一种熊胆粉纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种熊胆粉纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：在新鲜提取的熊胆汁中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和无菌蒸馏水，静置澄清，获得的上清液中加入2倍体积的无水乙醇，制得熊胆醇提物并加入大孔硅胶柱子；利用2倍体积75%无水乙醇分3次对硅胶柱子进行洗涤，收集洗涤液并加入到纤维素粉CF11柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，所得上清液，加入1/10体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，-20℃沉淀数小时后离心30min，收集沉淀并洗涤，所得沉淀溶于蒸馏水中，制成熊胆溶液，加热至50℃，加入复合蛋白酶进行脱色除腥，超滤膜过滤后，上清液经喷雾干燥后即可获得熊胆粉成品。本发明技术所得熊胆粉，有效含量高，色素含量低，无腥味，药用价值提升。
【专利说明】一种熊胆粉纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及熊体内提取物纯化【技术领域】，特别涉及一种熊胆粉纯化方法。
【背景技术】
[0002]熊胆，是熊科动物黑熊、东北马熊或棕熊胆囊内的干燥胆汁。在中国，云南、黑龙江、吉林、贵州、四川、青海、西藏、新疆、甘肃、湖北、湖南、陕西、福建等地均为熊胆产地。基于现代生物学技术加工熊胆，对其成份分析发现，熊胆中含有约20%的牛磺熊脱氧胆酸，为熊胆的主要成分，水解后产生磺酸和熊脱氧胆酸，除此之外，熊胆还含少量鹅脱氧胆酸及胆酸。
[0003]熊胆能清热解毒，明目，具有解痉、抗惊厥、利胆作用，对流感嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌、甲型链球菌、绿脓假单胞菌、卡他奈瑟菌等均有抑制作用。在治疗胆结石、急性黄疽烈肝炎和慢性乙型肝炎、急性结膜炎和白内障、抗脑血栓和脑缺血、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒、解热镇痛、降血脂及抗衰老等方面均发挥着药理作用及保健功效。
[0004]基于现有提取工艺，生产的熊胆粉含有大量的无机元素杂质及干扰色素，熊胆提取物中牛磺熊脱氧胆酸含量一般小于25%, 牛磺鹅脱氧胆酸含量一般小于65%,含水量高，易吸潮，难以储存和运输，难以形成高纯度、高质量的熊胆粉，限制了熊胆粉的药用价值。
【发明内容】
[0005]基于现有熊胆粉的提取及纯化技术问题，本发明提供一种熊胆粉纯化方法，利用本发明技术纯化处理后的熊胆粉，有效含量高，色素含量低，无腥味，水分含量低，不吸潮，适于储存、存放和运输，提升了熊胆粉的药用价值。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:
一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤:
(1)在新鲜提取的熊胆汁中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和无菌蒸馏水，震荡混匀，静置澄清，获得上清液；
(2)在步骤(1)中所得上清液中加入2倍体积的无水乙醇，制得熊胆醇提物；
(3)将步骤(2)所得熊胆提纯物加入大孔硅胶柱子，利用2倍体积75%无水乙醇分3次对硅胶柱子进行洗涤，收集洗涤液；
(4)用无菌蒸馏水对步骤(3)中所得洗涤液进行稀释，使得无水乙醇的浓度为16.5% ；
(5)将步骤(4)中所得含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm条件下，离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水,5000rpm条件下,离心5min ；
(6)收集步骤(5)中所得上清液，加入1/10体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀，-20°C沉淀，沉淀完成后，4°C条件下，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀；
(7)加入75%无水乙醇对步骤(6)中收集的沉淀进行洗涤，洗涤结束后，在4°C环境下，12000rpm离心30min,弃上清，收集沉淀；(8)将步骤(7)中所得沉淀，溶于蒸馏水中，搅拌I至3小时，制成熊胆溶液，调节pH为2至8，加热至50°C并保持该温度，加入复合蛋白酶，酶解结束后，灭酶，进行超滤膜过滤，获得的上清液经喷雾干燥后即可获得熊胆粉成品。
[0007]进一步，所述步骤(1)中熊胆汁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及无菌水蒸馏水的重量比为100:0.1~0.8:300~600，静置时间为2~3h ;
进一步，所述步骤(5)中利用纤维素粉CFll柱子对熊胆汁进行分离包括以下步骤 :
A)按照重量比为1:3.5:3.6:2.2:2.8的比例，将纤维素粉CFll粉末与氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、蒸馏水在搅拌作用下混合，制得纤维素粉CFll柱子；
B)将含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水，5000rpm条件下,离心5min ；
C)收集步骤B)中所得上清液。
[0008]进一步，所述步骤(8)中复合蛋白酶为中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及动物蛋白水解酶中的两种或两种以上的复合酶。
[0009]进一步，所述步骤(8)中酶浓度与熊胆溶液之比为800U/g~6000U/g，酶解时间I~6h,上清液喷雾干燥过程中，控制过筛目数为120~160目，进风温度为160°C~220°C，出风温度为40°C~70°C，最大水分蒸发量为5Kg/h~2000Kg/h，雾化盘最大转速为10000r/min ~50000r/min。
[0010]本发明涉及的熊胆粉纯化方法，有益效果体现在:
(I)本发明涉及的熊胆粉纯化工艺容易控制，易操作性强。
[0011](2)本发明涉及的熊胆粉纯化工艺，在新采集熊胆汁中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，有效阻止了胆汁中还原组分被外源氧化剂氧化产生难溶性物质，最大限度保证了熊胆汁的天然性。
[0012](3)本发明采用大孔硅胶和纤维素粉CFll柱子，进行双重纯化，提升了产品的纯度。
[0013](4)本发明采用复合蛋白酶对熊胆粉进行脱色除腥，有效降低了熊胆粉中有害色素的含量，同时除去了熊胆粉中的腥味，提升了产品的口感。
[0014](5)经过本发明技术纯化的熊胆粉中，有效含量高，牛磺熊去氧胆酸含量> 35%，远高于国家标准的23%，大大提升了熊胆粉的药用价值。
【具体实施方式】
[0015]本发明提供一种熊胆粉纯化方法，通过以下技术方案实现:
一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤:
(1)在新鲜提取的熊胆汁中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和无菌蒸馏水，震荡混匀，静置
澄清，获得上清液；
(2)在步骤(1)中所得上清液中加入2倍体积的无水乙醇，制得熊胆醇提物；
(3)将步骤(2)所得熊胆提纯物加入大孔硅胶柱子，利用2倍体积75%无水乙醇分3次对硅胶柱子进行洗涤，收集洗涤液；
(4)用无菌蒸馏水对步骤(3)中所得洗涤液进行稀释，使得无水乙醇的浓度为16.5% ；(5)将步骤(4)中所得含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm条件下，离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水,5000rpm条件下,离心5min ；
(6)收集步骤(5)中所得上清液，加入1/10体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀，-20°C沉淀，沉淀完成后，4°C条件下，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀；
(7)加入75%无水乙醇对步骤(6)中收集的沉淀进行洗涤，洗涤结束后，在4°C环境下，12000rpm离心30min,弃上清，收集沉淀；
(8)将步骤(7)中所得沉淀，溶于蒸馏水中，搅拌I至3小时，制成熊胆溶液，调节pH为2至8，加热至50°C并保持该温度，加入复合蛋白酶，酶解结束后，灭酶，进行超滤膜过滤，获得的上清液经喷雾干燥后即可获得熊胆粉成品。
[0016]所述步骤(1)中熊胆汁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及无菌水蒸馏水的重量比为100:
0.1~0.8:300~600，静置时间为2~3h。
[0017]所述步骤(5)中利用纤维素粉CFll柱子对熊胆汁进行分离包括以下步骤:
A)按照重量比为1:3.5:3.6:2.2:2.8的比例，将纤维素粉CFll粉末与氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、蒸馏水在搅拌作用下混合，制得纤维素粉CFll柱子；
B)将含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水，5000rpm条件下,离心5min ；
C)收集步骤B)中所得上清液。
[0018]所述步骤(8)中复合蛋白酶为中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及动物蛋白水解酶中的两种或两种以上的复合酶。
[0019]所述步骤(8)中酶浓度与熊胆溶液之比为800U/g~6000U/g，酶解时间I~6h，上清液喷雾干燥过程中，控制过筛目数为120~160目，进风温度为160°C~220°C,出风温度为40°C~70°C，最大水分蒸发量为5Kg/h~2000Kg/h，雾化盘最大转速为10000r/min~50000r/min。
[0020]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0021]实施例1:
在1000g新鲜提取的熊胆汁中加入6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和5000ml无菌蒸馏水，震荡混匀，静置澄清，获得5500ml上清液；所得上清液中加入IlOOOml的无水乙醇，制得16500ml熊胆醇提物并加入大孔硅胶柱子中，利用33000ml 75%无水乙醇分3次对硅胶柱子进行洗涤，收集洗涤液48000ml，所得洗涤液中加入162103ml无菌蒸馏水，使得无水乙醇的浓度为16.5% ;将含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm条件下,离心5min,获得上清液200000ml,继续在纤维素粉CFll柱子中加入200000ml的无菌蒸馏水，5000rpm条件下，离心5min，获得上清液190000ml，将两部分上清液混合，加入39000ml的3mol/L NaAc和390000ml的异丙醇，混匀，-20°C沉淀，沉淀完成后，4°C条件下，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀460g，加入75%无水乙醇对收集的沉淀进行洗涤，洗涤结束后，在4°C环境下，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀400g并溶于蒸馏水中，搅拌I至3小时，制成熊胆溶液，调节pH为2至8，加热至50°C并保持该温度，加入胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及动物蛋白水解酶，酶浓度与底物浓度之比为4000U/g，胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及动物蛋白水解酶的活性比例为3:1:4，酶解时间3小时，酶解结束后，进行灭酶过滤，上清液进行喷雾干燥，进风温度为180°C，出风温度50°C，最大蒸发量为7Kg/h。最后得到240g熊胆粉干粉，经检测牛磺熊去氧胆酸含量85g，有效成分含量为35.42%。[0022]虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本领域普通技术人员应当了解，可以不限于上述实施例的描述，在权利要求书的范围内，可作形式和细节上的各种变化。
【权利要求】
1.一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤: (1)在新鲜提取的熊胆汁中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和无菌水蒸馏水，震荡混匀，静置澄清，获得上清液； (2)在步骤(1)中所得上清液中加入2倍体积的无水乙醇，制得熊胆醇提物； (3)将步骤(2)所得熊胆提纯物加入大孔硅胶柱子，利用2倍体积75%无水乙醇分3次对硅胶柱子进行洗涤，收集洗涤液； (4)用无菌蒸馏水对步骤(3)中所得洗涤液进行稀释，使得无水乙醇的浓度为16.5% ； (5)将步骤(4)中所得含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm条件下，离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水,5000rpm条件下,离心5min ； (6)收集步骤(5)中所得上清液，加入1/10体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀，-20°C沉淀，沉淀完成后，4°C条件下，12000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀； (7)加入75%无水乙醇对步骤(6)中收集的沉淀进行洗涤，洗涤结束后，在4°C环境下，12000rpm离心30min,弃上清，收集沉淀； (8)将步骤(7)中所得沉淀，溶于蒸馏水中，搅拌I至3小时，制成熊胆溶液，调节pH为2至8，加热至50°C并保持该温度，加入复合蛋白酶，酶解结束后，灭酶，进行超滤膜过滤，获得的上清液经喷雾干燥后 即可获得熊胆粉成品。
2.根据权利要求1所述的一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中熊胆汁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及无菌水蒸馏水的重量比为100:0.1~0.8:300~600，静置时间为2~3h。
3.根据权利要求1所述的一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，所述步骤(5)中利用纤维素粉CFll柱子对熊胆汁进行分离包括以下步骤: A)按照重量比为1:3.5:3.6:2.2:2.8的比例，将纤维素粉CFll粉末与氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸钠、蒸馏水在搅拌作用下混合，制得纤维素粉CFll柱子； B)将含有16.5%无水乙醇的熊胆汁上清液加入到纤维素粉CFll柱子中，涡旋振荡混匀，进行熊胆汁分离，5000rpm离心5min，离心结束后，在纤维素粉CFll柱子中加入等体积的无菌蒸懼水，5000rpm条件下,离心5min ； C)收集步骤B)中所得上清液。
4.根据权利要求1所述的一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，所述步骤(8)中复合蛋白酶为中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及动物蛋白水解酶中的两种或两种以上的复合酶。
5.根据权利要求1所述的一种熊胆粉纯化方法，其特征在于，所述步骤(8)中酶浓度与熊胆溶液之比为800U/g~6000U/g，酶解时间I~6h，上清液喷雾干燥过程中，控制过筛目数为120~160目，进风温度为160°C~220°C，出风温度为40°C~70°C，最大水分蒸发量为 5Kg/h ~2000Kg/h,雾化盘最大转速为 10000r/min ~50000r/min。
【文档编号】A61K31/575GK103520210SQ201310523280
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】严忠贵, 成传英, 向泽方 申请人:成都盛源堂生物科技有限公司