一种抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法，其方法包括樟芝发酵全液或发酵后澄清液或菌丝体经过乙醇提取、过滤、减压浓缩、除色素、除小分子化合物、除脂肪、醇析、离心分离、收集物干燥、收集物粉碎等步骤。本发明的方法提取的樟芝发酵全液乙醇提取物对禽流感病毒具有明显的抑制作用，该方法具有工艺简便、成本低、效果好的特点。
【专利说明】一种抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法，尤其涉及撞芝(An trodia camphora ta ) AcOO I,已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.1460，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
【背景技术】
[0002]关于抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法，经检索到的相关专利有:中国专利申请号为99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471 —种云芝糖肽(PSP)的生产方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，其中灰树花、云芝和灵芝三种制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗禽流感病毒的报道更是没有检索到。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是，针对上述抗禽流感病毒的樟芝全液发酵乙醇提取物的制备方法以及其制备的乙醇提取物的药理作用所存在的不足，提供一种抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法。利用本发明的方法提取的樟芝发酵全液乙醇提取物对禽流感病毒具有抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、成本低、具有抗禽流感的特点。
[0004]本发明的抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法，包括三种制备形式:其一为直接从樟芝菌发酵全·液包括菌丝体与澄清液中用乙醇分离出活性物质；其二为先将樟芝菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得菌丝体中用乙醇分离出活性物质；其三为先将樟芝菌发酵全液分离成菌丝体与澄清液，再从所得澄清液中用乙醇分离出活性物质。由以下步骤组成:
所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征是，所述樟芝菌发酵全液乙醇提取物由下述方法制得:
HJ加热浓缩:取经液体发酵的樟芝菌发酵全液或澄清液放于容器内，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2，真空度为0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使减压浓缩后的发酵全液或澄清液是原体积的1/4~1/2。
[0005][2]乙醇提取:经浓缩后的樟芝菌发酵全液或澄清液的温度降到30°C—下，往容器中加入80%-95%的乙醇，使浓缩后的樟芝菌发酵全液或澄清液的醇溶液的醇度达到60~70%左右，然后继续加热，温度控制在30~70°C，加热时间是30~240分钟。
[0006](3)过滤:之后冷却、以180~200目的筛网过滤樟芝菌发酵全液或澄清液，收集滤液，滤渣以其4~8倍体积的80%-95%乙醇稀释，重复上述操作I~2遍，离心收集滤液；W.1减压浓缩:过滤后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2,真空度为0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，回收乙醇，使滤液浓缩至原有体积的 1/5 ~1/10 ；
四收集物干燥:将上述浓缩后的滤液，在50~60°C温度条件下干燥120~480小时，挥发多余的乙醇；
(7)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，置35°C条件下进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为樟芝菌抗禽流感病毒活性的乙醇提取物。
[0007]其中，步骤[I ]所述的樟芝菌发酵全液是指樟芝iAntrodia camphorata)发酵液与菌丝体的集合体。步骤[I ]所述的樟芝澄清液是指樟芝iAntrodia)发酵后澄清液
所述樟芝菌通过以下步骤进行发酵:
(1)液体种子培养:采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节PH为3-8，培养温度为20-35°C，摇瓶转速为80-280r/min，培养7_15天，即可得到樟芝液体种子；
(2)发酵罐发酵: 先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1~0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当樟芝液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的樟芝种子接种到50L发酵罐的培养液中，调整pH为5-8，培养温度25-35°C，通气量0.5-1.1vvm,搅拌转速100-250r/min,培养7_30天，发酵停止时，培养液的颜色为桔黄色。
[0008]所述液体种子培养基或发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉1~3%蔗糖I~5%
蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸镁0.1~0.3%磷酸二氢钾 0.05~0.1%
采用本发明的抗禽流感病毒的樟芝发酵全液乙醇提取物的制备方法，具有工艺简便、、成本低、抗禽流感病毒的特点。该方法采用樟芝菌丝体的发酵液及其发酵全液进行活性物质提取，大大解决了樟芝子实体及菌丝体人工培养的难度、降低了原料成本和生产成本，提高了产率。
[0009]采用本发明的方法提取的樟芝菌乙醇提取物，经青岛农业大学药用真菌研究所在中国动物卫生与流行病学中心外来病研究中心所作的体外抗禽流感病毒药物筛选试验，樟芝菌乙醇提取物对禽流感病毒具有明显的抑制作用，并对细胞具有保护作用。
[0010]体外抗禽流感病毒药物筛选试验的具体方法如下:
1、实验材料
1、细胞:MDCK细胞
2、病毒:禽流感病毒毒株为H5N1型
3、培养液:含10%胎牛血清的DMEM培养液
I1、实验条件 生物安全三级实验室
II1、实验步骤1、CPE法测定病毒对MDCK细胞半数毒性浓度(TCID50)
按Reed-Muench法测定MDCK细胞的半数细胞感染物感染剂量(TCID50)。
[0011]2、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度
用酶联免疫检测仪测定0D492值，计算出样品的最大无毒浓度(TCO)和半数中毒浓度(TC50)。
[0012]3、提取物的最大无毒浓度对禽流感病毒的药效测定
采用MTT法测定0D492值。当加样组的0D492值显著大于病毒对照组0D492时，表明此样液能够显著抑制病毒感染MDCK，具有很好的抗病毒的活性。
[0013]IV、实验结果
1、病毒的 TCID5。为 10_4。
[0014]2、取樟芝菌乙醇提取物11个浓度即64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25,0.125、和0.0625mg / ml进行细胞毒性测定，每浓度做10个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为32mg / ml ο
[0015]3、取32、16、8、0.8mg / ml药液，做10个复孔，观察对禽流感病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照，结果显示樟芝提取物4个不同浓度药物对禽流感病毒具有很好的抑制作用。见下表。
【权利要求】
1.一种抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征是，所述樟芝菌发酵全液乙醇提取物由下述方法制得: (1)加热浓缩:取经液体发酵的樟芝菌发酵全液及菌丝体或澄清液放于容器内，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2，真空度为0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使减压浓缩后的发酵全液或澄清液是原体积的1/4~1/2 ； (2)乙醇提取:经浓缩后的樟芝菌发酵全液或澄清液的温度降到30°C以下，往容器中加入80%-95%的乙醇，使浓缩后的樟芝菌发酵全液或澄清液的醇溶液的醇度达到60~70%左右，然后继续加热，温度控制在30~70°C，加热时间是30~120分钟； (3)过滤:之后冷却、以180~200目的筛网过滤樟芝菌发酵全液或澄清液，收集滤液，滤渣以其4~8倍体积的80%-95%乙醇稀释，重复上述操作I~2遍，离心收集滤液； (4)减压浓缩:离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2,真空度为0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，回收乙醇，使滤液浓缩至原有体积的1/5~1/10 ； (5)收集物干燥:将上述浓缩液，在50~60°C温度条件下干燥120~480小时，挥发多余的乙醇和水分； (6)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，置35°C条件下进行粉碎，经200目筛网过筛后，即为樟芝菌抗禽流感病毒活性的乙醇提取物； 其中，步骤(1)所述的 樟芝菌发酵全液是指樟芝发酵液与菌丝体的集合体， 步骤(1)所述的樟芝澄清液是指樟芝)发酵后澄清液。
2.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于所述樟芝发酵全液经分离获得樟芝发酵菌丝体和樟芝发酵澄清液。
3.如权利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述樟芝发酵全液通过以下步骤获得: (1)液体种子培养:采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节pH为3-8，培养温度为20-35°C，摇瓶转速为80-280r/min，培养7_15天，即可得到樟芝液体种子； (2)发酵罐发酵:先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1~0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当樟芝液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的樟芝种子接种到50L发酵罐的培养液中，调整pH为5-8，培养温度25-35°C，通气量0.5-1.1vvm,搅拌转速100-250r/min，培养7_30天，即可获得樟芝发酵全液。
4.如权利要求2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于，所述液体种子培养基或发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉I~3%蔗糖I~5% 蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5% 硫酸镁0.1~0.3%磷酸二氢钾 0.05~0.1%。
5.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征是，所述樟芝菌株名为樟芝iAntrodia camphorata) AcOOl。
6.如权利要求1所述的抗禽流 感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述滤液为乙醇水溶液，浓度为60-95%。
7.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于步骤(6)中所述收集物干燥使用真空干燥，真空度0.02-0.06Mpa，温度50~60°C，干燥120~480小时。
8.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物的制备方法，其特征在于步骤(7)中所述收集物粉碎时，置35°C条件下进行粉碎，采用200目的中药粉碎机对收集物进行粉碎过筛。
9.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物在制备抗禽流感病毒药物中的用途。
10.如权利要求9所述的抗禽流感病毒的樟芝菌发酵全液乙醇提取物在制备抗禽流感病毒药物中的用途，其特征在于所述樟芝发酵全液乙醇提取物在药物中的含量为10%-20%。`
【文档编号】A61P31/16GK103860605SQ201310403703
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】宋爱荣, 赵晨, 孔超, 秦丹, 梁大勇 申请人:青岛农业大学