一种脱细胞肌腱材料的制备方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种脱细胞肌腱材料的制备方法，包括如下步骤：（1)取新鲜肌腱，清洗；（2)将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60?90%；(3)对步骤（2)压缩后的肌腱进行反复冻融；（4)将步骤（3)处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可。本发明还公开了前述方法制备的脱细胞肌腱材料及其用途。本发明方法制备的脱细胞肌腱材料脱细胞彻底，免疫原性低，生物力学性能、生物相容性好，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。
【专利说明】一种脱细胞肌腱材料的制备方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脱细胞肌腱材料的制备方法及其用途，属于生物材料领域。
【背景技术】
[0002] 肌腱是一种血供少、细胞比重少的致密结缔组织，主要由高度沿轴向排列的胶原 纤维组成，因而在承受载荷时可提供最大的抗应变能力，是一种良好的肌腱/韧带损伤 或缺损的修复支架。但是异体或异种来源的肌腱组织，因其细胞上具有多种免疫原性物 质，如细胞核内的DNA会引起所有动物发生免疫排斥反应，细胞膜上的α -半乳糖基抗原 (a -gal)会引起灵长类动物发生免疫排斥反应，用于体内修复的效果不尽人意，同时存在 安全隐患。因此，在制备用于体内修复的肌腱时，通常采用各种脱细胞方法，去除肌腱组织 细胞中的核物质，若用于灵长类动物修复时，应同时去除肌腱组织细胞膜上的a -gal。
[0003] 肌腱脱细胞处理可以采用常用的去垢剂，如Triton X-100、SDS、Trypsin，其可以 有效去除免疫原性物质，降低肌腱的免疫原性，但同时也会破坏肌腱的超微结构，导致力学 性能显著下降，生物活性因子也显著减少，制得的肌腱具有去垢剂残留。
[0004] 采用超声、反复冻融、核酸酶和/或α -半乳糖苷酶进行脱细胞处理，不会破坏肌 腱的结构，但是难以有效去掉肌腱的免疫原性物质。如，江燕林等采用反复冻融与核酸酶 处理联用的方式制备脱细胞肌腱，具体是取小牛跟腱，采用液氮冷冻/37°C复温反复冻融 5次，再在含有150U/ml DNase和100 μ g/ml RNase的核酸酶溶液中处理24h，HE染色和 DAPI染色显示肌腱内膜上仍有部分细胞核残留，DNA残留量检测结果显示DNA残留量高达 (0· 05±0· 02) μ g/mg，免疫原性较高(江燕林等，"脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学 特性研究"，中国修复重建外科杂志，2013, 27(5) : 71-76)。另外，江燕林等还研究发现，在 反复冻融、核酸酶处理小牛跟腱的基础上，再用α-半乳糖苷酶处理24h，α-半乳糖基抗原 (a-gal)的含量显著下降，但DNA残留量并无明显变化，免疫原性仍然较高(江燕林等，"异 种脱细胞肌腱生物支架的生物力学特性研究"，医用生物力学，2012, 27 (10) : 370)。
[0005] 因此，如何在有效脱细胞、去异种抗原的同时，保留肌腱组织的结构形态、生物力 学特性和生物活性因子是目前研究脱细胞肌腱材料面临的难题。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备脱细胞肌腱材料的方法，以及该 方法制备的脱细胞肌腱材料及其用途。
[0007] 本发明脱细胞肌腱材料的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)取新鲜肌腱，清洗；
[0009] (2)将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60?90% ;
[0010] (3)对步骤（2)压缩后的肌腱进行反复冻融；
[0011] (4 )将步骤（3 )处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可。
[0012] 优选地，步骤（2)中，所述压缩率为70?80%。
[0013] 步骤（3)中，所述反复冻融是将步骤（2)压缩后的肌腱置于液氮中1?3min，25? 37°C放置3?lOmin，重复操作4?6次。优选地，所述反复冻融是将步骤（2)压缩后的肌 腱置于液氮中lmin,37°C放置5min,重复操作5次。
[0014] 步骤（4)中，核酸酶处理的方法为：取步骤（3)处理后的肌腱，置于DNase浓度为 120?180IU/ml、RNase浓度为80?120 μ g/ml的核酸酶溶液中，室温或37°C恒温处理6? 24h。优选地，所述核酸酶溶液中，DNase的浓度为150IU/ml，RNase的浓度为ΙΟΟμ g/ml ; 所述处理的温度为37°C，处理的时间为6h。
[0015] DNase :脱氧核糖核酸酶；RNase :核糖核酸酶。
[0016] 因 a -gal ( α -半乳糖基抗原)会引起灵长类动物的免疫排斥反应，在制备用于修 复灵长类动物的脱细胞肌腱时，需要在前述处理方法基础上，进一步采用α -半乳糖苷酶 去除α-gal，即将前述步骤（4)处理后的肌腱，置于α-半乳糖苷酶浓度为3?8U/ml的溶 液中，15?40°C处理6?24h。优选地，所述溶液中，α -半乳糖苷酶的浓度为5U/ml ;所述 处理的温度为26°C，所述处理的时间为6h。
[0017] 本发明还提供了前述任意一项方法制备的脱细胞肌腱材料，以及该材料在制备治 疗软组织缺损修复材料中的用途，优选地，所述软组织缺损修复材料是肌腱组织或韧带组 织缺损修复材料。
[0018] 本发明巧妙地先对肌腱进行适当压缩，再采用反复冻融、核酸酶处理以及a -gal 处理的方式进一步处理肌腱，有效地解决了现有方法难以有效降低肌腱免疫原性的问题， 同时很好地保留了肌腱组织的结构特征、生物力学性能和生物活性因子，制备方法简单，成 本低廉，具有较好的应用前景。
[0019] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1肌腱压缩示意图（沿肌腱厚度方向压缩）；
[0022] 图2不同压缩比例H&E染色观察（a，b，c，d压缩比例依次为30%，50%，70%，80%);
[0023] 图3DNA含量检测结果（1，2, 3, 4依次为A组，B组，C组，D组，#为差异有统计学 意义，A组，B组，C组，D组依次表示核酸酶处理6h，12h，18h，24h);
[0024] 图4α-Gal含量检测结果（1，2, 3, 4依次为A组，B组，C组，D组，Λ、#为差异有 统计学意义，Α组，Β组，C组，D组依次表示α -半乳糖苷酶处理6h，12h，18h，24h);
[0025] 图 5H&E 和 DAPI 染色观察（a、b、c、d :H&E 染色（X400)，e、f、g、h :DAPI 染色 (X 100)，a、e，b、f，c、g，d、h 分别对应 A 组，B 组，C 组，D 组）；
[0026] 图 6 免疫组化观察（a、b、c、d :FN (X200)，e、f、g、h :DCN (X200)，i、j、k、1 : a -gal ( X400) ;a、e、i，b、f、j，c、g、k，d、h、1 分别对应 A 组，B 组，C 组，D 组）；
[0027] 图7天狼星红染色观察（X 200, a，b，c，d分别对应A组，B组，C组，D组）；
[0028] 图8阿利新蓝染色观察（X 200, a，b，c，d分别对应A组，B组，C组，D组）；
[0029] 图 9FT-IR 图谱；
[0030] 图10植入材料示意图；
[0031] 图11取材大体观察图（a、d，b、e，c、f分别对应术后1W，4W，8W结果）；
[0032] 图 12H&E 染色观察（X100a、b、c、d、e，f、g、h、i、j，k、l、m、n、o 分别为术后 1W， 4W，8W 结果。a、f、k 为 A 组，b、g、1 为 B 组，c、h、m 为 C 组，d、i、n 为 D 组，e、j、o 为 PGA 材 料)。
【具体实施方式】
[0033] 缩略词表：
[0034]
[0035；
【权利要求】
1. 一种制备脱细胞肌腱材料的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 取新鲜肌腱，清洗； (2) 将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60?90% ; (3) 对步骤（2)压缩后的肌腱进行反复冻融； (4) 将步骤（3)处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述压缩率为70?80%。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述反复冻融是将步骤（2) 压缩后的肌腱置于液氮中1?3min，25?37°C放置3?lOmin，重复操作4?6次。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反复冻融是将步骤（2)压缩后的肌腱 置于液氮中lmin, 37°C放置5min,重复操作5次。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，核酸酶处理的方法为：取步 骤（3)处理后的肌腱，置于DNase浓度为120?180IU/ml、RNase浓度为80?120μ g/ml 的核酸酶溶液中，室温或37°C恒温处理6?24h。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸酶溶液中，Dnase的浓度为 150IU/ml，Rnase的浓度为100μ g/ml ;所述处理的温度为37°C，处理的时间为6h。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下处理步骤：取步骤 (4)处理后的肌腱，置于α -半乳糖苷酶浓度为3?8U/ml的溶液中，15?40°C处理6? 24h。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述溶液中，α-半乳糖苷酶的浓度为 5U/ml ;所述处理的温度为26°C，所述处理的时间为6h。
9. 权利要求1?8任意一项所述方法制备的脱细胞肌腱材料。
10. 权利要求9所述的脱细胞肌腱材料在制备治疗软组织缺损修复材料中的用途； 优选地，所述软组织缺损修复材料是肌腱组织或韧带组织缺损修复材料。
【文档编号】A61L27/36GK104208750SQ201310636964
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】秦廷武, 江燕林, 宁良菊 申请人:四川大学华西医院