多肽及其用途
【专利摘要】本发明公开了多肽及其用途，其中分离的多肽具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。该多肽是AQP4蛋白的优势表位，利用该多肽能够有效地制备AQP4特异性的多克隆抗体，并且制备获得的AQP4多克隆抗体能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
【专利说明】多肽及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药与生物检测【技术领域】，具体而言涉及多肽及其用途，更具体地，本发明涉及分离的多肽及其在制备AQP4多克隆抗体中的用途，制备AQP4多克隆抗体的方法，AQP4多克隆抗体，用于检测AQP4的试剂盒和用于治疗AQP4相关疾病的药物。
【背景技术】
[0002]AQP (aquaporins)家族是近几年来逐渐被发现并认识的一类与水通透有关的膜转运蛋白，广泛分布于机体多处涉及水分子快速跨膜转运的部位，在维持体内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用。在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白(AQP0-AQP12)。
[0003]AQP4是1994年被克隆确认的水通道蛋白家族中的一员，它广泛存在于哺乳动物体内，主要分布于肺、脑、眼等组织内，是脑和眼内分布最多、最广泛的水通道蛋白之一，兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，在脑和视网膜内水、电解质运输平衡以及眼内压恒定的调节等方面发挥着重要作用。
[0004]AQP4由4个独立的具有活性的亚基单位组成的四异聚体结构，每个亚基的分子量约30kd。AQP4分子的氨基端和羧基端均位于胞内，整个分子前后两部分在序列上相似，呈180度定位的正面对称结构。每个亚单位含有6条疏水性的跨膜α右手螺旋结构，每个亚基单位都有独立的转运水的孔道。各亚单位间有5个不同长度的连接环(Α、B、C、D和E环)，Α、C、E环为胞外环，B、D环为胞内环。Α、C、D环为3个不同长度的连接环；B、E环为2个功能性的长环，分别含3个主要为天冬-脯-丙氨酸(NPA)的氨基酸，这2个NPA环从双分子层相对的面折叠入膜中，在双分子层中线处交叉重叠就形成了狭窄的开放水孔道，且周围被6条跨膜的螺旋所包绕，分子重组体的研究已经预测其每个单位的孔道呈“沙漏”模型。研究证实，大多数AQP膜上存在一种对汞制剂敏感的水通道蛋白，即在第189位氨基酸残基是半胱氨酸，可与汞结合从而堵塞水通道，AQP4在该位置无半胱氨酸，故对汞制剂不敏感，因此AQP4又称为汞不敏感性水通道蛋白。
[0005]由于AQP4与青光眼的发病机制有密切关系，此外，它还与一些神经疾病相关，因此，AQP4在某些疾病中的检测有重要意义。由于抗体对于蛋白质的基础研究及其检测方法都是必须的，因此开发AQP4的抗体意义重大。目前，单克隆抗体的亲和力较差且得到一个亲和力较高的单克隆抗体(亲和力常数大于IO8)比较难，而制备多抗比较容易，且多抗亲合力较高，但是现有的AQP4多克隆抗体特异性较差且假阳率高。
[0006]因而，目前选取合适的AQP4蛋白的肽段并制备特异性好、亲合力高的AQP4多克隆抗体，意义重大。
【发明内容】
[0007]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于制备AQP4多克隆抗体的多肽，另一个目的在于提出一种特异性好、亲合力高的AQP4多克隆抗体。[0008]首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
[0009]发明人利用生物信息学的方法分析了 AQP4的抗原信息，得到了四个AQP4的抗原表位(即 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7 所示的 4 条多肽)，并合成了这些AQP4的抗原表位。接着，发明人将上述合成的4个AQP4的抗原表位分别与KLH蛋白偶联，并以4种蛋白偶联物为抗原分别免疫国产大耳白兔，然后分别收集获得相应的免疫动物血清。接下来，发明人通过ELISA方法测定了各抗血清的效价，结果表明，四条多肽与KLH的融合蛋白免疫后的兔血清中均含有其对应抗原表位的抗体。接着，发明人又利用ELISA的方法检测了 4条表位肽与KLH的融合蛋白免疫获得的兔源抗血清与AQP4蛋白的相互作用，结果表明，其中仅具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽与KLH的融合蛋白免疫兔子产生的抗血清可以与AQP4蛋白相互作用，且此相互作用有剂量依赖关系，说明具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽是AQP4蛋白的优势抗原表位。接下来，发明人又利用Western Blot的方法检测了具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽与KLH的融合蛋白免疫兔子产生的抗体与AQP4蛋白的相互作用，结果表明，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽与KLH的融合蛋白免疫兔子产生的抗体可以与AQP4蛋白相互作用(即特异性结合)，且此相互作用具有良好的剂量依赖关系，而与无关蛋白则无此相互作用，进一步证明了筛选的具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽是AQP4蛋白的优势抗原。进一步地，发明人又通过ELISA的方法检测了前述利用具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽与KLH的融合蛋白免疫兔子制备的多克隆抗体与AQP4蛋白及无关蛋白的相互作用，结果表明，该多克隆抗体只与AQP4蛋白相互作用，与其他无关蛋白则无此相互作用，进一步证明了该多克隆抗体与AQP4蛋白的结合是特异性的。
[0010]由此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该分离的多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，本发明的多肽是AQP4蛋白的优势表位，利用该多肽能够有效地制备AQP4特异性的多克隆抗体，并且制备获得的AQP4多克隆抗体能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。此外，根据本发明实施例的多肽，能够作为治疗AQP4相关疾病的药物的药物靶点，并且该多肽也能够直接用于制备治疗AQP4相关疾病的药物。
[0011]根据本发明的一些实施例，所述分离的多肽是由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的。
[0012]根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的多肽在制备AQP4多克隆抗体中的用途。根据本发明的实施例，利用该多肽能够有效地制备AQP4特异性的多克隆抗体，并且制备获得的AQP4多克隆抗体能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
[0013]根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种制备AQP4多克隆抗体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:利用前面所述的分离的多肽免疫动物，以便获得经过免疫的动物；以及收集所述经过免疫的动物的血清并纯化，以便获得所述AQP4多克隆抗体。发明人发现，利用该 方法能够高效地制备AQP4多克隆抗体，并且获得的AQP4多克隆抗体对AQP4蛋白的亲合力高、特异性好，能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
[0014]根据本发明的一个实施例，所述多肽是通过化学合成法制备获得的。由此，获得的多妝纯度闻，有利于抗体的制备。
[0015]根据本发明的一个实施例，所述动物为兔，优选国产大耳白兔。由此，制备抗体的效率高，获得的抗体特异性好。
[0016]根据本发明的一个实施例，通过心脏取血进而收集获得所述血清。由此，有利于免疫血清(在本文中有时也称为“抗血清”)的获得。
[0017]根据本发明的一个实施例，利用前面所述的分离的多肽免疫动物，进一步包括:将所述多肽与KLH蛋白偶联制成融合蛋白；将所述融合蛋白分别经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化，以便分别获得经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白和经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白；利用所述经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白，经皮下注射接种于所述动物，以便获得经过皮下注射接种的动物；皮下注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过皮下注射接种的动物进行第一腹腔注射接种，以便获得经过第一腹腔注射接种的动物；以及第一腹腔注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过第一腹腔注射接种的动物进行第二腹腔注射接种，7天后获得经过免疫的动物。由此，能够有效对动物进行免疫，进而能够使经过免疫的动物高效地产生AQP4多克隆抗体。
[0018]根据本发明的再一方面，本发明还提出了一种AQP4多克隆抗体。根据本发明的实施例，该AQP4多克隆抗体是通过前面所述的方法制备获得的。根据本发明一些实施例，本发明的AQP4多克隆抗体对AQP4蛋白的亲合力高、特异性好，能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
[0019]根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种用于检测AQP4的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的AQP4多克隆抗体。该AQP4多克隆抗体特异性识别前面所述的分离的多肽，即具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。由此，利用该试剂盒能够有效地检测AQP4。
[0020]根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种用于治疗AQP4相关疾病的药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的AQP4多克隆抗体。该AQP4多克隆抗体特异性识别前面所述的分离的多肽，即具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。由此，该药物能够有效地用于治疗AQP4相关疾病。
[0021]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0023]图1显示了 AQP4蛋白的结构示意图；
[0024]图2显示了根据本发明一个实施例，发明人设计的四条多肽免疫后的效价测定结果;
[0025]图3显示了根据本发明一个实施例，实施例1获得的4种免疫血清与AQP4的结合活性的ELISA检测结果；
[0026]图4显示了根据本发明一个实施例，实施例1获得的P印1-KLH免疫血清与AQP4的结合活性的Western Blot检测结果；
[0027]图5显示了根据本发明一个实施例，实施例1获得的P印1-KLH免疫血清与AQP4相互作用的特异性的ELISA检测结果。
【具体实施方式】
[0028]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029]分离的多肽及其用途
[0030]由此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该分离的多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。具体地，本发明的分离的多肽即AQP4蛋白的优势抗原表位，具有如下所示的氨基酸序列:GNWENHWGGGTEKPLPVC(SEQ ID NO:1)。其中，根据本发明的一些实施例，所述分离的多肽是由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。具体地，编码该多肽的核苷酸序列如下:ggaaattgggaaaaccattgggggggtggaacagaaaagcctttaccggtctgc(SEQ ID NO:2)。
[0031]发明人惊奇地发现，本发明的多肽是AQP4蛋白的优势表位，利用该多肽能够有效地制备AQP4特异性的多克隆抗体，并且制备获得的AQP4多克隆抗体能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。此外，根据本发明实施例的多肽，能够作为治疗AQP4相关疾病的药物的药物靶点，并且该多肽也能够直接用于制备治疗AQP4相关疾病的药物。
[0032]根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的多肽在制备AQP4多克隆抗体中的用途。根据本发明的实施例，利用该多肽能够有效地制备AQP4特异性的多克隆抗体，并且制备获得的AQP4多克隆抗体能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗`体药物。
[0033]AQP4多克隆抗体及其制备方法
[0034]因而，根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种制备AQP4多克隆抗体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:
[0035]首先，利用前面所述的分离的多肽免疫动物，以便获得经过免疫的动物。
[0036]其中，根据本发明的一个实施例，所述多肽是通过化学合成法制备获得的。由此，获得的多肽纯度高，有利于抗体的制备。此外，本领域技术人员可以理解，也可以通过其他方法获得该多肽，例如可以直接从动物中分离，也可以由他人直接提供，只要能够有效获得具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽即可。
[0037]根据本发明的实施例，进行免疫的动物的种类不受特别限制，只要能够有效获得免疫血清，且获得的免疫血清在实际应用容易即可。根据本发明的一个实施例，所述动物为兔，优选国产大耳白兔。由此，制备抗体的效率高，获得的抗体特异性好。
[0038]根据本发明的一个实施例，利用前面所述的分离的多肽免疫动物，进一步包括:将所述多肽与KLH蛋白偶联制成融合蛋白；将所述融合蛋白分别经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化，以便分别获得经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白和经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白；利用所述经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白，经皮下注射接种于所述动物，以便获得经过皮下注射接种的动物；皮下注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过皮下注射接种的动物进行第一腹腔注射接种，以便获得经过第一腹腔注射接种的动物；以及第一腹腔注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过第一腹腔注射接种的动物进行第二腹腔注射接种，7天后获得经过免疫的动物。由此，能够有效对动物进行免疫，进而能够使经过免疫的动物高效地产生AQP4多克隆抗体。
[0039]然后，收集所述经过免疫的动物的血清并纯化，以便获得所述AQP4多克隆抗体。其中，根据本发明的一个实施例，可以通过心脏取血进而收集获得所述血清。由此，有利于免疫血清的获得。
[0040]发明人发现，利用该方法能够高效地制备AQP4多克隆抗体，并且获得的AQP4多克隆抗体对AQP4蛋白的亲合力高、特异性好，能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
[0041]根据本发明的再一方面，本发明还提出了一种AQP4多克隆抗体。根据本发明的实施例，该AQP4多克隆抗体是通过前面所述的方法制备获得的。根据本发明一些实施例，本发明的AQP4多克隆抗体对AQP4蛋白的亲合力高、特异性好，能够有效用于检测AQP4，进而能够有效用于制备检测AQP4的试剂盒或治疗AQP4相关疾病的抗体药物。
[0042]试剂盒及药物
[0043]由此，根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种用于检测AQP4的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的AQP4多克隆抗体，所述AQP4多克隆抗体特异性识别前面所述的分离的多肽，即具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。由此，利用该试剂盒能够有效地检测AQP4。
`[0044]根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种用于治疗AQP4相关疾病的药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的AQP4多克隆抗体，所述AQP4多克隆抗体特异性识别前面所述的分离的多肽，即具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。由此，该药物能够有效地用于治疗AQP4相关疾病。
[0045]下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0046]实施例1抗原肽序列的确定、制备及偶联KLH蛋白
[0047]发明人利用生物信息学的方法,通过Pbdviewer得到AQP4蛋白的三维结构图(AQP4蛋白的结构示意图如图1所示)，并寻找在其高级结构表面的多肽段，然后设计了 4条表位(即多肽)，即pepl、pep2、pep3和pep4,其中pep I为Loop A和Loop E组合的多肽，其序列见序列表中SEQ ID NO:1，其核苷酸(即编码该多肽的核苷酸)序列见序列表中SEQ IDNO:2 ；pep2的序列为人AQP4蛋白的第137_157aa，其序列见序列表中SEQ ID NO:3，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:4 ；pep3的序列为AQP4蛋白的第43_64aa，其序列见序列表中SEQ ID NO:5，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:6 ；pep4的序列为AQP4蛋白的第209-230aa，其序列见序列表中SEQ ID NO:7，编码的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:8。
[0048]将上述设计的4条表位多肽交由吉尔生化(上海)有限公司合成，并将其偶联在KLH蛋白上，得到多肽-蛋白偶联物pepl-KLH、p^2-KLH、p^3-KLHjP p印4-KLH。[0049]实施例2多克隆抗体的制备及检测
[0050]根据本发明的制备AQP4多克隆抗体的方法，以实施例1中获得的多肽-蛋白偶联物(pepl-KLH、P印2-KLH、p印3-KLH、和p印4-KLH)为免疫原免疫动物，制备AQP4多克隆抗体，具体如下:
[0051]1、材料
[0052]12周龄国产大耳白兔购自军事医学科学院动物实验中心，KLH (血蓝蛋白)购自上海安研商贸有限公司，弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂购自sigma, ELISA板购自corning,HRP标记的羊抗兔的二抗购自中杉金桥股份有限公司，脱脂奶粉购自Difco，OPD购自sigma, 30%H202购自北京试剂公司。
[0053]按照通用方法配制ELISA实验中的常规试剂。
[0054]2、方法
[0055]将实施例1中获得的多肽-蛋白偶联物:p印1-KLH、P印2-KLH、p印3-KLH、和pep4-KLH分别免疫12周龄的大耳白兔，具体方法为:首次免疫以弗氏完全佐剂乳化四个抗原表位融合蛋白pepl-KLH、pep2-KLH、pep3_KLH、和pep4_KLH,经皮下注射接种偶联融合蛋白Img;首次免疫2周后以弗氏不完全佐剂乳化P印1-KLH、p印2-KLH、p印3-KLH、和P印4-KLH经腹腔注射加强免疫I次；2周后同样方法再加强免疫I次，7天后经心脏取血进而收集血清并纯化，以便获得抗血清成品即AQP4多克隆抗体。
[0056]免疫动物完成后，利用ELISA方法将4种抗原表位融合蛋白免疫的兔的免疫血清进行效价测定，具体实验步骤如下:
[0057]a)对免疫后的兔子进行耳缘静脉采血`，37°C凝集后离心收集血清，以便获得免疫血清。
[0058]b)将实施例1中所得的4条未与KLH蛋白偶联的抗原表位多肽P印l、pep2、p印3、P印4分别以0.5 μ g/mL浓度包被至ELISA反应板中，每孔包被100μ 1，4°C过夜。
[0059]c)洗涤液清洗酶标板3次，用5%脱脂奶粉，37°C反应1.5h。
[0060]d)将上述获得的免疫血清按以下稀释度稀释:1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400,然后，利用洗涤液清洗酶标板 3 次后，将稀释的血清分别加入对应的包被抗原表位多肽的ELISA板中，每孔100 μ 1，37°C反应1.5h。
[0061]e)利用洗涤液清洗酶标板6次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，所述二抗按1:4000的比例稀释，分别加入孔中，每孔100μ 1，37°C孵育lh，再用洗涤液清洗6次。
[0062]f)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100 μ 1，显色30min后，加入终止液100 μ 1，终止显色。
[0063]g)用酶标仪检测OD450的值。
[0064]结果见图2。如图2所示，P印I为:p印1-KLH免疫的兔血清，P印2为:p印2-KLH免疫的兔血清，P印3为:p印3-KLH免疫的兔血清，P印4为:p印4-KLH免疫的兔血清。由图2可知，四条多肽制备的兔源多克隆抗体均可以与其抗原肽结合，且效价较高，但是制备的多克隆抗体是否可以和AQP4蛋白相互作用仍需进一步验证。
[0065]实施例3ELISA法检测免疫获得的多克隆抗体与AQP4蛋白的结合活性
[0066]利用ELISA方法将实施例2中获得的4种抗原表位融合蛋白(p印1-KLH、P印2-KLH、P印3-KLH、和p印4-KLH)的兔的免疫血清即多克隆抗体进行AQP4蛋白结合活性检测，具体如下:
[0067]1、材料
[0068]AQP4蛋白购自上海微蒙生物科技有限公司，其余试剂参考实施例2。
[0069]2、方法
[0070]a)将上述AQP4蛋白以1μ g/ml浓度包被至ELISA反应板中，每孔包被100μ 1，4°C过夜。
[0071]b)洗涤液清洗酶标板3次，用5%脱脂奶粉，37°C反应1.5h。
[0072]c)免疫血清按以下稀释度稀释:1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400,洗涤液清洗酶标板3次后，将稀释的血清加入包被抗原肽的ELISA板中，每孔100μ 1，37°C反应1.5h。
[0073]d)洗涤液清洗酶标板6次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，所述二抗按1:4000的比例稀释，分别加入孔中，每孔100μ 1，37°C孵育lh，再用洗涤液清洗6次。
[0074]e)加辣根过氧化 物酶底物缓冲液100 μ 1，显色30min后，加入终止液100 μ 1，终止显色。
[0075]f)用酶标仪检测OD450的值。
[0076]结果见图3。如图3所示，P印I为:p印1-KLH免疫的兔血清，P印2为:p印2-KLH免疫的兔血清，P印3为:p印3-KLH免疫的兔血清，P印4为:p印4-KLH免疫的兔血清。由图3可知，利用本发明设计的四条表位多肽制备的多克隆抗体中，只有表位肽Pepl制备的多抗能与AQP4蛋白有较高的结合活性，其余三条多肽制备的多克隆抗体均不与AQP4蛋白结合，所以表位肽pep I是AQP4蛋白的优势抗原。
[0077]实施例4WeStern Blot法检测p印1-KLH多克隆抗体与AQP4蛋白的结合活性
[0078]利用Western Blot方法将实施例2中获得的pep I抗原表位融合蛋白(pepl-KLH)兔的免疫血清即多克隆抗体进行AQP4蛋白结合活性检测，具体如下:
[0079]1、材料
[0080]PVDF膜购自biorad公司，HRP标记的羊抗兔的二抗购自中杉金桥公司，ECL发光液购自piece公司。
[0081]试剂配制:
[0082]Western Blot转膜缓冲液:2.9g Gly，5.8g Tris,0.37g SDS，溶解并定容至800ml水中，搅拌溶解后加入200ml乙醇，混匀后即可使用。
[0083]膜封闭液:5g脱脂奶粉，溶于100ml0.05%PBST中。
[0084]2、方法
[0085]a)电泳:分别取AQP4蛋白5 μ g、l μ g、0.1 μ g,以5 μ g GST蛋白作为阴性对照，15%SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，采用预染蛋白标准。
[0086]b)转膜:恒压 60V，120min，湿转至 PVDF 膜。
[0087]c)封闭:用封闭液将膜浸没,37°C摇晃封闭lh。
[0088]d) 一抗:表位肽P印1-KLH融合蛋白免疫的兔血清用稀释液按1:4000稀释，室温孵育 40min, 0.05%PBST 洗涤 3 次，IOmin/ 次。
[0089]e) 二抗:用稀释液按1:4000将HRP标记羊抗兔IgG稀释，37 °C孵育40min，0.5%PBST 洗涤 3 次，IOmin/ 次。
[0090]f)加入ECL发光液，压片显影。
[0091]Western Blot检测结果见图4。由图4可知,表位pepl制备的兔源多克隆抗体可以与AQP4蛋白特异性结合，并且具有良好的剂量依赖性，该实验结果与实施例3结果一致，进一步证明了表位肽pepl是AQP4蛋白的优势抗原。
[0092]实施例5表位肽pepl制备的多克隆抗体的特异性检测
[0093]实施例3和4的结论证明了表位肽pepl制备的多克隆抗体能与表位肽pepl和AQP4蛋白结合，且与AQP4蛋白结合具有良好的剂量依赖性，但此相互作用的特异性仍需检测，因而，发明人又利用ELISA的方法以多个其他蛋白为对照检测了此相互作用的特异性，具体如下:[0094]1、材料
[0095]BSA (牛血清白蛋白)，TRX (硫氧还蛋白)、GST (谷胱甘肽转移酶)、OVA (鸡卵白蛋白)均购自上海安研商贸有限公司，其余试剂见实施例2。
[0096]2、方法
[0097]a)将AQP4蛋白和无关蛋白BSA，TRX、GST、OVA以I μ g/ml浓度包被至ELISA反应板中，每孔包被100 μ 1,4°C过夜。
[0098]b)洗涤液清洗酶标板3次，用5%脱脂奶粉，37°C反应1.5h。
[0099]c)表位肽P印1-KLH融合蛋白的免疫血清按以下稀释度稀释:1:200，1:400，1:800,1:1600,1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200, I: 102400，洗涤液清洗酶标板 3次后，将稀释的血清加入包被AQP4蛋白和无关蛋白的ELISA板中，每孔100 μ I，37 °C反应
1.5h。
[0100]d)洗涤液清洗酶标板6次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，所述二抗按1:4000的比例稀释，分别加入孔中，每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育lh，再用洗涤液清洗6次。
[0101]e)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100 μ 1，显色30min后，加入终止液100 μ 1，终止显色。
[0102]f)用酶标仪检测OD450的值。
[0103]结果见图5。如图5所示，AQP4:水通道蛋白4，BSA:牛血清白蛋白，GST:谷胱甘肽转移酶，TRX:硫氧还蛋白，0VA:鸡卵白蛋白。由图5可知，包被的5种蛋白(AQP4蛋白、BSA, TRX、GST、0VA)中只有AQP4蛋白可以与p印1-KLH融合蛋白免疫的兔源抗血清相互作用，且此相互作用有剂量依赖关系，而此兔源抗血清与其他无关蛋白则无此相互作用，因此，pepl-KLH融合蛋白免疫得到的兔源多克隆抗体与AQP4蛋白有特异性相互作用。
[0104]通过上述多个实施例的结果，证明了本发明设计的表位肽P印I是AQP4蛋白的优势表位，通过该表位制备的多克隆抗体能特异性的与AQP4蛋白结合。
[0105]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0106]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况 下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1.一种分离的多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述分离的多肽是由SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列编码的。
3.权利要求1所述的多肽在制备AQP4多克隆抗体中的用途。
4.一种制备AQP4多克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤: 利用权利要求1所述的分离的多肽免疫动物，以便获得经过免疫的动物；以及 收集所述经过免疫的动物的血清并纯化，以便获得所述AQP4多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多肽是通过化学合成法制备获得的。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述动物为兔，优选国产大耳白兔， 任选地，通过心脏取血进而收集获得所述血清。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的分离的多肽免疫动物，进一步包括: 将所述多肽与KLH蛋白偶联制成融合蛋白； 将所述融合蛋白分别经弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化，以便分别获得经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白和经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白； 利用所述经弗氏完全佐剂乳化的融合蛋白，经皮下注射接种于所述动物，以便获得经过皮下注射接种的动物； 皮下注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过皮下注射接种的动物进行第一腹腔注射接种，以便获得经过第一腹腔注射接种的动物；以及第一腹腔注射接种2周后，利用所述经弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白，对所述经过第一腹腔注射接种的动物进行第二腹腔注射接种，7天后获得经过免疫的动物。
8.—种AQP4多克隆抗体，其是通过权利要求4-7任一项所述的方法制备获得的。
9.一种用于检测AQP4的试剂盒，其特征在于，包含权利要求8所述的AQP4多克隆抗体。
10.一种用于治疗AQP4相关疾病的药物，其特征在于，包含权利要求8所述的AQP4多克隆抗体。
【文档编号】A61P27/06GK103554227SQ201310544840
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】魏世辉, 陈霆隽 申请人:中国人民解放军总医院