细胞微粒子-siRNA复合物的制备及其在艾滋病治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及治疗艾滋病的药物，其在细胞微粒子上携有抗HIV特异性的siRNA。本发明还涉及所述药物的制备方法。
【专利说明】细胞微粒子-siRNA复合物的制备及其在艾滋病治疗中的应用
[0001]分案说明
[0002]本申请是 申请人:于2010年12月9日申请的名称为“细胞微粒子-siRNA复合物的制备及其在艾滋病治疗中的应用”，申请号为201010601506.X的中国发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0003]本发明属于艾滋病治疗药物领域，具体采用RNA干扰的方法进行艾滋病的治疗。提供高效、特异性的siRNA及作为运送载体的细胞微粒子。两者的复合物可以作为药物进行艾滋病及HIV感染者的治疗。
现有技术
[0004]艾滋病
[0005]艾滋病的医学名称为"获得性免疫缺陷综合症"(英文缩写AIDS)，是一种病死率很高的严重传染病。它是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的，以T细胞免疫功能缺陷为主的一种综合免疫缺陷病。它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，破坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏。当人体处于正常状态时，体内免疫系统可以有效抵抗各种病毒的袭击。一旦艾滋病病毒侵入人体体内，这种良好的防御体系便会土崩瓦解，各种病毒乘机通过血液、破损伤口长驱直入。此外，人体内一些像癌细胞之类的不正常细胞，也会迅速生长、繁殖，最终发展成各类癌瘤。通俗地讲，艾滋病病毒是通过破坏人的免疫系统和机体抵抗能力，最终导致人体丧失对各种疾病的抵抗能力而导致死亡的。`
[0006]HIV是带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属逆转录病毒科中的慢病毒亚科，目前已发现HIV-1型和HIV-2型。HIV呈球型或卵型，直径100-150nm，系双层结构。病毒的核心位于病毒体的中央或偏心，核心由RNA及核衣壳蛋白质(P7、P9)、逆转录酶(ReverseTranscriptase,RT)、核糖核酸酶H(Ribo H)及整合酶(INT)所组成；核心外为病毒衣壳，呈20面体立体对称，由蛋白质(P17/P18、P24/P25)组成。病毒最外层为膜蛋白。包膜上有72个刺突(Spike)，含糖蛋白gpl20，并在双层脂质中有gP41蛋白。
[0007]艾滋病病毒侵入人体后直接侵犯人体免疫系统，攻击和杀伤的是人体免疫系统中最重要、最具有进攻性的T4淋巴细胞，使机体一开始就处于丧失防御能力的地位。艾滋病病毒一旦进入人体,就寄生于T4淋巴细胞内最核心的部位，并与细胞核的遗传物质DNA整合为一体，并利用T4淋巴细胞进行自身遗传物质的复制。病毒的繁殖和复制使免疫细胞遭到破坏和毁灭，并放出更多的病毒。新增殖病毒再感染更多的细胞。就这样，病毒一代代地复制、繁殖，免疫细胞不断死亡。
[0008]艾滋病通过性、血液和母婴三种接触方式传播，是一种严重危害健康的传染性疾病。艾滋病从发现至今不过几十年，但它在全球所引起的广泛流行，已使3000多万人受到感染，1000多万人失去了生命，世界上每天有万余人新感染上艾滋病病毒。
[0009]艾滋病治疗现状
[0010]目前，抗艾滋病病毒治疗的药物包括:核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等。
[0011]核苷类逆转录酶抑制剂的作用是通过阻断病毒RNA基因的逆转录，即阻断病毒的双股DNA的形成，使病毒失去复制的模板。这些药物首先进入被感染的细胞，然后磷酸化形成具有活性的三磷酸化合物。AZT和d4T是病毒核酸复制天然底物脱氧胸苷dT的类似物；ddC和3TC是脱氧胞苷dC的类似物，这些双脱氧核苷三磷酸盐是HIV-1逆转录酶竞争抑制剂，当他们插入生长的DNA链时，可导致未成熟的DNA链终结，病毒DNA合成受阻并进而导致病毒复制受到抑制。
[0012]非核苷类逆转录酶抑制剂是一组与核苷无关，化学结构完全不同的特异性抑制HIV-1逆转录酶的化合物，它们不是HIV-1逆转录酶底物竞争抑制剂，而是通过与酶活性点附近的P66疏水区结合而抑制逆转录酶。
[0013]蛋白酶抑制剂是基于肽类的化合物，它们或竞争性抑制蛋白酶活性，或作为互补蛋白酶活性点的抑制剂，能抑制蛋白酶的功能，使新产生的病毒不能成熟。
[0014]目前流行的高效抗逆转录病毒疗法，俗称“鸡尾酒疗法”，是采用蛋白酶抑制剂加两种核苷类逆转录酶抑制剂的方法治疗感染者和病人的方法。此种药物具有较强的抗病毒作用，经使用后可在血浆中检测不到病毒，并可长期维持这一疗效。另外，它还可以使被艾滋病病毒破坏的人类免疫功能获得恢复或部分恢复。但是这一疗法有其本身的局限性，包括治疗费用高昂及副作用明显等缺点。
[0015]干扰核糖核酸(small`interfering RNA, siRNA)
[0016]这是一类由20多个核苷酸组成的双链RNA分子，可以通过特异性降解靶基因的信使核糖核酸(messager RNA, mRNA)起到沉默基因表达的作用。这一过程被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。
[0017]RNA干扰是基因转录后调控的一种方式。siRNA可以对其靶基因进行特异性识别，并能招募被称为沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)的蛋白质复合体。RISC包含核糖核酸酶等，可以通过靶向切割同源性mRNA的方式，特异、高效地抑制基因的表达。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于生物医学实验研究及各种疾病的治疗领域。
[0018]目前应用RNA干扰方法治疗艾滋病已成为艾滋病治疗研究的热点，通过设计针对HIV病毒基因组的siRNA，可以特异性降解病毒基因组，从根本上杀灭病毒。研究已经证明，siRNA能有效地抑制HIV病毒在体外培养细胞中的复制。siRNA可以通过抑制HIV病毒自身基因(如口16 4&8，代^丨&丨和6鮮)或宿主基因(如HIV的主要受体CD4)达到阻止HIV感染的目的。
[0019]然而，应用siRNA治疗艾滋病还存在一些有待解决的问题，包括siRNA导入效率低及siRNA的稳定性差等问题。目前，siRNA的导入主要采取载体运载或抗体偶联的方式。载体包括脂质体、纳米胶襄、环糊精包含物等，虽然这些载体可以延长药物在体内的存留时间并一定程度上提高siRNA药物的吸收率，但是其传送药物的靶向性和高效性仍然不足。虽然抗体偶联的方式可以提高siRNA的靶向性，但siRNA在体内的稳定性得不到保证。[0020]因此，RNA干扰方法作为治疗艾滋病病人及HIV病毒感染人群的潜在药物，目前还存在一些未解决的问题，递送siRNA的特异性差及效率低是防妨碍其应用的主要原因。
[0021]细胞微粒子(Microvesicles)
[0022]这是是一类大小在10_500nm之间，由细胞产生(例如分泌)的、具有脂质双层膜的生物(囊泡)结构。早在1967年就有报道，其来源于血小板，包含囊泡，当时被称为“platelet dust”，具有促进凝结的作用。后来体外研究发现内皮细胞、血管平滑肌细胞、白细胞、淋巴细胞、红细胞等也都能释放(细胞)微粒子。根据微粒子产生的途径，又可以将微粒子区分为exosomes和shedding vesicles。Exosomes是细胞在被刺激的情况下,通过多囊泡小体(Multivesicular bodies,MVBs)胞吐到细胞外的,而shedding vesicles则是直接从细胞表面以出芽的方式分泌出来的。目前，不同细胞分泌的shedding vesicles被命名为不同的名称，比如中性粒细胞和单核细胞分泌的被称为ectosomes，而血小板分泌的则被称为microparticles。细胞微粒子的膜成分取决于其来源的细胞,主要由脂质和蛋白质组成。
[0023]我们研究发现细胞微粒子来源于生物体，对生物体具有高亲和性，是理想的药物用载体，可用于RNA干扰方法中用于作为治疗艾滋病人及HIV病毒感染人群中以高效、特异性地递送siRNA。
[0024]具体地，我们发现:细胞微粒子是一种在生物体内转运效率高，特异性强的生物囊泡载体，且不同细胞释放的微粒子的膜表成分(包括特异性表面受体及膜脂结构)与对应细胞的质膜成分相同，因此，细胞微粒子带有来源细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性；同时，由于细胞微粒子中还含有siRNA发挥作用所需的重要蛋白，因此，如果采用细胞微粒子作为运送siRNA的载体，就可以高效率、选择性地递送siRNA到靶细胞/组织，从而大大提高siRNA调控细胞功能的作用。因此，由于细胞微粒子(包括所有具有细胞微粒子特征的膜`脂囊泡结构，比如exosome和shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称)可以提高siRNA运输的特异性、祀向性和稳定性；以及可以促进siRNA作用效果等优点，能够有效用于艾滋病的治疗中。
[0025]因此，本发明提供一种应用细胞微粒子运送针对HIV病毒基因组的siRNA的方法。本发明还涉及细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA的复合物，其制备方法，及其在治疗艾滋病及HIV感染者等方面的应用。
【发明内容】
[0026]本发明提供一种治疗艾滋病的药物复合物，可用于有效输送治疗艾滋病的药物。所述药物复合物为siRNA和细胞微粒子的复合物，包括针对HIV病毒基因组的siRNA以及作为载体的细胞微粒子；
[0027]所述HIV病毒包括HIV-1及HIV-2两种类型。
[0028]优选的，所述HIV病毒为HIV-1型病毒。
[0029]所述siRNA包括所有能针对HIV基因组，并能导致HIV基因组特异性降解的siRNA序列。
[0030]优选的，所述siRNA序列为下列序列的一种或多种:
[0031 ] I) HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA[0032]2 ) HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0033]3 ) HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0034]4 ) HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0035]5) HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0036]6 ) HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG
[0037]7 ) HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0038]8 ) HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0039]所述细胞微粒子包括各种大小在10_500nm之间、由细胞分泌，例如以出芽或胞吐形式分泌的、具有脂质双层膜的天然生物囊泡，包括被称为exosome、shedding vesicles的结构以及各种细胞分泌的shedding vesicles。
[0040]所述细胞微粒子与siRNA以包裹与被包裹的关系存在；
[0041]所述细胞微粒子-siRNA复合物为表达有siRNA的宿主细胞分泌产生；
[0042]所述宿主细胞包括现有所有细胞系、 细胞株、以及正常人或疾病患者自身组织/细胞的原代培养物。
[0043]本发明还提供一种制备上述细胞微粒子-siRNA复合物药物的方法。
[0044]所述复合物药物包括针对HIV病毒基因组的siRNA以及作为载体的细胞微粒子；
[0045]所述制备药物的方法包括将siRNA导入宿主细胞及从细胞中提纯出载有siRNA的细胞微粒子的步骤。
[0046]所述将siRNA导入宿主细胞的方法包括:1)应用脂质体转染人工合成的成熟体siRNA ；2)应用脂质体或电转染方法，转染携带siRNA表达序列的病毒载体或质粒；以及3)建立siRNA永久表达细胞株等三种方法。
[0047]优选的，应用脂质体转染人工合成的成熟体siRNA的方法包括以下步骤:
[0048]I)设计针对HIV病毒基因组的siRNA序列；
[0049]所述siRNA包括所有能针对HIV基因组，并能导致HIV基因组特异性降解的siRNA序列。设计方法参见本领域常规技术方法。优选的，所述siRNA序列为下列序列的一种或多种:
[0050]1.HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA[0051 ] i1.HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0052]ii1.HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0053]iv.HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0054]V.HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0055]v1.HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG
[0056]vi1.HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0057]vii1.HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0058]2)依照设计好的序列人工合成siRNA ；
[0059]3)应用脂质体将siRNA导入细胞内。
[0060]优选的，应用脂质体或电穿孔转染法，转染携带siRNA表达序列的病毒载体或质粒的方法包括以下步骤:
[0061]I)设计针对HIV病毒基因组的siRNA表达序列；[0062]所述表达序列包括任一种或多种针对HIV基因组的siRNA的反向互补序列。
[0063]I)依照设计好的序列人工合成表达序列；
[0064]2)将表达序列插入到适合其表达的病毒载体或质粒中；
[0065]3)将重组的病毒载体或质粒应用脂质体或电转染方法，导入宿主细胞内；
[0066]4)使siRNA表达载体在细胞内表达siRNA。
[0067]优选的，建立siRNA永久表达细胞株的方法包括:
[0068]I)设计针对HIV病毒基因组的siRNA表达序列；
[0069]2)构建siRNA表达载 体；优选的，所述载体为慢病毒载体；
[0070]3)对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
[0071]4)使用高效重组载体(脂质体)和重组质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
[0072]5)浓缩、纯化病毒液；
[0073]6 )采用GFP荧光法检测病毒滴度；
[0074]7)用高质量的病毒液感染宿主细胞；
[0075]8)检测基因功能或者siRNA的沉默效率；
[0076]9)使用抗生素进行稳定转染细胞株的筛选；
[0077]10)采用单克隆培养，建立永久表达的转基因单克隆细胞株。
[0078]所述宿主细胞包括现有所有细胞系、细胞株、以及正常人或疾病患者自身组织/细胞的原代培养物。
[0079]所述提纯载有siRNA的细胞微粒子的方法包括以下步骤:
[0080]I)收集siRNA导入后的细胞的培养液；
[0081]2)采用一定方法分离提纯其中的细胞微粒子。
[0082]所述提纯细胞微粒子的方法包括差速离心法、免疫吸附法及超滤法中的一种或多种。
[0083]优选地，所述制备方法为差速离心法，例如包括以下步骤的差速离心法:(I)先将细胞或组织于300g离心5分钟，取上清；(2)将上清于1500g离心20分钟，取上清；(3)将上清于1000Og离心30分钟，取上清。(4)将上清于IlOOOOg离心70分钟，取沉淀即为细胞
微粒子。
[0084]或者优选地，所述制备方法为免疫吸附法，例如包括以下步骤的免疫吸附法:(I)先将细胞或组织于3000转/分钟下离心30分钟，取上清；(2)将吸附在组织培养皿上的细胞特异性的抗体或免疫磁珠与上清温育30~60分钟，回收被吸附的细胞微粒子。
[0085]或者优选地，所述制备方法为超滤法，例如包括以下步骤的超滤法:⑴先将细胞或组织于3000转/分钟下离心30分钟，取上清；(2)将上清放入带有一定孔径滤膜的浓缩离心管，于4000转/分钟进行离心，浓缩即得。
[0086]本发明还提供一种该复合物药物在艾滋病及HIV病毒携带者治疗中的应用。
[0087]用本发明的药物复合物治疗艾滋病或HIV病毒携带者可以采用以下方法实现:
[0088]I)将上述复合体药物注入受体或加入受体细胞；
[0089]2)通过siRNA介导的沉默作用阻断HIV病毒的扩张；
[0090]3)任选地，检测HIV病毒含量的变化，即复合药物治疗艾滋病的效果；[0091]所述受体包括艾滋病患者和/或HIV病毒感染者。
[0092]所述受体细胞包括所有被HIV感染的细胞系、细胞株、以及艾滋病患者及HIV感染者自身组织/细胞的原代培养物。
[0093]所述检测HIV含量的方法包括病毒核酸检测法、P24抗原检测法等。
[0094]优选的，所述病毒核酸检测方法为应用荧光实时定量PCR法(Real-time PCR)检测HIV病毒核酸含量。具体包括以下步骤:1)提取病毒RNA ;2)对HIV RNA进行逆转录(RT)，然后对其产物cDNA进行PCR扩增。根据PCR反应中的得到的CT值，推导出最初参与反应的病毒cDNA的模板数，进而得到病毒含量。
[0095]优选的，P24抗原检测法为应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测P24抗原:通常采用夹心法ELISA，即将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底，当加入待测血清后，若血清中含有p24抗原，则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶(HRP)标记的抗体，加底物显色后，在酶标仪上检测反应产物的吸光度(0D值)。由于在一定范围内，OD值的大小和P24抗原的含量成线性相关，因此OD值就可以直观反映病毒含量的多少。
【专利附图】
【附图说明】
[0096]图1 一例瞬时表达载体的结构图。
[0097]图2 —例永久表达载体的结构图。
[0098]图3电子显微镜下观察细胞微粒子。
[0099]图4转染过荧光标记的siRNA的293T细胞。
`[0100]图5流式细胞方法检测的细胞微粒子-siRNA复合体。
[0101]图6复合物药物和相应对照对假病毒的影响。
[0102]图7八种siRNA序列对应的复合物药物对假病毒的抑制率。
[0103]图8复合物药物HIV-T3对HIV病毒的抑制率。
实施例
[0104]可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
[0105]实施例1转染人工合成的siRNA成熟体
[0106]本实施例将人工合成的成熟体siRNA转染进入细胞，具体包括以下步骤:
[0107]I)设计针对HIV-1病毒基因组的siRNA序列，具体地，我们针对HIV-1基因组的gag和tat基因的保守区域设计了 8条干扰RNA序列:
[0108]HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA
[0109]HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0110]HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0111]HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0112]HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0113]HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG[0114]HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0115]HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0116]2)人工合成上述成熟体siRNA。
[0117]3)应用脂质体(采用脂质体 Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)将 siRNA转染进入胚肾上皮细胞系293T细胞(美国标准菌种收藏所，American Type CultureCollection, ATCC),具体方法如下:
[0118](1) 293T细胞培养在添加了 10%胎牛血清(Gibco，美国)的高糖DMEM培养基(Gibco,美国)中，5%C02、37°C培养。
[0119](2)将 30 μ I lipofectamine2000 和 600pmol 的阴性对照 siRNA(随机合成的非特异性siRNA序列)分别与Iml OPT1-MEM(Gibco,美国)混合，形成混合物A和混合物B，室温下放置5min。
[0120](3)将 30 μ I Iipofectamine2000 和 600pmol 的 siRNA 分别与 ImlOPT1-MEM(Gibco,美国)混合，形成混合物C和混合物D，室温下放置5min。
[0121](4)将混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。
[0122](5)将混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。
[0123](6)将混合物E和F分别加入对照组和实验组细胞中，补足OPT1-MEM到15ml。5%C02、37°C 培养。
[0124](7)6小时后更换成`正常培养液。
[0125](8) 24h~48h后转染结束，收集样品。
[0126]实施例2转染针对HIV病毒基因组的siRNA的瞬时表达载体
[0127]本实施例采用分子生物学方法构建siRNA的瞬时表达载体，用于在培养细胞内表达siRNA,具体包括以下步骤:
[0128]I)设计实施例1中针对HIV病毒基因组的siRNA的表达序列；
[0129]2)人工合成上述siRNA表达序列，并将合成的序列插入到siRNA真核表达载体pcDNA6.2GW/EmGFP-miR(invitrogen美国)中，构建重组载体。表达载体的结构示意图如图1所示；
[0130]3)将重组载体采用脂质体法或电穿孔转染法转染进入宿主细胞293T细胞(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection, ATCC)。
[0131]脂质体转染法的具体步骤包括:(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化收集处于对数生长期的细胞，细胞加入12孔板内，每个孔内加2ml已调整好浓度的细胞悬液，使每个孔内细胞数为3X105个，37°C，5% CO2培养箱孵育；(2)24h后细胞密度达80%左右，可以用来转染；(3)按照Lipo_fectamine2000脂质体使用说明书，取3.0 μ g用于转染的载体加入100 μ I无血清、无抗生素的Opt1-MEM液,轻轻混匀；(4)取2 μ I脂质体加入100 μ IOpt1-ΜΕΜ,轻轻混匀，室温下孵育5min ； (5)将稀释的质粒和稀释的Lipofectamine2000混合，轻轻混匀，室温下孵育20min ； (6)将混合物加到12孔板的每个孔内，每个孔内加入混合物的体积为100 μ I，轻轻混匀；(7) 37V,5% CO2培养箱孵育4~6h后将含有脂质体和质粒的培养液换掉，代之以含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37°C，5% CO2，培养箱孵育；
(8)利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，计数细胞的转染效率为80%。
[0132]电穿孔转染法的具体步骤包括:(I)细胞生长到对数期，用胰酶消化，4°C，1000g离心5min ； (2)用0.5倍体积的电穿孔液重悬细胞，细胞密度调至3 X IO6细胞/毫升；(3)将400 μ I的细胞悬液(IO6-1O7细胞)内加入30 μ I的载体DNA，用吸管将细胞和DNA轻轻混匀；(4)将混合物加入电转化池中，冰浴。将电转化池移至电极间放电，I~2min后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作；(5)用灭菌的吸头将电穿孔的细胞转移至培养皿中，加入细胞完全培养液，置于含5% C02、37°C培养箱孵育，用于转染效率观察；(6)利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并计数细胞的转染效率，为75%。
[0133]实施例3建立能够永久表达siRNA的转基因细胞株
[0134]为了得到稳定表达的，针对HIV病毒基因组的siRNA，本实施例通过构建siRNA永久表达载体,将其转染进入宿主细胞，同时通过筛选,选择载体插入到宿主细胞基因组的永久表达克隆，将其单克隆培养，从而建立能永久表达siRNA的转基因细胞株。
[0135]具体步骤包括:
[0136]I)人工合成实施例1中针对HIV病毒基因组的siRNA的表达序列；
[0137]2)构建慢病毒载体:将人工合成的序列分别插入慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST (invitrogen,美国)，构建重组载体。载体结构示意图如2所示；
[0138]3)慢病毒包装:将重组载体转染293T细胞，包装病毒。具体包括以下步骤:1.293T细胞的培养；2.将合适数量的细胞接种入4X IOcm培养皿，过夜培养；3.用包装质粒(Invitrogen,美国)和病毒载体共转染；4.换液,继续培养；5.收集病毒液；2000g,离心IOmin去细胞及碎片，并过0.45 μ m滤膜,获得病毒原液，浓缩病毒液，重悬于400 μ I培养基。6.病毒活性滴度的测定:将ΗΕΚ293细胞接种96孔板，梯度稀释病毒液，加入ΗΕΚ293细胞中，72小时后观察带GFP荧光细胞，计算病毒活性滴度。ΗΕΚ293细胞采用添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，美国)，在5%C02，37°C下培养。
[0139]4)病毒侵染及单克隆阳性克隆筛选。具体包括以下步骤:1.培养293T细胞至对数期；2.将合适数量的细胞接种入培养皿，过夜培养；3.用前期制备的慢病毒侵染293T细胞；4.换液，继续培养；5.加抗性筛选(必要时采用流式分选阳性细胞)；挑多个单克隆筛选阳性克隆；6.扩增细胞至足够数量。
[0140]实施例4分离纯化载有siRNA的细胞微粒子
[0141]细胞内的siRNA可以被细胞分泌的细胞微粒子包裹，近而分泌到细胞外。通过收集细胞培养液，经过一系列的分离纯化，就可以得到载有siRNA的细胞微粒子，即细胞微粒子-siRNA复合物。
[0142]本实施例分别采用以下方法分离已转入siRNA的细胞分泌出的载有siRNA的细胞微粒子:
[0143](I)差速离心法:先将培养细胞依次通过300g、1500g及1000Og离心，除去各类细胞及碎片，然后将上清超速离心110 OOOg离心70分钟，取沉淀便是细胞分泌的载有SiRNA的细胞微粒子。
[0144](2)免疫吸附法:将细胞特异性的抗体吸附在组织培养皿上或直接
[0145]用免疫磁珠，将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直接和培养皿或免疫磁珠温育(30分钟或I小时)，不同细胞的细胞微粒子可直接被吸附和回收。
[0146](3)过滤法:将除去各类细胞及碎片后的血清/血浆或细胞培养液直
[0147]接放在带有100KD滤膜的浓缩离心管，在4 000转/分钟进行离心，细胞微粒子将留在离心管内被浓缩获得。
[0148]将分离得到的细胞微粒子在透射电镜下观察，具体包括:细胞微粒子沉淀用2.5%戊二醛固定液在4°C固定过夜，PBS漂洗三遍，每遍10分钟。之后用1%的四氧化锇室温固定60分钟。固定后的样品用10%的明胶包埋，然后在4°C用戊二醛再固定后，将样品切成小块(体积小于I立方毫米)。样品用依次增高浓度的乙醇溶液脱水(30%，50%, 70%, 90%, 95%和100%X3)。用环氧树脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片机切片，最后用FEI TecnaiT20透射电子显微镜在120kV条件下观察。
[0149]采用差速离心法分离得到的细胞微粒子的透射电镜图如图3所示，显示从培养细胞中分离到的细胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范围。
[0150]实施例5细胞微粒子及其载有的siRNA组成的药物复合物的检定
[0151]本实施例通过一系列方法检定细胞微粒子及其载有的siRNA组成的药物复合物的存在。
[0152]I)通过实施例1所述方法将突光标记的siRNA转染入细胞。结果如图4所示,在荧光显微镜下观察可见荧光标记的siRNA(箭头所指亮点)已经转染进入细胞。
[0153]2)通过实施例4所述方法分离鉴定转染过荧光标记的siRNA的供体细胞分泌的细胞微粒子。结果如图3所示，可见分离得到的细胞微粒子从形态、大小、膜结构等方面均符合细胞微粒子的特点(所述特点参见:Thery, C.，Zitvogel, L.，and Amigorena, S.(2002).Exosomes: composition, biogenesis and function.Nat Rev Immunol2, 569-579.Cocucci，E.，RacchettijG.&Meldolesi，J.Shedding microvesicles: artefacts no more.TrendsCell Bioll9，43-51(2009))。
[0154]3)通过流式细胞`方法检测分离纯化并鉴定为细胞微粒子的颗粒中是否包裹有siRNA，即是否组成了细胞微粒子-siRNA复合物，结果如图5所示。由于siRNA是被荧光标记的，如果细胞微粒子中含有siRNA，那么，细胞微粒子也一定能被荧光标记。因此，我们采用流式细胞方法检测细胞微粒子所带的荧光状况。由图5可见，有大量细胞微粒子携带有荧光(图5竖线以右部分)，证明细胞微粒子中包裹有siRNA，也即证明了细胞微粒子-siRNA药物复合物的存在。
[0155]实施例6应用细胞微粒子-siRNA复合物药物在体外抑制HIV假病毒
[0156]HIV假病毒为用其他低危害病毒外壳蛋白包裹HIV病毒基因组而构成的模拟HIV病毒作用方式，但危害性远远降低的仿HIV病毒。一般制造HIV假病毒的方法包括:构建表达HIV基因的重组表达质粒和表达其他低危害病毒，如疱疹性口炎病毒的壳G糖蛋白基因的重组表达质粒，将两种质粒共转染哺乳动物细胞，获得假型慢病毒。
[0157]本实施例通过检测细胞微粒子-SiRNA复合物药物对于HIV假病毒的抑制作用，为复合物药物对艾滋病的治疗效果提供支持。
[0158]具体实验步骤包括:1)按照实施例3的方法构建永久表达siRNA的转基因细胞株；2)按照实施例4的方法分离纯化转基因细胞分泌的载有siRNA的细胞微粒子，即细胞微粒子-siRNA复合物；3)将复合物药物加入到感染了 HIV假病毒的Hela(CD4-LTR/β-Gal)细胞(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection, ATCC)中。Hela细胞采用添加了 10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco，美国)，在5%C02，37°C下培养；4)检测病毒滴度，分析复合物药物对HIV假病毒的抑制作用。[0159]结果如图6所示，纵坐标显示了 HIV假病毒在293T细胞中的含量。将完全不加病毒的空白细胞作为对照(横轴I代表的柱子)，将其值设为I ;单加入病毒而不采取任何治疗措施的细胞(横轴2代表的柱子)中的假病毒含量是对照细胞的16倍多。然而，加入细胞微粒子-SiRNA复合物药物作为治疗手段，宿主细胞内的假病毒含量就大量减少。从结果可见，加入药物(横轴5、6代表的柱子)后,宿主细胞内的假病毒已降低到40%左右(横轴6代表的柱子)。更重要的是，增加药物的用量(横轴5代表的柱子)，宿主细胞内的HIV假病毒甚至被完全抑制，HIV假病毒的含量下降到和不加假病毒组(横轴I代表的柱子)相同的水平。
[0160]另外，为了确定细胞微粒子-s i RNA复合物药物对HIV假病毒的抑制作用是由于siRNA，而不是细胞微粒子造成的，我们还向HIV假病毒感染的宿主细胞中转入了不含SiRNA的细胞微粒子作为另一个对照(横轴3代表的柱子)。从结果可以看出，仅细胞微粒子无法对HIV假病毒产生抑制作用，也证明了产生病毒抑制作用不是细胞微粒子而是siRNA本身。
[0161]同时，我们还加入了一种短肽类的抗艾滋病药物作为阳性对照(横轴4代表的柱子)。由结果可以看出，这种药物也只能将HIV假病毒含量降低到50%左右。因此，可以看出细胞微粒子-siRNA复合物药物与常规治疗艾滋病的药物相比，其作用效率更高，抑制假病毒的效果更好。
[0162]实施例1中所有8种siRNA序列对应的复合体药物对HIV假病毒的抑制效果如图7所示。由图可见，所有药物对HIV假病毒的抑制率都达到60%以上，有的甚至达到86%。同时，所有药物对假病毒的抑制率都随着药物浓度的降低而下降。 [0163]这一结果证明了，本实施例中8种细胞微粒子-siRNA复合物药物对HIV假病毒有非常强的抑制作用，同时这一作用是浓度依赖性的，并不是偶然和随机的现象。
[0164]实施例7应用细胞微粒子-siRNA复合物药物在体外抑制HIV-1病毒
[0165]本实施例检测了 siRNA序列HIV-T3对应的复合物药物对HIV-1病毒的抑制作用。
[0166]具体实验步骤包括:1)按照实施例3的方法构建永久表达siRNA序列HIV-T3的转基因细胞株；2)按照实施例4的方法分离纯化转基因细胞分泌的载有siRNA的细胞微粒子，即细胞微粒子-siRNA复合物；3)将复合物药物加入到感染了 HIV-1病毒的T细胞白血病细胞系Jurkat细胞(ATCC)中，Jurkat细胞采用添加了 10%胎牛血清的1640培养基(Gibco，美国)，在5%C02，37°C下培养；4)检测病毒滴度，分析复合物药物对HIV病毒的抑制作用。
[0167]结果如图8所示。由结果可见，siRNA序列HIV-T3对应的复合物药物对HIV-1病毒有非常强的抑制作用。当加入药物原液时(横轴I所对应的柱子)，药物对HIV-1病毒的抑制率可以达到95.95%，而当药物以2倍梯度稀释(横轴2-6对应的柱子)时，其对HIV-1病毒的抑制率也随之降低。
[0168]本结果更进一步证明了细胞微粒子-siRNA复合物药物在细胞外对HIV病毒的抑制作用，为该药物的后期开发奠定了基础。
[0169]根据上述方法，本发明人证明上述细胞微粒子-siRNA复合物可以作为药物，对HIV病毒起到抑制作用。其作用原理为:针对HIV病毒基因组的siRNA可以通过细胞微粒子高效、特异性的进入受到HIV病毒感染的靶细胞，通过siRNA介导的，对病毒基因组特异性的切割作用，从而起到抑制病毒的作用。
[0170]运用siRNA进行疾病治疗的优势在于:siRNA是通过和其靶基因配对作为识别信号，招募沉默复合体对其目的基因进行特异性切割而发挥作用的。siRNA药物作用的靶点只有其靶基因，而不会干扰生物体内其他基因的正常表达，因此，其具有较高的特异性和较小的副作用。应用siRNA治疗艾滋病更具有其特有的优势，由于HIV病毒基因组为外源进入人体的核糖核酸，因此，siRNA药物对HIV病毒的抑制完全不会影响到人体其他细胞的正常生理功能，因此不会对人体造成伤害。
[0171]同时，应用细胞微粒子作为载体运送siRNA的优势在于:首先，细胞微粒子来源于细胞，是生物体本身存在的，从而可以克服目前人工合成的药物载体对细胞的毒性以及对身体的损害；其次，将siRNA包裹进入细胞微粒子的过程中所应用的各种技术手段都很容易实现，同时包裹效率很高，这在一定程度上加大了其实际应用的潜力；更重要的是细胞微粒子是具有双层质膜结构的囊泡结构，外膜和细胞质膜结构类似，可以通过和细胞膜融合、胞吞作用进入细胞。同时，由于细胞微粒子也携带有一些有助于RNA干扰作用的蛋白质，因此可以提高siRNA的作用效率。如果应用病人自身组织或细胞的原代培养物分泌的细胞微粒子包裹siRNA还可减少免疫排斥并进一步提高细胞微粒子携带siRNA进入生物体的效率。基于以上优势 ，细胞微粒子作为载体运送siRNA作为药物将会在药物开发及临床疾病的预防和治疗中起到重要的作用。
【权利要求】
1.细胞微粒子-抗Hiv特异性SiRNA的复合物，其中抗HIV特异性siRNA的序列选自:
2.根据权利要求1的复合物，其中所述细胞微粒子来自人或动物的供体细胞。
3.根据权利要求2的复合物，其中所述供体细胞包括:细胞系、原代细胞培养物。
4.根据权利要求2的复合物，其中所述细胞微粒子为生物囊泡结构。
5.根据权利要求1的复合物，其中抗HIV特异性siRNA包裹于细胞微粒子中。
6.根据权利要求1的复合物，其中细胞微粒子的平均粒径为10-500纳米。
7.权利要求1所述的细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA的复合物在制备用于治疗艾滋病或HIV感染的药物中的用途。
8.一种药物组合物，包括权利要求1-6中任一项所述的细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA复合物。
9.制备权利要求1-6中任一项所述的细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA复合物的方法，包括下列步骤: 将抗HIV特异性siRNA转入细胞，优选应用转染成熟体siRNA方法或转染siRNA瞬时表达载体方法或建立siRNA永久表达细胞株方法； 分离细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA复合物。
10.权利要求12的方法，其中通过选自差速离心法、免疫吸附法和超滤法中的一种或多种分离所述的细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA复合物。
11.权利要求1-6中任一项所述的细胞微粒子-抗HIV特异性siRNA复合物在制备治疗患有艾滋病的受体的药物中的用途，其中所述受体包括艾滋病患者或HIV病毒感染者。
12.根据权利要求11的用途，所述受体的细胞包括被HIV感染的细胞系或细胞株或艾滋病患者及HIV感染者自身组织/细胞的原代培养物。
【文档编号】A61K48/00GK103757001SQ201310714823
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2010年12月9日 优先权日:2010年12月9日
【发明者】张辰宇, 曾科, 顾宏伟, 曹鸣辉, 李丽明 申请人:江苏命码生物科技有限公司