糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。糖类可以是单糖类、所述单糖类的氧化还原衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类中的一种或多种。血小板数量相关的疾病包括原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症。本发明实验发现抗血小板GPIbαN端抗体可诱导血小板活化、凋亡，可导致血小板在肝脏被巨噬细胞迅速清除，而糖类能显著抑制抗血小板GPIbα抗体导致的血小板清除，调控血小板数量。本发明首次提出糖类在制备治疗血小板数量相关疾病药物中的应用，拓展了糖类的新用途。
【专利说明】糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体涉及糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]临床上各种因素导致的血小板数量异常会引起相关疾病，如原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少，包括免疫性血小板减少症等。血小板增多症是一种原因不明的异常增生伴血小板持续增多为主的骨髓增生性疾病，其临床特点为多见于40岁以上的成年人、常伴有自发性皮肤黏膜出血，反复发作、可以有血栓形成、脾肿大、血小板持久性明显增多，病因不明。该病的出血机理可能与血小板功能障碍或纤维蛋白溶解增强有关。按照欧美5国对原发性血小板增多症的流行病学调查，发病率为
0.59/10 万~2.53/10 万，近 20 年来，发病率增加了 3.2 倍(Johansson P.Epidemiologyof the myeloproliferative disorders polycytothemia vera and essentialthrombocythemia.Sem Thromb Haemost，2006，32:171-173)。
[0003]在血小板减少症中免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenia, ITP)是临床常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30% (侯明，戴克胜，彭军，主编，《血小板疾病》，第二版，科技文献出版社，2012年，142页)。研究表明ITP是一种自身免疫性疾病，该病的发生是由于体内产生抗巨核细胞或血小板的自身抗体，其中抗血小板的抗体主要由抗血小板膜糖蛋白glycoprotein (GP) Ib-1X-V和GPIIb/IIIa的两大类抗体组成(MichelleLee Webster, Ebrahim Sayeh,Min Crow,Pingguo Chen,Bernhard Nieswandt, JohnFreedman, and Heyu N1.Relative efficacy of intravenous immunoglobulin G inameliorating thrombocytopenia induced by antiplatelet GPIIbIIIa versusGPIb a antibodies.Blood, 2006108:943-946)。两大类抗体与病人体内血小板结合后，主要通过抗体的Fe端与人体内的网状内皮系统(reticuloendothelial system, RES)结合,导致血小板被脾脏等器官清除。
[0004]虽然，近年来，ITP的发病机制研究取得了一系列的进展，在体液免疫机制方面提出了自身抗体介导的巨核细胞数量和质量异常。在细胞免疫机制方面提出了细胞毒T细胞直接溶解血小板的理论，但是，关于ITP的确切发病机理尚未明确。
[0005]由于发病机理尚未弄明确，因此，尚无根治的方法。美国ITP指南建议血小板低于20~30 X 109/L或低于50 X 109/L合并明显皮肤黏膜出血以及有出血危险因素者接受治疗。目前主要的治疗策略是抑制抗体的产生和血小板的破坏，促进血小板的产生，包括各种免疫抑制剂、切除脾脏，促血小板生成等。治疗的目的是使患者血小板计数提高到安全水平，降低病死率。
[0006]当前的治疗药物主要为造血因子血小板生成素、白介素-11和免疫干预的糖皮质激素、单克隆抗体等。然而上述各种治疗药物各自具有各自的局限性，如ITP常用治疗药物重组人血小板生成素(rhTPO)存在血栓、骨髓纤维化、静脉堵塞等潜在副作用；静脉内注射免疫球蛋白(IVIG)适用于难治性或需紧急治疗ITP患者，副作用轻，使用无限制，但由于其作用时间短，价格昂贵，限制了临床应用(Beardsley DS, ErtemM.Platelet autoantibodies in immune thrombocytopenic purpura.TransfusSc1.1998; 19:237-244)。因此找到一种有效治疗血小板数量相关疾病的药物是临床医学凾待解决的问题。
[0007]糖类又称为碳水化合物，其结构指多羟基醛、酮、醇及其衍生物以及由糖苷键连接的此类化合物的多聚体。糖类化合物包括有单糖及其氧化还原衍生物、寡糖、多糖和复合多糖及糖苷类。目前人类使用的糖类药物已不下500多个，包括有多种抗生素、核苷、多糖、糖月旨、糖蛋白等。糖类广泛存在于自然界中，价格低廉，来源广泛。但是糖类药物在治疗血小板数量相关疾病中的应用尚未见过报道。
【发明内容】
[0008]本发明目的是提供一种能有效治疗血小板数量相关疾病的药物。 [0009]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
[0010]糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。
[0011]上述应用中的所述糖类可以是单糖类、所述单糖类的氧化还原衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类中的一种或多种。
[0012]上述应用中的所述单糖类为以N-乙酸-D-葡糖胺、P-N-乙酸-D-葡糖胺、甲基-P -D-葡糖苷、D-葡萄糖为代表的所有单糖类。
[0013]上述应用中所述的血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症，但并不限于上述疾病，凡是由血小板数量引起的疾病都包含在内。上述应用中所述的血小板减少症以免疫性血小板减少症为代表,但不限于免疫性血小板减少症。
[0014]上述应用中所述的药品可以是糖类。
[0015]上述应用中所述的药品可以是包含糖类的组合物。
[0016]上述应用中所述的药品按照通常的方式可以制备成各种剂型。
[0017]上述应用中所述的药品可以口服或者注射或者局部应用。
[0018]本发明发现抗血小板GPIb a N端抗体可诱导血小板活化、凋亡，可导致血小板在肝脏被巨噬细胞迅速清除，而糖类能显著抑制血小板GPIb a抗体导致的血小板清除，调控血小板数量。
[0019]本发明还发现抗血小板GPIb a N端抗体可诱导血小板聚集,抗血小板GPIb a N端抗体诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIb a聚集，不依赖于Fe段。
[0020]本发明的优点在于:
[0021](I)基于新的发病机制，具有疗效好、特异性强的特点。
[0022](2)本发明发掘了糖类在用于制备治疗血小板数量相关疾病药物的新领域。
[0023]( 3 )糖类来源广泛、成本低廉，临床应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1显示了抗血小板GPIb a抗体AN51可诱导血小板聚集。图1A.分别向PRP中加入2 u g/ml的IgG和AN51，用血小板聚集仪记录血小板聚集的变化。Risto代表瑞斯托霉素诱导的血小板聚集；图1B.多种单克隆抗体对血小板聚集的影响，纵坐标表示15min中内血小板的最大聚集率，其中仅有AN51可显著的诱导血小板聚集；图1C.分别向PRP中加A 2 u g/ml的IgG和AN51在聚集仪中搅动15min后，物镜放大40倍后呈像结果。
[0025]图2显示了 AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIb a聚集，不依赖于Fe段。图2A.PRP分别与10 u g/ml的小鼠IgG.1V.3在常温下温育lOmin，加入2 u g/mlAN51,血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图2B.图2A15min内最大聚集率的统计结果；图2C.分别向PRP中加入PBS和2 ii g/ml的AN51F(ab’)2片段，血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图2D.图2C15min内最大聚集率的统计结果；图2E.分别向PRP中加入2 u g/ml的AN51单体Fab片段、二聚体(AN51)和四聚体(AN51加羊抗小鼠F (ab ’)2，AN51 + GAM)，血小板聚集仪记录血小板聚集变化；图2F.图2E15min内最大聚集率的统计结果。
[0026]图3显示了 AN51诱导血小板凋亡。图3A.2 ii g/ml的IgG、AN51与洗涤血小板温育1-6个小时后凋亡血小板的比例；图3B.2 ii g/ml IgG, HIPl和AN51与洗涤血小板温育6小时血小板凋亡蛋白表达的变化。
[0027]图4显示了 AN51可导致豚鼠体内血小板数迅速下降。通过豚鼠前臂静脉分别向不同的豚鼠注射正常小鼠IgG、0.05mg/kg、0.lmg/kg和0.2mg/kgAN51,在指定时间点眼眶采血，计数血小板。图中每点代表该时间点血小板计数除以注射糖前血小板计数的倍数。
[0028]图5显示了 GlcNac可抑制AN51诱导的豚鼠血小板清除。通过豚鼠前臂静脉分别向豚鼠注射PBS、5mM和IOmMGlcNac后，通过另一侧前臂静脉注射0.2 u g/kg AN51，在指定时间点眼眶采血，计数血小板。图中每点代表指定时间血小板计数除以注射糖前血小板计数的倍数。
[0029]图6显示了 P -GlcNac可抑制AN51诱导的豚鼠血小板清除。通过豚鼠前臂静脉分别向豚鼠注射PBS、5 ii M的P-GlcNac后，通过另一侧前臂静脉注射0.g/kgAN51，在注射抗体前和注射抗体后5min眼眶采血，计数血小板。纵坐标代表剩余血小板数占注射抗体血小板数的百分比。
[0030]图7显示了 P -Glc可抑制AN51诱导的豚鼠血小板清除。通过豚鼠前臂静脉分别向豚鼠注射PBS、25mM的P -Glc后，通过另一侧前臂静脉注射0.2 u g/kgAN51，在注射抗体前和注射抗体后5min眼眶采血，计数血小板。纵坐标代表剩余血小板数占注射抗体血小板数的百分比。
【具体实施方式】
[0031]本发明中所述糖类可以根据已知常规方法制备(方志杰，编著，《糖类药物合成与制备》，第一版，化学工业出版社，2010年)或1991年发明专利公开的糖类制备方法制备(专利号:91108011，发明名称:糖类的制备方法)。另外，所述糖类也可以通过商业途径购得。
[0032]本发明的药物可以仅是糖类，也可以是含有糖类的组合物。
[0033]通常，可将药物制成各种剂型，所述药物可以是口服或者注射或者局部应用。
[0034]本发明中血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症，但并不限于上述疾病， 凡是由血小板数量引起的疾病都包含在内。
[0035]发明人发现，抗血小板膜糖蛋白GPIb-1X-V的抗体与人的血小板结合后会导致血小板GPIb a胞外端聚集在一起，同时使得GPIb a N-末端上连接的P -N-乙酰-D-葡糖胺聚集在一起。聚集后的P-N-乙酰-D-葡糖胺对肝脏巨噬细胞表面aM02integrin受体的亲和力大大增加，使得血小板被肝脏巨噬细胞吞噬清除。基于上述发现，本发明人完成了本发明。
[0036]本发明发现糖类能抑制血小板破坏，调控血小板数量。实验证实糖类调控血小板数量的机制之一为抑制抗体AN51导致的血小板清除。在一个优选的实施方案中，所述血小板数量相关疾病选自ITP。当然，血小板数量相关疾病不只包括ITP，还包括原发性或继发性血小板增多症、非免疫性血小板减少症等。
[0037]下面以实验例来具体说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0038]实验材料
[0039]小鼠抗人血小板GPIb a N端抗体AN51、抗人GPIX抗体SZl和抗人GPIIIa抗体SZ21由小鼠腹水通过protein G亲和层析法纯化得到。小鼠抗人GPIba抗体丽23由杜小平惠赠。其他抗人GPIb a抗体AK2、HIPl和VM16d分别购自Abeam、eBioscience和 Thermo Scientifc 公司。N-乙酸-D-葡糖胺(N-acetyle-D-glucosamine, GlcNac)、3 -N-乙酸-D-葡糖胺(3 -N-acetyle-D-glucosamine, 3 -GlcNac)、甲基-D-葡糖苷(methyl-^ -D-glucopyranoside, 3_Glc), D_ 葡萄糖(D-glucose，Glc)，瑞斯托霉素，从Sigma-Aldrich公司购买。小鼠IgG片段化试剂盒购自ThermoScientific公司。ProteinG琼脂糖凝胶购自GE healthcare o正常小鼠IgG从Santa Cruz公司购买。抗人FcyRIIA单克隆抗体IV.3购自S temCell公司。JC-1、抗Bak, Bad, Bcl_2, Bcl-xl的抗体购自碧云天生物技术研究所。
[0040]血小板的分离与洗涤
[0041]取正常人新鲜静脉血用A⑶以1:7抗凝。300g分离出富含血小板血浆(PRP)，PRP通过1500g离心得到血小板，CGS缓冲液洗涤2次后，重悬在改良的Tyrode’ s缓冲液中至3X108/ml，在常温下静置1-2h。用于血小板聚集实验的血液用3.8%柠檬酸钠1:9抗凝，300g分离出PRP。
[0042]血小板聚集
[0043]取柠檬酸钠抗凝的PRP分别加入正常小鼠IgG、抗血小板GPIb a多种单克隆抗体、瑞斯托霉素或AN51F (ab’)2,用血小板聚集仪(Chrono-1og)检测血小板聚集。在研究抗Fe y RIIA的单克隆抗体IV.3对AN51诱导的血小板聚集实验中，10 u g/mlIV.3先与PRP在常温下温育5分钟，再加入AN51检测聚集。
[0044]流式细胞术检测血小板凋亡
[0045]洗涤血小板与2 U g/mlAN51分别温育1_6小时后，JC-1标记血小板线粒体膜电位，流式细胞术检测血小板线粒体膜电位变化，将红色荧光转化为绿色荧光的血小板定义为凋亡血小板，并记凋亡血小板群体的百分比。
[0046]SDS-PAGE 和 Western Blot
[0047]洗涤血小板与正常小鼠IgG、对照抗体HIPl及AN51分别在37°C下温育6小时后经细胞裂解液在冰上裂解30min后加入6X SDS上样缓冲液。蛋白由SDS-PAGE分离后转印于硝酸纤维素膜后进行Western Blot。一抗分别为抗Bak, Bad, Bcl-2, Bcl-xl的抗体,二抗为HRP标记的羊抗兔抗体，ECL发光法显色。[0048]动物实验
[0049]通过豚鼠前臂静脉注射0.05mg/kg、0.lmg/kg 和 0.2mg/kgAN51 或 0.2mg/kg 正常小鼠IgG，在指定时间点通过眼眶采血，用3.8%柠檬酸钠抗凝。抗凝血用血小板分析仪计数血小板。在研究糖对血小板清除影响的实验中，先通过豚鼠前臂静脉注射不同浓度的N-乙酰-D-葡糖胺、e -N-乙酰-D-葡糖胺、甲基-P -D-葡糖苷或D-葡萄糖，5分钟后，再通过另一侧前臂静脉注射0.2mg/kgAN51,同上采血并计数血小板。
[0050]实验结果
[0051]1、抗血小板GPIb a N端抗体AN51可导致血小板聚集
[0052]单克隆抗体AN51的表位位于人血小板GPIb a N端1 一 35氨基酸残基处，如附图1A和B所示，用AN51与PRP温育可诱导血小板发生聚集(聚集率为10% — 20%)。抗血小板 GPIb a 其他表位的抗体如 AK2 (35 — 59)、HIPl (59 — 81)、VM16d (201 — 168)、WM23(macroglycopeptide)或抗其他蛋白的抗体如SZl (GPIX)、SZ21 (GPIIIa)不能显著地诱导血小板聚集发生(附图1B)。显微成像结果表明AN51诱导血小板形成小聚集物(附图1C)。
[0053]2、AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIb a聚集，不依赖于Fe段
[0054]抗血小板抗体的Fe段可通过与Fe y RIIA受体结合诱导血小板发生活化和聚集。为了研究AN51是否通过与Fe y RIIA结合诱导血小板聚集，检测了拮抗Fe y RIIA的抗体IV.3对AN51诱导的血小板聚集的影响。附图2A表明IV.3不抑制AN51诱导的聚集。另外，不包含Fe段的AN51F(ab’)2片段也可诱导血小板聚集(附图2B)，进一步说明AN51导致血小板聚集不依赖于Fe段。
[0055]血小板GPIba多聚化可诱导血小板聚集，为了探讨AN51是否通过诱导GPIb a聚集从而活化血小板，检测了 AN51单体Fab片段、AN51IgG (二聚体)及羊抗小鼠(GAM) 二抗耦连的AN51 (四聚体)对血小板聚集的影响。如附图2C所示，单体(Fab)不能诱导血小板聚集；与二聚体(AN51)相比，四聚体(AN51+GAM)可诱导更大的聚集发生(10% vs20% )。
[0056]因此，AN51诱导的血小板聚集依赖于抗体诱导的GPIb a聚集，不依赖于Fe段。
[0057]3、AN51可诱导血小板凋亡
[0058]线粒体膜电位去极化可作为血小板凋亡的指标之一。洗涤血小板与分别与2 μ g/ml的小鼠IgG、AN51在37°C下温育1_6小时，通过检测线粒体膜电位去极化检测细胞凋亡。图3A显示温育4小时后，AN51引起的凋亡细胞的比例与IgG相比具有统计学差异，并呈时间依赖趋势。另外检测了小鼠IgG、对照抗体HIPl及AN51对血小板凋亡蛋白表达的影响。
2μg/ml抗体与洗漆血小板温育6小时后裂解血小板，Western Blot结果(附图3B)表明，与IgG和对照抗体HIPl相比，AN51可导致促凋亡蛋白Bad和Bak的表达上调，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达下调。因此，AN51可诱导线粒体途径依赖的血小板凋亡。
[0059]4、AN51可导致豚鼠体内血小板迅速被清除
[0060]抗GPIba的抗体具有清除小鼠体内血小板的作用。AN51可特异性的与豚鼠GPIba结合并导致GPIb a发生聚集。为探讨AN51是否可清除豚鼠体内血小板，通过向豚鼠前臂静脉注射0.05mg/kg、0.lmg/kg和0.2mg/kg的AN51,在注射抗体前、注射抗体后5min、20min、lhr、3hr分别眼眶取血计数血小板。附图4表明,AN51在5分钟后即可清除血小板，并呈剂量依赖趋势。豚鼠血小板在注射抗体3小时后逐渐恢复到正常水平。AN51的F(ab’)2片段也可导致豚鼠血小板迅速减少。注射正常小鼠IgG对豚鼠血小板计数没有影响。
[0061]5、N-乙酰-D-葡糖胺显著抑制抗体AN51导致的血小板清除
[0062]在注射AN51前，通过豚鼠前臂静脉分别注射5mM和IOmM的GlcNac后，再向另一侧前臂静脉注射0.2mg/kg的AN51，分别在指定时间点眼眶采血后计数血小板。附图5显示IOmM的GlcNac可显著抑制AN51诱导的血小板清除。
[0063]6、P -N-乙酰-D-葡糖胺显著抑制抗体AN51导致的血小板清除
[0064]在注射AN51前通过豚鼠前臂静脉分别注射IOii M的P-GlcNac后，再向另一侧前臂静脉注射0.2mg/kg的AN51，分别在指定时间点眼眶采血后计数血小板。附图6显示注射抗体5分钟后10 ii M的 P -GlcNac可显著抑制AN51诱导的血小板清除。
[0065]7、甲基-P-D-葡糖苷显著抑制抗体AN51导致的血小板清除
[0066]通过豚鼠前臂静脉分别注射25mM的P -Glc后，再向另一侧前臂静脉注射0.2mg/kg的AN51，分别在指定时间点眼眶采血后计数血小板。附图7显示注射抗体5分钟后25mM的3 -Glc可显著抑制AN51诱导的血小板清除。
[0067]8、D-葡萄糖显著抑制抗体AN51导致的血小板清除
[0068]在注射AN51前通过豚鼠前臂静脉分别注射IOOmM的Glc后，再向另一侧前臂静脉注射0.2mg/kg的AN51,分别在指定时间点眼眶采血后计数血小板。注射抗体5分钟后IOOmM的Glc可显著抑制AN51诱导的血小板清除。
【权利要求】
1.糖类在制备治疗血小板数量相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的糖类可以是单糖类、所述单糖类的氧化还原衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述单糖类为以N-乙酰-D-葡糖胺、3 -N-乙酸-D-匍糖胺、甲基_ P -D-匍糖苷、D-匍萄糖为代表的所有单糖类。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的血小板数量相关疾病包括原发性或继发性血小板增多症、原发性或继发性血小板减少症。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述的血小板数量相关疾病为以免疫性血小板减少症为代表的所有血小板减少症。
6.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于:所述的药物可以是糖类。
7.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于:所述的药物可以是包含糖类的组合物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的药物可以是各种剂型。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的药物可以是口服或者注射或者局部应用。`
【文档编号】A61P7/00GK103610684SQ201310547607
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】戴克胜 申请人:苏州大学