
[0063]正交试验:提取工艺的确定
[0064]本发明在黑青稞综合开发中，首先利用正交试验，筛选了实验条件(表I所示)下黑青稞籽皮类黄酮的最佳粗提工艺。
[0065]表I正交试验因素及水平选取
【权利要求】
1.一种黑青稞籽皮类黄酮的制备方法，将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述粗提，是将黑青稞籽皮加入浓度为20% -60% (体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1:6-10 (g:ml)，调pH值为2.0-5.0，40_60°C水浴2_5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；优选粗提条件为乙醇浓度40%，pH2.0，水浴温度50°C，水浴时间3h。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述絮凝剂为101絮凝剂；所述纯化为向乙醇粗提的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1% -2% (g/100ml)，在40-60°C水浴下搅拌，然后在3000-5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品。
4.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)粗提:将黑青稞籽皮加入浓度为20%-60% (体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1:6-10(g:mL)，调pH值为2.0-5.0，40_60°C水浴2_5h，得到类黄酮粗提物的醇提液； 2)纯化:向类黄酮粗提物的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1%-2%(g/100ml),在40-6011C水浴下搅拌,然后在3000-5000r/min条件下离心,取上清液,减压回收，馏出物为类黄酮粗品； 3)萃取:用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取:先将类黄酮粗品与水按体积比1:5-1:10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1:5-1:10，振荡充分，静置，常温过夜，减压回收，馏出物为类黄酮精制物，在-20°C至-70°C下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末； 4)富集:类黄酮精制物粉末 溶于去离子水中配成溶液用于上样，用S印hadexLH-20柱进行梯度洗脱，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100:0、90:10、50:50、0: 100，将洗脱物真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中优选的提取条件为乙醇浓度40%，ρΗ2.0，水浴温度500C，水浴时间3h。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述步骤2)和步骤3)中减压回收条件为水浴50°C，压力0.09Mpa，冷水冷凝。
7.权利要求1-6任一所述方法获得的黑青稞籽皮类黄酮或中间品，所述中间品包括类黄酮粗提物的醇提液、类黄酮粗品、类黄酮精制物和类黄酮精制物粉末；所述黑青稞籽皮类黄酮纯度为95-98%。
8.权利要求7所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗缺氧损伤药物或中的应用，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状。
9.权利要求8所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于:所述药物含有黑青稞籽皮类黄酮或中间品；剂型为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂；其中，口服制剂的剂型具体可为散剂、溶液剂、颗粒剂、片剂或胶囊等，口服制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为200mg-500mg/片；注射制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为50mg-100mg/支。 ·
【文档编号】A61K131/00GK103432462SQ201310400124
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】于群, 王璇琳, 贺敏, 李伟静, 任素萍, 苏丽华, 丁雪洁, 乔志新 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所