重组猪促卵泡激素融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了重组猪促卵泡激素融合蛋白(Porcine?follicle-stimulating?hormone-Fc?fusion?protein，简称pFSH-Fc)及其制备方法，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含pFSHβ亚基、CTP、pFSHα亚基、肽接头和人IgG?Fc变体。该重组pFSH-Fc融合蛋白比现有pFSH具有更长的体内半衰期，以及更好的药效。本发明还涉及重组pFSH-Fc融合蛋白在制备动物繁殖领域药物中的用途。
【专利说明】重组猪促卵泡激素融合蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学及畜牧领域。更具体地，本发明涉及重组猪促卵泡激素融合蛋白(PFSH-Fc)、其制备方法及其在畜牧生殖上的应用。该融合蛋白与现有猪垂体来源的促卵泡激素比较，具有更长的半衰期及更好的药效。
【背景技术】
[0002]猪促卵泡素(PorcineFollicle-stimulating hormone,简称 pFSH)是动物繁殖领域常用的药物主要成分，现有上市PFSH是从猪脑垂体前叶提取的糖蛋白激素，SDS-PAGE检测其分子量为43KD。pFSH可促进母猪卵巢中卵泡的发育，每个卵泡中包含一个成熟的卵子。这些卵泡成熟时，会分泌雌激素，后者会刺激母猪表现出典型的静立发情行为。此外，pFSH还能刺激公畜细精管上皮及次级精母细胞的发育，促进精子形成。
[0003]猪垂体提取的pFSH收集和分离纯化难，同时还存在病毒污染、原料来源有限、纯度低、生产成本高等缺陷，并且其半衰期短导致需要频繁给药，使用受限。
[0004]相比而言，重组pFSH在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有生化FSH产品无法比拟的优点。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell, CH0)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。
[0005]pFSH是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证PFSH的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。迄今为止，还未有重组PFSH产品用于兽药领域。
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供重组猪促卵泡激素融合蛋白(Porcine follicle-stimulatinghormone-Fc fusion protein,简称pFSH-Fc)、其制备方法及应用，该重组pFSH-Fc融合蛋白应用于动物繁殖领域，与现有猪垂体PFSH活性类似，且具有纯度高、半衰期显著延长等特点。
[0007]本发明的一个目的是提供一种重组pFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含pFSHii亚基、CTP、pFSHa亚基、肽接头(Linker，简称 L)和人 IgG Fe 变体，如 SEQ ID NO:2、4、6 所示(pFSHβ-CTP-pFSHa-L_vIgG2Fc、pFSH β -CTP-pFSH a -L_vIgG4Fc 或 pFSH β -CTP-pFSH a -L-vIgGlFc 氨基酸序列)，优选的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2(pFSH0 -CTP-pFSHa -L-vIgG2Fc)，上述融合蛋白统称为 pFSH-Fc。
[0008]所述的pFSHP亚基的氨基酸序列去除了常规pFSHP亚基中的1_18位氨基酸残基，如SEQ ID NO:8所示。
[0009]所述的CTP (carboxy-terminal peptide)的氨基酸序列来自人HCG β链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCG β链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQID NO:9 所示。
[0010]所述的pFSHa亚基的氨基酸残基序列去除了常规pFSH α亚基中的1_24位氨基酸残基，如SEQ ID N0:7所示。
[0011 ] 所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerο
[0012]所述的人IgG Fe变体包括:(I)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(2)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；(3)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgGl绞链区、CH2和CH3区域。优选的人IgGFe变体是，含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。
[0013]以下具体介绍本发明的人IgG Fe变体、肽接头和CTP功能:
[0014]IgG Fe 变体
[0015]IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而Fe片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。
[0016]Fe来自免疫球蛋白的Fe区域，Fe在消灭病原体的免疫防御中具有重要作用。IgG的效应子功能由Fe介导，通过两种主要机制:(I)与细胞表面Fe受体(FcyRs)的结合，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3能有效的结合FcyRs0 IgG4与Fe Y Rs的结合亲和力比IgGl和IgG3的低一个数量级，而IgG2与Fe Y Rs的结合低得难以测定。人IgGl和IgG3还能有效地结合Clq，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力。对于医疗用途而言，重组二聚化蛋白的Fe区域必须不会介导效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，pFSH-Fc的Fe区域必须是非裂解性的，即在结合Fe Y Rs和Clq而触发效应子功能方面，Fe最好是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生pFSH-L-Fc重组二聚化蛋白。为了得到非裂解性的Fe，必须使天然Fe区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。为此，本发明使用下列人IgG Fe变体:
[0017](I) IgG2Fc 变体(vIgG2Fc):含有 Pro331Ser 突变的人 IgG2 绞链区、CH2 和 CH3 区域；
[0018](2) IgG4Fc 变体(vIgG4Fc):含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的人 IgG4 绞链区、CH2和CH3区域；
[0019](3) IgGlFc 变体(vlgGlFc):含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro33ISer 突变的人IgGl绞链区、CH2和CH3区域。优选的人IgG Fe变体是，含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。
[0020]肽接头
[0021]连接肽的长度对重组二聚化蛋白的活性非常重要。本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独特的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得pFSHa链的C端与Fe变体偶联的重组二聚化蛋白，中间有柔软的肽接头。此重组二聚化蛋白不仅不会导致PFSH的功能丧失，反而能够维持、甚至提高pFSH-Fc重组二聚化蛋白的生物活性。优选肽接头的氨基酸残基序列为 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0022]此外，本发明还发现，在pFSHa和人IgG Fe变体间添加的肽接头以两种方式提高PFSH-Fc的体外生物活性:(1)使Fe区域远离pFSH上的结构域，和(2)使一个pFSH远离另一个pFSH的结构域，从而降低空间位阻效应。且人的IgG Fe变体在CH2区域在228、234、235,331位点含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能。 [0023]CTP
[0024]糖基化对于蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位点有两类，包括O-糖肽链和N-糖肽链。CTP是一段来自人HCG β键羧基末端的28-34个氨基酸残基，有文献报道HCG较FSH相对长的半衰期，主要来源于HCGii键羧基末端CTP肽段。它含有4个O-连接的糖基化位点，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延长蛋白在体内的半衰期。
[0025]本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白具有以下特征:该重组融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含pFSHii亚基、CTP、pFSHa亚基、肽接头和人IgGFe变体。
[0026]人IgG Fe变体具有延长体内半衰期和稳定蛋白的作用，Fe变体是非裂解性的，可减少Fe Y Rs和Clq结合而触发的效应子功能。CTP可提高蛋白活性及延长体内半衰期，用CTP连接pFSH的α链和β链，可以使两条链之间有一定的位阻，从而方便其正确折叠。通过柔软的肽接头进行pFSH α链的C端与Fe变体的偶联，能够维持、甚至提高重组pFSH_Fc融合蛋白的生物活性。
[0027]本发明另一个目的是提供重组pFSH-Fc融合蛋白的制备方法，该制备方法包括:
[0028](I)构建编码重组pFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体；
[0029](2)重组pFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达；
[0030](3)高密度细胞培养重组pFSH-Fc融合蛋白；
[0031 ] (4)重组pFSH-Fc融合蛋白的纯化制备。
[0032]具体来说，构建编码重组pFSH-Fc蛋白的基因表达载体步骤为:采用人工合成方法获得编码重组PFSH-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO:1、3、5所示)，插入到哺乳动物细胞表达载体(如PCBAEA3)或改进的表达载体(如pCMV-DHFR)，获得含有pFSH-Fc目的基因表达质粒pCBAEA3-pFSH-Fc (图6)。优选的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0033]所述的哺乳动物细胞表达载体可采用市售的但不限于，如:p⑶NA3、pCBAEA3、pCMV / ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选，pCBAEA3。
[0034]重组pFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达步骤为:将含有PFSH-Fc蛋白的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，利用筛选标记筛选和扩增选择性标记获得稳定闻表达目的蛋白的细胞株。
[0035]所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO和Sp2 / O细胞。优选，CHO细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR(Dihydrofc)IateReductase, 二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO细胞(简称CH0-DHFR-)。
[0036]所述的转染方法包括磷酸钙法，电转法，脂质体转染，优选的转染方法是电转法。[0037]所述的筛选方法是先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达细胞株。筛选标记是本领域内已知的任何一个合适的选择性抗性标记，如ZEO (Zeocin,博来霉素)、G418 (氨基糖苷类抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP (Hygromycin,潮霉素)，优选的抗性基因为ZEO ;筛选标记也可为本领域内已知的任何一个突光标记基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,绿色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,红色突光蛋白)，优选的突光标记基因为GFP。扩增选择性标记是本领域内已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)序列，优选的扩增选择性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶(DHFR)，无法自身合成四氢叶酸,所以必须在添加了次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与DHFR基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于DHFR可被叶酸类似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX浓度选择压力下，DHFR基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与DHFR基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着DHFR基因的扩增而扩增，可得到大量表达外源蛋白的细胞克隆。
[0038]高密度细胞培养重组pFSH-Fc融合蛋白的步骤为:将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或生物反应罐进行大规模培养，特别是，本发明通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组pFSH-Fc融合蛋白的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、重组蛋白质量和产量提升、重组蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0039]所述的细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到I X IO7个/ mL时，将温度由37°C降至33°C，在该温度下培养直至表达产量不再增加。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。
[0040]所述的细胞培养条件的优化方法还包括在培养基中加入特殊的添加剂，优选，在基础培养基加入100 μ M Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。该方法可使重组pFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20 %。
[0041 ] 重组pFSH-Fc融合蛋白的纯化制备步骤为:
[0042]DProtein A亲和层析:离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fe片段的特性，利用亲和ProteinA柱层析。
[0043]2)疏水层析柱纯化:采用疏水层析柱，根据重组pFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，进一步去除上述Protein A纯化后目标蛋白中的杂质。
[0044]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0045]本发明所公开的重组pFSH-Fc融合蛋白的制备方法，该制备方法可获得表达产量高重组pFSH-Fc融合蛋白。因与人IgG Fe变体的偶联,所形成的重组蛋白可以通过ProteinA亲和层析得到高效便捷的纯化。经疏水层析进一步纯化后得到的融合蛋白纯度达到98%以上。此外，本发明所公布的重组PFSH-Fc融合蛋白中α链和β链可正确折叠在一起，避免了 α-α 二聚体、β-β 二 聚体的出现，大大简化了纯化步骤，降低了生产成本。
[0046]本发明的还一个目的是提供了含有重组pFSH-Fc融合蛋白的药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的重组PFSH-Fc融合蛋白。
[0047]具体来说，所述的药物组合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;较佳的0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本发明的重组长效pFSH-Fc融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
[0048]所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于):蔗糖、甘露醇、吐温20 (Tween20)、蛋氨酸、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、及其组合物。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0049]本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；动物所要治疗疾病的严重程度、动物的体重、动物的免疫状况、给药途径等。
[0050]本 发明的再一个目的是重组pFSH-Fc融合蛋白在动物繁殖领域中的应用。
[0051]本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，从而改善了药物动力学和药效，与现有PFSH比较，可大大减少注射次数，使用更方便。
[0052]本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白及其制备方法的优点概括如下:
[0053]1.本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白是由Fe和CTP与pFSH有序偶联形成的新型融合蛋白，维持了 pFSH的正确空间构型，可显著延长蛋白的体内半衰期，大大提高pFSH在CHO细胞中的表达量。
[0054]2.二聚化单链pFSH-Fc融合蛋白的α链与β链以共价键正确折叠，避免形成α-α 二聚体和β-β 二聚体，大大简化了纯化工艺，降低生产成本。
[0055]3.本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，其半衰期是现有猪垂体FSH的10倍以上，可减少注射次数，且其药效更优。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1.显示了人IgGl、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。
[0057]图2显示了 pFSH-Fc单链及二聚化结构示意图。a)未二聚化前的单链pFSH_Fc ；
b)二聚化的 pFSH-Fc。
[0058]图3.显示了在 pCBAEA3 表达载体内 HindII1-EcoRI 片段的 pFSH-Fc (pFSH β -CTP-pFSHa-L-vIgG2Fc)的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。pFSH_Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽、PFSH0链、CTP、成熟pFSHa链、肽接头、人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)。成熟的重组pFSH-Fc融合蛋白含有成熟pFSHii链、CTP、成熟α链、肽接头和人IgG2Fc变体(vIgG2Fc)。
[0059]图4.显示了在 PCBAEA3 表达载体内 HindII1-EcoRI 片段的 pFSH-Fc (pFSH β -CTP-pFSHa-L-vIgG4Fc)的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。pFSH_Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽、pFSHii链、CTP、成熟pFSHa链、肽接头、人IgG4Fc变体(vIgG4Fc)。成熟的重组pFSH-Fc融合蛋白含有成熟pFSHii链、CTP、成熟α链、肽接头和IgG4Fc变体(vIgG4Fc)。
[0060]图 5.显示了在 PCBAEA3 表达载体内 HindII1-EcoRI 片段的 pFSH-Fc (pFSH β -CTP-pFSHa-L-vIgGlFc)的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。pFSH_Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽、PFSH0链、CTP、成熟pFSHa链、肽接头、人IgGlFc变体(vlgGlFc)。成熟的重组pFSH-Fc融合蛋白含有成熟pFSHii链、CTP、成熟α链、肽接头和人IgGlFc变体(vlgGlFc)。 [0061]图6显示了所构建编码pFSH-Fc融合蛋白的真核表达质粒图谱。该表达质粒含有10个主要基因片断，包括1.CMV启动子；2.目标基因pFSH-Fc ;3.EMCV IRES ;4.DHFR扩增基因；5.1RES ；6.增强绿色荧光蛋白基因EGFP ；7.BGH终止子；8.SV40启动子；9.新霉素抗性基因(Neomycin) ; 10.SV40终止子；11.PUC复制起始位点(ori) ；12.青霉素抗性筛选基因(Ampcillin)。
[0062]图7.显示了在7L生物反应器中细胞株表达分泌pFSH-Fc蛋白的活性趋势曲线图。
[0063]图8.Western bloting结果显示了重组pFSH_Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达。非还原胶，Lanel:本发明的重组pFSH-vIgGlFc融合蛋白(约140kDa) ;Lane2:本发明的重组pFSH-vIgG2Fc融合蛋白(约140kDa) ；Lane3:本发明的重组pFSH_vIgG4Fc融合蛋白(约 140kDa) ；Lane4:猪垂体 FSH (约 43kDa)。
[0064]图9.显示了本发明重组pFSH-Fc在非还原条件下的10 % SDS-PAGE电泳图谱。Lanel:本发明的重组pFSH-vIgGlFc融合蛋白(约140kDa) ;Lane2:本发明的重组pFSH-vIgG2Fc融合蛋白(约140kDa) ；Lane3:本发明的重组pFSH_vIgG4Fc融合蛋白(约140kDa)
[0065]图10.显示了纯化的重组pFSH-Fc融合蛋白与猪垂体FSH在大鼠体内的代谢曲线。
【具体实施方式】
[0066]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0067]实施例1.构建编码重组pFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体
[0068]采用人工合成的方法合成含有编码pFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和pFSHa链成熟肽段的融合基因，将所合成的756bp DNA片段插入转移载体如pUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，获得了 pFSH质粒(ppFSH)，使用DNA测序方法验证插入序列的正确性。
[0069]分别人工合成含有BamHI (5’端)和EcoRI (3’端)酶切位点的编码柔性肽接头(Linker，检测“L”)和 Fe 变体(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)片段的融合基因 L_vIgG2Fc、L-vIgG4Fc和L-vIgGlFc。将获得的融合基因片段分别插入到转移载体如TOC19的BamHI和EcoRI位点间,得到含三种变体的质粒,分别为pL-vIgG2Fc、pL_vIgG4Fc和pL_vIgGlFc。通过DNA测序验证L_vIgG2Fc、L_vIgG4Fc和L-vIgGlFc的基因序列。为制备pFSH_L_Fc融合基因，用限制性内切酶SpeI和BamHI双酶切pFSH质粒，凝胶电泳后胶回收编码pFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和pFSHa链成熟肽段的融合基因片段，经纯化的上述基因片段分别插入到pL-VIgG2FC、pL-VIgG4Fc和pL-vIgGlFc质粒中肽接头的5'-端，T4连接酶连接构成pFSH-L-vIgG2Fc、pFSH-L_vIgG4Fc和pFSH-L-vIgGlFc质粒。所构建的融合基因由pFSHi1、CTP、pFSHa、肽接头和Fe变体基因组成，其单链结构如图2a所示，二聚化结构如图2b所示。
[0070]限制性内切酶SpeI / EcoRI 分别双酶切 ppFSH-L_vIgG2Fc、ppFSH-L_vIgG4Fc和 ppFSH-L-vIgGlFc 质粒，DNA 凝胶纯化得到 pFSH-L_vIgG2Fc、pFSH-L_vIgG4Fc 和pFSH-L-vIgGlFc片段。将纯化好的三种pFSH_L-Fc片段插入到哺乳动物细胞表达质粒如pCBAEA3的相应酶切位点间，最终获得含融合基因表达质粒pCBAEA3-pFSH-L-VIgG2Fc、pCBAEA3-pFSH-L-vIgG4Fc 和 pCBAEA3-pFSH-L_vIgGlFc，统称为 pCBAEA3-pFSH_Fc 质粒，如图6所示。该质粒含哺乳动物细胞高效表达外源基因蛋白所需的启动子CMV ;该质粒还含有两种选择性标记基因，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，在哺乳动物细胞中可以具有新霉素(Neomycin)抗性。此外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCBAEA3表达载体所含有的小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在时，能共扩增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。
[0071]用CTP肽段连接pFSH的α链和β链，可便于两条链正确折叠。通过肽接头(较佳地为柔性接头)进行pFSH和Fe片段的偶联可提高蛋白的生物活性，对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸的肽接头，当然由I个氨基酸构成的肽接头也在本发明的保护范围内，宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。本发明实施例的肽接头含有Gly-Ser肽构件，其氨基酸序列为 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0072]实施例2.重组pFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的稳定表达
[0073]将实施例1构建的表达质粒pCBAEA3-pFSH-L-Fc转染入DHFR酶缺陷型CHO宿主细胞(CH0-DHFR_)，图2b显示了`重组二聚化pFSH-Fc融合蛋白的示意图。采用电穿孔方法进行转染，使用 960 μ Fd 电容的 Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA)，将其电场设置为250V，在比色杯内的2~5X107个细胞中加入10 μ g用PvuI线性化的质粒DNA。在转染两天后,将培养基改成含IOOyg / mL Zeocin抗性标记基因的生长培养基，获得经抗性初筛的转染子。采用western blotting的方法,用抗pFSH抗体检测pFSH-Fc的表达，如图8。利用DHFR扩增选择性标记基因提高重组二聚化蛋白的表达水平，为此在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的重组二聚化蛋白基因。用极限稀释法亚克隆能在高达10 μ M / mLMTX培养基中生长的转染子。对亚克隆细胞系的分泌率作进一步分析。筛选分泌水平超过约10(较佳地约20) μ g/106(即百万)个细胞/ 24小时的细胞株，获得三种稳定高表达重组pFSH-Fc融合蛋白的细胞株，分别为重组 pFSH-L-vIgG2Fc、重组 pFSH-L_vIgG4Fc 和重组 pFSH-L-vIgGlFc。。
[0074]实施例3.重组pFSH-Fc融合蛋白的生产和纯化
[0075]将实施例2得到的高产量细胞株，首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养，驯化过程中同时进行培养基的筛选，加入不同的成分观察细胞的生长状态、生长趋势，以及表达产物的活性和唾液酸等生化指标，优选的细胞培养条件为:基础培养基加入100 μ M Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，该方法可使重组PFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20 %。驯化成功后，进行细胞扩增，扩增到足够量，进行7L生物反应器监测培养，在细胞密度超过I X IO7个/mL时开始降温至33°C培养，批次生长周期为20天，用Iml ProteinA柱层析对重组蛋白进行初步纯化，测定重组hFSH-Fc融合蛋白的表达量，结果显示，重组pFSH-L-vIgG2Fc、重组pFSH-L_vIgG4Fc和重组pFSH-L-vIgGlFc细胞株表达的重组二聚化蛋白累积产量分别为1.62g / L、0.82g / L、0.78g/L(图7)。
[0076]重组pFSH-Fc融合蛋白的纯化包括以下步骤:
[0077]DProteinA亲和层析:离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fe片段的特性，利用亲和层析方法，将上清液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的ProteinA柱；待重组融合蛋白结合于ProteinA后，用PBS洗涤该柱，直至0D280值低于0.01，再用20mM pH为4.0的醋酸钠缓冲液洗脱结合的重组PFSH-Fc融合蛋白，最后用ρΗΙΟ.0的IMTris-HCl缓冲液中和活性收集液。纯化的pFSH-Fc蛋白纯度可达到95%以上。
[0078]2)疏水柱层析:用超滤方法将上述protein A活性收集液更换为20mMTris-HCl-l.5MNaCl (pH8.0)缓冲液，将该样品加样到用 20mM Tris-HCl-l.5M NaCl (pH8.0)平衡过的phenyl-6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mM Tris-HCl-l.35MNaCl (ρΗ8.0)淋洗，最后用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (ρΗ8.0)缓冲液洗脱。
[0079]Western bloting结果显示了重组pFSH-Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达,如图8所示，在非还原条件下SDS-PAGE胶电泳图谱，猪垂体FSH (商业产品)和本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白分别在43kDa和140kDa显示相对应的目标蛋白杂交条带,验证了本发明得到的重组PFSH融合蛋白中含有FSH蛋白。图9是纯化的pFSH-Fc融合蛋白在非还原条件下的SDS-PAGE胶电泳图谱。结果显示，纯化的pFSH-Fc蛋白纯度可达到98%以上。
[0080]实施例4.重组pFSH-Fc融合蛋白的体内外活性测定
[0081 ] 本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白的体外活性(免疫原活性)采用B10CHECK (美国)公司生产的FSH酶免疫定量检测试剂盒检测，方法参考试剂盒说明书。体内活性采用2010版《英国药典》中的卵巢增重法进行检测。蛋白质含量测定使用LOWRY定量法。取HCG制剂，加0.1%白蛋白磷酸盐缓冲液(pH7.2±0.2)溶液，制成含有70IU / mlHCG的供试品稀释液。根据标准品标示量、猪垂体FSH和重组pFSH-Fc融合蛋白估计效价，用供试品稀释液(ρΗ7.2±0.2)将标准品、猪垂体FSH和重组pFSH-Fc融合蛋白配制成合FSH3.33IU / ml、1.67IU / ml、0.83IU / ml高中低三个剂量的工作液。选用19~28日龄，年龄相差不得超过3日，体重相差不得超过10克的Wistar雌鼠。标准品、猪垂体FSH组和重组pFSH-Fc融合蛋白组均分为高中低三个剂量，每组6只动物。大鼠颈后皮下注射，每天注射两次，每次注射体积为0.2ml，连续注射三天，每天在相同时间给药。最后一次注射给药24小时后，按照给药顺序采用脱白法处死动物，取卵巢，剥离吸干表面水分后称重，记录器官重量。根据标准品卵巢增重采用量反应平行线法计算猪垂体FSH和重组pFSH-Fc融合蛋白的活性。测得重组 pFSH-L-vIgG2Fc、pFSH-L_vIgG4Fc、pFSH-L-vIgGlFc 和猪垂体 FSH 的体外活性分别为 9022、9020、8956 和 8321IU / ml，其体内活性分别为 8990、8975、8310 和 7523IU / ml。结果表明，本发明的重组pFSH-Fc融合蛋白具有体内外生物学活性。
[0082]实施例5.重组pFSH-Fc融合蛋白的药代动力学测定[0083]分为本发明重组pFSH-Fc融合蛋白(包括重组pFSH_vIgGlFc、pFSH_vIgG2Fc和PFSH-vIgG4Fc)给药组和猪垂体FSH给药组，每组选用体重200_250g的雄性wistar大鼠5只，分别按20IU / kg给予肌肉注射。猪垂体FSH组在给药后l、2、3、4、6、8、12、36、60h取血，重组 pFSH-Fc 融合蛋白分别在给药后 l、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、340h 取血，3000rpm离心5min后，吸取取血清，_20°C保存。采用ELISA试剂盒(B10CHECK，美国)测定各时间点血浆中FSH免疫活性。使用kinetica4.4软件，通过统计距法计算各组主要药代动力学参数。各组药代动力学曲线如图10所示，半衰期结果如表1。结果显示，猪垂体FSH在大鼠体内的消除半衰期约为3.07h，而等剂量本发明重组pFSH-vIgG2Fc融合蛋白给药组、重组pFSH-v I gG4Fc融合蛋白给药组、重组pFSH_v I gG IFc融合蛋白的消除半衰期约分别为48.84h、38.24h、35.22h，是猪垂体FSH的10倍以上。
[0084]表1本发明重组pFSH-Fc融合蛋白的半衰期
【权利要求】
1.重组pFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含pFSHii亚基、CTP、pFSHa亚基、肽接头和人IgG Fe变体。
2.根据权利要求1所述的重组pFSH-Fc融合蛋白，其中所述的pFSHP亚基的氨基酸序列是去除了常规PFSH0亚基中的1-18位氨基酸残基之后的pFSHii SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是来自HCG β链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO:9所示；其中所述的pFSHa亚基的氨基酸残基序列是去除了常规pFSHa亚基中的1-24位氨基酸残基之后的pFSHa SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；其中所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于pFSHa亚基和人IgG Fe变体之间，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸，优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根据权利要求1的重组pFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgGFc变体选自下组: (i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。
4.根据权利要求1所述的重组pFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。优选的氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
5.编码根据权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID N0:l、3或5所示。优选的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
6.—种权利要求1的重组pFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其步骤包括: 1)构建编码重组PFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体: 采用人工合成方法获得编码人PFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有PFSH-Fc融合蛋白基因的表达质粒； 2)重组pFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达: 将含有PFSH-Fc融合蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达PFSH-Fc融合的细胞株； 3)高密度细胞培养重组pFSH-Fc融合蛋白: 将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到I X IO7个/ mL时，将温度由37°C降至33°C，在该温度下培养直至表达产量不再增加； 4)重组pFSH-Fc融合蛋白的纯化制备: a)ProteinA亲和层析:离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fe片段的特性，利用亲和ProteinA柱层析； b)疏水层析柱纯化:经疏水层析纯化进一步去除上述ProteinA纯化后目标蛋白中的杂质。 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根据权利要求6所述的重组pFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤I)中所述的基因表达载体为 pCDNA3、pCBAEA3、pCMV / ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，优选，PCBAEA3 ;其中步骤2)中所述的细胞转染方法包括电穿孔转染方法、磷酸钙转染、脂质体转染和原生质融合，优选，电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO(ChineseHamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)，HEK293、BHK、NS0和Sp2 / O细胞，优选，CHO细胞，更优选，DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。
8.根据权利要求6所述的重组pFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤3)中还包括在培养基中加入添加剂，优选，在基础培养基加入ΙΟΟμΜ Cu2+，feeding培养基加入2mMManNAc (N-乙酸基-D-氛基甘露糖)。
9.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-8任意一项权利要求所述的重组pFSH-Fc融合蛋白。
10.权利要求1的重组PFSH-Fc融合蛋白在制备动物繁殖领域药物中的应用。
【文档编号】A61P15/00GK103554269SQ201310529900
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】侯永敏, 吴茂柏, 李屹晨, 雷瑶, 王安新, 邓衡露 申请人:广州优联康医药科技有限公司