一种腹可安片的制备方法及其在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞p19细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种腹可安片的制备方法及应用。本发明的腹可安片的制备方法，由扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g作为原料药制成，采用微波萃取和大孔树脂吸附制备而成，使得总黄酮含量有很大提高。本发明还提供了腹可安片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用。
【专利说明】一种腹可安片的制备方法及其在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种腹可安片的制备方法及其在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002]腹可安片标准号WS-10256 (ZD-0256)-2002，记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g作为原料药制成，具有清热利湿，收敛，止痛的功效。用于急性胃肠炎、消化不良引起的腹痛、腹泻、呕吐。
[0003]现有技术中，尚未有腹可安片在提取制备方面采用微波技术和大孔树脂吸附提取技术的报道，而水煮醇提，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种腹可安片的制备方法。
[0005]本发明的另一 个目的在于提供一种腹可安片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用。
[0006]本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007]一种腹可安片的制备方法，由扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g作为原料药制成，其特征在于，所述的制备方法由下列步骤组成:取上五味药材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，65%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的腹可安片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。
[0009]上述的腹可安片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
[0010]上述的腹可安片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用。
[0011]现有技术中，腹可安片口服，一次4片，一日3次。腹可安片服药量大。采用本发明方法制备成的腹可安片每片重0.3g，每次仅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
[0012]试验一、不同方法制备的腹可安片中总黄酮含量的比较
[0013]1、仪器及试药本发明腹可安片:按实施例1方法制备，使用3330g原料药，经提取制成500片，每片重0.3g。原腹可安片，按照WS-10256 (ZD-0256)-2002标准方法制备，作为对照。可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190) ；METTLER AE240电子分析天平；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)。[0014]2、方法
[0015]对照品溶液的制备精密称取在120°C减压干燥至恒重的芦丁对照品适量，加60%乙醇制成每Iml含0.1mg的溶液，即得。
[0016]标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml, 2.0ml, 3.0ml, 4.0ml, 5.0ml，分别置25ml量瓶中，各加10 %亚硝酸钠溶液0.3ml，混匀，放置6分钟，加10 %硝酸铝溶液0.3ml，混匀，放置6分钟，加4%氢氧化钠溶液4ml，摇匀，加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)试验，在510nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0017]测定法取重量差异项下的本品，除去包衣，研细，取样(本发明方法制备的腹可安片取0.125g，原腹可安片称取0.2g)，精密称定，置圆底烧瓶中，加入甲醇25ml，摇匀，加热回流I小时，取出，冷却至室温，滤过，滤纸连同残渣再加甲醇25ml，加热回流I小时，取出，冷却，滤过，合并滤液，残渣用甲醇15ml分次洗涤，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加60%乙醇溶液使溶解，转移至50ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，照标准曲线制备项下方法，自“分别置25ml量瓶中”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。
[0018]3、结果
[0019]结果表明，本发明腹可安片中总黄酮的含量以芦丁计为SO-1OOmg/片；而原腹可安片中总黄酮的含量以芦丁计为10.54mg/片，每片芦丁含量相当于原片剂含量的8-10倍，在服用量减少的情况下，总黄酮含量有很大提高。
[0020]上述研究表明，采用本发明制备方法制备的腹可安片，有效成分含量远远高于WS-10256 (ZD-0256) -2002标准记载的方法制备的腹可安片。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0022]实施例1
[0023]取扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，65%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。
[0024]经检测，成品总黄酮的含量以芦丁计为98.92mg/片
[0025]实施例2 [0026]取扭肚藤1000g、火炭母1000g、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g，将五味药材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，65%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。[0027]经检测，成品中总黄酮的含量以芦丁计为82.16mg/片。
[0028]实施例3
[0029]取扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g，将五味药材，粉碎，加入10L的65%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率800W,萃取2次,每次10分钟,合并萃取液,浓缩,加到DiaionHP-1O大孔吸附树脂柱上，65%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重 0.3g。
[0030]经检测，成品中成品中总黄酮的含量以芦丁计为90.44mg/片。
[0031]实施例4:腹可安片抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖的实验研究资料
[0032]1.实验材料
[0033]1.1实验用细胞株
[0034]小鼠畸胎瘤细胞P19细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0035]1.2实验药物
[0036]研究药物:本发明腹可安片:按实施例1方法制备。
[0037]药液储液:称取IOOmg腹可安片，溶于5ml无水乙醇中，0.2 μ m滤器过滤，500 μ Idoff管分装，-20°c 存储，同时0.2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0038]1.3实验试剂
[0039]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(溜博亚杜兰经贸有限公司)；MTT (Biosharp 批号:0793) =PBS (实验室自配)；
[0040]1.4实验器材
[0041]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);C02培养箱(F0RMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号=SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:ΚΑ-1000);0.2μπι滤器(MILLIP0RE 型号:SLGP033RB);Icm 培养皿(NEST 公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0042]2.实验方法
[0043]1)P19细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(IOcm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X IO4个/ml。
[0044]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ I,培养板放入细胞培养箱中(37°C，5%C02)常规培养。[0045]3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入腹可安片溶液，继续培养24h。
[0046]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT),继续培养 4h。
[0047]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0048]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0049]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0050]3.统计处理
[0051]采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean+ S.D.表不。
[0052]4.实验结果
[0053]MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对P19细胞增殖抑制有差异(p〈0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P〈0.001)。
[0054]表1腹可安片对P19细胞增殖抑制影响研究(X土 SD)
[0055]
【权利要求】
1.一种腹可安片的制备方法，由扭肚藤lOOOg、火炭母lOOOg、救必应670g、车前草330g、石榴皮330g作为原料药制成，其特征在于，所述的制备方法由下列步骤组成:取上五味药材，粉碎，加入IOL的65%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓缩，加到Diaion HP-1O大孔吸附树脂柱上，65%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成500片，每片重0.3g。
2.根据权利要求1所述的腹可安片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取功率为700W。
3.根据权利要求1所述的腹可安片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
4.权利要求1所述的腹可安片在制备抑制小鼠畸胎瘤细胞P19细胞增殖药物中的应用。
【文档编号】A61P1/08GK103655742SQ201310653240
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】魏书同, 段学文 申请人:山东中大药业有限公司