一种肿瘤细胞靶向载药微胶囊的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤细胞靶向载药微胶囊，所述微胶囊以待载药物纳米颗粒为囊芯，以聚乙烯亚胺和β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺交替包裹囊芯形成壳体，在壳体外包覆含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺作为最外层，并在最外层表面键合聚乙烯醇链段；本发明选取具有质子海绵效应的阳离子聚合物PEI和具有电荷翻转功能的阴离子聚合物PAH-Cit，构筑具有在肿瘤部位酸性条件下可脱卸PEG保护层的并可在细胞内可控快速释药的智能型载药纳米微胶囊，以达到克服肿瘤的耐药性，提高抗癌药物的药效并减小其毒副作用的目的。
【专利说明】一种肿瘤细胞靶向载药微胶囊
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及药物靶向释放系统，具体涉及一种多功能肿瘤细胞靶向聚合物载药微胶囊及其构建方法。 (二)【背景技术】
[0002]革巴向给药系统(targeteddrug delivery systems)通过提高药物的革巴向性，能有效改善药物生物利用度，降低药物的不良反应，是目前肿瘤治疗领域的研究热点之一。随着人们对疾病认识水平由组织学水平逐渐向细胞学水平发展，靶向给药不但要求载体能携带药物到达靶组织，而且还能进入靶细胞。近年来备受关注的抗癌药物的细胞内给药(intracelIulardelivery)将给药系统由传统的定位于血液、肿瘤组织,进一步定位于肿瘤细胞内的细胞基质(cytoplasmic matrix)或亚细胞器(subcellular compartments),使药物分子能直接作用于细胞中的药物靶点，最大程度地增强药物疗效。
[0003]纳米药物载体如脂质体、胶束和微胶囊等具有保护药物以及毒副作用小等优点而广泛用于细胞靶向给药系统的研究中。药物载体在肿瘤部位聚集，是实现细胞靶向给药的前提。研究者们常采用聚乙二醇(PEG)等具有“隐形”(stealthy)功能的大分子对纳米载体表面进行修饰，以“屏蔽”其在血液循环中与正常组和细胞间的相互作用，使得载体粒子能够“逃避”网状内皮系统(Reticuloendothelial system, RES)的捕捉,延长体内循环时间，并借助增强渗透及滞留效应(enhanced permeability and retention (EPR) effect)达到肿瘤部位聚集的目的。但一些研究也发现，PEG链段在抑制载体与正常组织和细胞的相互作用的同时，与靶细胞的相互作用也受到一定程度的抑制。Hong等发现经PEG修饰的脂质体被C-26结肠癌细胞吞噬的能力要明显小于非PEG修饰的脂质体；也有研究报道显示，即使是配体-受体主动靶向型载体，经PEG修饰后也会影响配体和受体之间的结合能力，从而导致肿瘤细胞对载体的摄取能力下降。不可忽视的是，PEG在某种程度上的非选择性抑制作用会降低药物载体的细胞靶向功能，进而影响药效的发挥。另外，大多数抗癌药物的靶点位于细胞内的蛋白质、核酸、酶、受体等功能性生物分子，因此载体是否能够携带药物进入细胞内并有效释放，是实现细胞内给药的关键。据目前的研究报道，纳米尺寸的聚合物粒子可通过内吞途径被肿瘤细胞摄取，最终进入后期内体/溶酶体，并释放药物。但是肿瘤细胞内存在多种清除细胞内药物的机制，当载体内药物释放缓慢，胞内药物很难达到有效浓度；反之，只有药物快速释放到细胞质溶质中并超过有效药物浓度，才能有效诱导肿瘤细胞凋亡。因此，只有通过胞内快速释药，才有可能达到逆转肿瘤耐药性的目的。
[0004]聚合物胶囊是一种具有聚合物壁壳的微型容器，能够包封和保护其囊心内的物质，具有较好的结构稳定性，已广泛用于药物载体的应用研究中。通过LBL技术构建的聚合物微胶囊壁多为聚电解质复合膜，囊壁的渗透性受微环境内PH值、离子强度等的影响，因此通过改变pH、离子强度等来增强或减弱聚电解质之间的静电相互作用，可以调节微胶囊壁的渗透性，并以达到药物控制释放的目的。但是，这些调节手段对囊壁的渗透性调节有限，是快速释药物的障碍。因此，不少学者将功能型纳米粒子(如磁性纳米粒子、金纳米粒子等)或光敏聚合物引入聚合物囊壁，借助外界磁场或光作用破坏囊壁结构，使得药物快速释放。而这种通过外场刺激调控聚合物微胶囊释药技术对深层组织作用十分有限，且很难精准到细胞尺寸，因此很难通过该类方法实现微胶囊在细胞内快速释药。
(三)
【发明内容】
[0005]利用正常组织与肿瘤组织以及溶酶体环境之间的pH差异，近年来发展的pH触发的可脱卸聚乙烯醇(PEG)保护层的设计尽管在一定程度上改善了载体体内循环时间和肿瘤部位的有效聚集问题，但忽视了载体在细胞内运转过程和有效释药的问题，基于此，本发明提供一种能有效克服上述问题的肿瘤细胞靶向的纳米载药体系及构建方法。
[0006]本发明采用的技术方案是:[0007]本发明提供一种肿瘤细胞靶向载药微胶囊，所述微胶囊以待载药物纳米颗粒(SP将待载药物通过强力超声破碎后获得的待载药物纳米颗粒)为囊芯，以聚乙烯亚胺(PEI)和β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺(PAH-Cit)交替包裹囊芯形成壳体，在壳体外包覆含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺(KL-PEI)作为最外层，并在最外层表面键合聚乙烯醇(PEG)链段。
[0008]进一步，所述待载药物纳米颗粒与PE1、PAH-Cit和KL-PEI质量比为1:0.05~0.1:0.05~0.1:0.01，所述PEG链段是KL-PEI与聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)通过化学偶联修饰实现的(示意图如图3所示)，所述最外层的KL-PEI中有5~20% 的 KL-PEI 键合有 mPEG-SPA。
[0009]进一步,所述待载药物纳米颗粒的粒径为80~150nm,优选所述待载药物为姜黄素或紫杉醇。
[0010]本发明肿瘤细胞靶向载药微胶囊按如下方法制备:(I)将待载药物颗粒溶于体积浓度40~60%有机溶剂水溶液中，在1000W、25°C的超声分散条件下滴加I~4mg/mL聚乙烯亚胺水溶液，超声分散30~300min，获得待载药物纳米粒子胶体溶液；所述有机溶剂水溶液中有机溶剂为无水乙醇或无水丙酮；所述有机溶剂水溶液的体积用量以待载药物的质量计为1000~4000mL/g，所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为I~5:1 (优选 2 ~4:1)；
[0011](2)向步骤(1)获得的待载药物纳米粒子胶体溶液中加入质量浓度0.05~0.1%(优选0.05%)的β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5~IOmin后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，获得沉淀a ;所述β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液中β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺与待载药物质量计为0.1 ~1:1 (优选 0.5:1)；
[0012](3)在步骤(2)获得的沉淀a中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%)的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5~IOmin后磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，获得沉淀b ;所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.1~1:1(优选 0.5:1)；
[0013](4)向步骤(3)获得的沉淀b中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%) β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，重复步骤(2)和步骤(3)操作2~10次，获得沉淀c ;每次β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺或聚乙烯亚胺的加入量同步骤(2)和步骤(3);
[0014](5)将步骤(4)最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%)的KL-PEI水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5~IOmin后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗漆，离心去除洗漆液后加入0.1~0.5mg/mL (优选0.lmg/mL)聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)，室温(25°C)搅拌反应I~5h (优选2h)，反应液经离心、超纯水洗涤、冷冻干燥，获得所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊；所述含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺水溶液中含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.03~0.2:1(优选0.1~0.2:1)，所述聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液中聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯与待载药物的质量比为0.006~1:1 (优选0.05~1:1)。
[0015]进一步，所述步骤(1)聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物质量比为2~4:1。
[0016]进一步，所述步骤(1)超声分散100~300min(更优选200~300min)，步骤(2)~步骤(4)超声分散每次各5min。
[0017]进一步,所述步骤(1)中聚乙烯亚胺水溶液滴加速度为0.01~0.2mL/min,优选0.05 ~0.1mT,/mi η η
[0018]进一步，步骤(5)所述冷冻干燥的条件为-30~-70°C冷冻干燥8~12h (更优选-50°C冷冻干燥8h)。
[0019]更进一步，所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊推荐按如下方法制备:(1)将待载药物溶于体积浓度40~60%有机溶剂水溶液中，在1000W、25°C超声分散条件下以0.05~0.lmL/min的速度滴加I~4mg/mL聚乙烯亚胺水溶液,超声分散200~300min,获得待载药物纳米粒子胶体溶液；所述有机溶剂水溶液中有机溶剂为无水乙醇或无水丙酮；所述有机溶剂水溶液的体积用量以待载药物质量计为1000~4000mL/g(优选1000~2000mL/g)，所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为2~4:1 ;
[0020](2)向步骤(1)获得的胶体溶液中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%)的β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，在200rpm/min下磁力搅拌IOmin后12000rpm/min离心10min、超纯水洗漆，离心去除洗涤液，获得沉淀a，即PEI/PAH-Cit包覆的药物胶体粒子；所述β _羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液中β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺与待载药物的质量比为0.25~0.5:1 (优选 0.5:1)；
[0021](3)在步骤(2)获得的沉淀a中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%)的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min,再在200rpm/min下磁力搅拌IOmin后12000rpm/min离心10min、超纯水洗涤，离心去除洗涤液，获得沉淀b，即PEI/PAH-Cit/PEI包覆的药物胶体粒子；所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.25 ~0.5:1 (优选 0.5:1)；
[0022](4)向步骤(3)获得的沉淀b中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%) β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，重复步骤(2)和步骤(3)操作2~10次，获得沉淀C，即(PEI/ΡΑΗ-Cit) 2_10包覆的药物胶体粒子；
[0023](5)将步骤(4)最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.05~0.1% (优选0.05%)的KL-PEI水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，离心去除洗涤液后加入0.1~0.5mg/mL的mPEG-SPA水溶液(优选0.lmg/mL的mPEG-SPA水溶液)，室温(25°C )搅拌反应I~5h (优选2h)，反应液离心，沉淀超纯水洗涤后-40°C冷冻干燥8h，获得所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊；所述KL-PEI水溶液中KL-PEI与待载药物的质量比为0.1~0.2:1，所述mPEG-SPA水溶液中mPEG-SPA与待载药物的质量比为0.05~1:1。
[0024]本发明首先将待载药物颗粒溶于有机溶剂中，再加入PEI水溶液进行超声分散(PEI可起到稳定药物颗粒的作用，并通过静电相互作用在待载药物颗粒表面包覆一层PEI，超声分散可以使待载药物颗粒破碎至粒径为80~150nm);然后加入ΡΑΗ-cit水溶液超声分散，在PEI表面包覆一层PAH-cit，紧接着交替加入PEI和PAH-cit，形成待载药物表面包覆多层PEI/PAH-cit的微胶囊；最后加入KL-PEI，超声分散，在微胶囊的最外层包覆一层KL-PEI，再加入mPEG-SPA通过化学偶联反应将PEG链段键合到KL-PEI上，最终制备得到所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊。该载药胶囊具有如下功能:囊壁的最外层由PEG修饰的KL-PEI构成，使得胶囊表面带有正电荷，与带负电性的磷脂双分子结构的细胞膜有较强的相互作用的同时还具有“质子海绵效应”(proton-sponge effect),能使溶酶体破裂,有助于载药微胶囊能在短时间内在细胞质基质中释放足够剂量药物分子；PEG链段通过酸不稳定基团同KL-PEI结合，使得载体在血液循环时，PEG “屏蔽”载体与正常组织和细胞的相互作用，从而逃避RES的捕获；当其达到肿瘤组织后，在弱酸性(pH为6.8)微环境内，PEG脱落并使得纳米微胶囊获得与肿瘤细胞相互作用的能力；可电荷翻转的PAH-Cit在溶酶体酸性环境中发生电荷翻 转，有效改变胶囊的渗透性，实现药物快速释放，从而有效地诱导癌细胞凋亡。
[0025]本发明所述PEI分子量为2000~100000，所述PAH-Cit分子量为2000~100000，所述KL-PEI分子量为2000~100000。
[0026]本发明所述超纯水是指电阻率大于18ΜΩ.cm的水。本发明制备得到的肿瘤细胞革巴向载药微胶囊粒径100~200nm。
[0027]本发明所述沉淀a、沉淀b、沉淀C、沉淀d均为沉淀，为了便于区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，字母本身没有含义。
[0028]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:
[0029]本发明在纳米给药系统的构建方面，综合考虑药物负载率，载体靶向性以及药物控释性，充分利用正常组织和肿瘤组织/溶酶体之间的PH差异，选取具有质子海绵效应的阳离子聚合物PEI和具有电荷翻转功能的阴离子聚合物PAH-Cit，构筑具有在肿瘤部位酸性条件下可脱卸PEG保护层的并可在细胞内可控快速释药的智能型载药纳米微胶囊，以达到克服肿瘤的耐药性，提高抗癌药物的药效并减小其毒副作用的目的。特别是首次将具有电荷翻转功能聚合物用于细胞靶向释药的纳米微胶囊的构筑，实现药物在细胞内的可控释放。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是PAH-Cit在酸性条件下的自催化水解示意图。
[0031]图2是KL-PEI在酸性条件下自催化水解示意图。
[0032]图3是载药微胶囊表面修饰SPA-mPEG示意图。
[0033]图4是pH变化诱导的载药微胶囊被细胞摄取和药物释放过程示意图。
[0034]图5是层层自组装制备载药微胶囊示意图。[0035]图6是经超声破碎分散后的姜黄素纳米粒子的粒径分布图。
[0036]图7是姜黄素载药微胶囊的体外抗肿瘤活性示意图。
[0037]图8是姜黄素载药微胶囊在不同pH下的体外释放规律。
[0038]图9是pH6.8和pH7.4时姜黄素载药微胶囊被肿瘤细胞的摄取情况。
(五)【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0040]本发明实施例所用PEI分子量为5000，购自Sigma试剂公司；PAH_Cit分子量为 5000，按 Soft Materials, 2008，4:1688-1695 方法合成;KL_PEI 分子量为 5000，按Bioconjugate Chemistry, 2009,.20:488-499 方法合成；SPA_mPEG 分子量为 20000，购自北京凯正生物试剂公司。
[0041]实施例1:以姜黄素为例说明负载姜黄素的载药微胶囊的制备
[0042](I)姜黄素纳米胶体溶液的配置:
[0043]将IOmg姜黄素粉末(购自AXX0RA)溶于IOmL乙醇/水(60:40，v/v)中，在超声功率1000W、25°C (冰浴)条件下超声分散，并采用恒流泵以0.05mL/min的速度滴加浓度为2mg/mL的PEI水溶液10mL，获得表面包覆PEI的姜黄素纳米粒子分散液，表面包覆PEI的姜黄素纳米粒子经动态激光光散射测试其平均粒径为IlOnm(图6)，表面电荷由原始的-25mV变为20mV，可证实其表面包覆了聚合物PEI。
[0044](2)姜黄素载药微胶囊的制备
[0045]a、向步骤(1)获得的姜黄素纳米粒子分散液中加入质量浓度0.05%(w/w)的PAH-Cit水溶液(ΡΑΗ-Cit加入质量为5mg)，在1000W条件下超声分散5min，然后置于25°C恒温培养箱中，200rpm/min磁力搅拌lOmin, 12000rpm/min离心10min,弃除上清液,加入超纯水洗涤，12000rpm/min离心去除上清液，重复两次，获得沉淀a，即ΡΕΙ/ΡΑΗ-Cit包覆的姜黄素纳米粒子。
[0046]b、然后再向沉淀a中加入质量浓度0.05%(w/w)的PEI水溶液(PEI加入质量为5mg),在1000W条件下超声分散5min, 200rpm/min磁力揽拌IOmin后，12000rpm/min离心IOmin,弃除上清液,加入超纯水洗漆，12000rpm/min离心去除上清液,重复洗漆两次，获得沉淀b。
[0047]C、向沉淀b中加入质量浓度0.05%(w/w)的PAH-Cit水溶液(每次PAH-Cit加入的质量为5mg)，重复步骤a和步骤b操作3次，获得沉淀C，即得到(PEI/PAH_Cit)3层膜覆盖的载药微胶囊，最外层聚合物为PAH-Cit。
[0048]d、向最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.01%的KL-PEI水溶液(KL-PEI加入质量为lmg)，在1000W条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，200rpm/min磁力搅拌IOmin后，12000rpm/min离心10min,弃除上清液，加入超纯水洗漆，12000rpm/min离心去除上清液，获得沉淀d (即最外层聚合物为KL-PEI的载药微胶囊)，然后加入0.lmg/mL的聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液5mL，在25°C下反应2h，反应液经离心分离、沉淀超纯水洗涤后_50°C冷冻干燥8h，获得表面修饰PEG链段的肿瘤细胞靶向载药微胶囊8mg，经动态激光光散射测试其平均粒径120nm，载药率可达到88%。[0049]载药率可通过HPLC测定，色谱条件:Thermo Hypersil ODS C18柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m),流速为1.0mL/min,流动相为乙腈/0.1%(v/v)磷酸水溶液(50:50，v/v)，检测波长 423nm,进样量 20 μ L，柱温 30 °C。
[0050]载药率:LC%=(投入的总药量-上清液中未被包埋的总药量)/投入的总药量[0051 ] 其中上清液中未被包埋的总药量是指每次离心弃除的上清液中药量之和。
[0052]实施例2:以紫杉醇为例说明负载紫杉醇的载药微胶囊的制备
[0053](1)紫杉醇纳米药物胶体溶液的配置:
[0054]将5mg紫杉醇(购自北京新泽科技公司)溶于IOmL丙酮/水(50:50，v/v)中，在25 0C UOOOff条件下超声分散，然后采用恒流泵控制以0.1 OmL/min的速度滴加浓度为2mg/mL的PEI水溶液1OmL,超声分散2h，滴加完毕后获得表面包覆PEI的紫杉醇纳米粒子分散液。平均粒径lOOnm。
[0055](2)紫杉醇载药纳米微胶囊的制备
[0056]a、在步骤(1)紫杉醇纳米粒子分散液中加入质量浓度0.05%(w/w)的PAH-Cit水溶液(加入的PAH-Cit的质量为2.5mg)，在1000W、25°C条件下超声5min，然后置于25°C恒温培养箱中，200rpm/min磁力搅拌IOmin后，12000rpm/min离心10min,弃除上清液,加入超纯水洗漆，12000rpm/min离心去除上清液,重复洗漆两次，获得沉淀a。
[0057]b、然后再在沉淀a中加入质量浓度0.05%(w/w)的PEI水溶液(加入的PEI质量为
2.5mg), 100(Μ、25.?条件下超声分散5min, 200rpm/min磁力搅拌IOmin后，弃除上清液，加入超纯水洗漆，12000rpm/min离心去除上清液,重复洗漆两次，获得沉淀b。
[0058]C、向沉淀b中加入质量浓度0.05%(w/w) PAH-Cit水溶液(每次加入的PAH-Cit质量为2.5mg),重复步骤a和步骤b操作3次，获得沉淀C，即得到包覆3层PEI/PAH-Cit的载药胶囊。
[0059]d、向最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.01%的KL-PEI水溶液(加入的KL-PEI质量为lmg)，在1000W、25°C条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，200rpm/min磁力搅拌IOmin后，12000rpm/min离心10min,弃除上清液，加入超纯水洗漆，12000rpm/min离心去除上清液，获得沉淀d，即最外层聚合物为KL-PEI的载药微胶囊。然后向沉淀d中加入0.lmg/mL的聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液(加入的聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯的质量为5mg)，在25°C下反应2h，反应液经离心分离、沉淀超纯水洗涤后_50°C冷冻干燥8h，获得表面修饰PEG链段的肿瘤细胞靶向载药微胶囊8mg，载药率可达到85%。
[0060]载药率可通过HPLC测定，色谱条件:Thermo Hypersil ODS C18柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m),流速为 1.0mL/min,流动相为甲醇 / 水 / 乙腈(20:30:50, v/v)，检测波长228nm，进样量20 μ L，柱温35 °C。
[0061]载药率:LC%=(投入的总药量-上清液中未被包埋的总药量)/投入的总药量
[0062]实施例3:负载姜黄素的载药微胶囊的体外细胞毒性(MTT)
[0063]采用MTT法测试药物的体外毒性，具体如下:
[0064]将用0.25%的胰酶消化培养的贴壁细胞SK0V-3 (购自ATCC细胞库)用RPMI1640培养基(含10%小牛血清，1%青霉素/链霉素)稀释,配制成一定浓度的细胞悬液,然后接种于96孔板中，细胞密度为5 X IO3/孔，每孔100yL，37°C培养过夜。
[0065]将96孔板分成2组，组I为载药微胶囊组，组2为姜黄素裸药组(既没有经过任何修饰的姜黄素原药)。将实施例1方法制备的载药微胶囊(微胶囊用量以微胶囊中所载姜黄素质量计)和姜黄素裸药分别加入孔板，加样终浓度分别为0.005 μ g/mL、0.05 μ g/mL、0.5 μ g/mL、2.5 μ g/mL、5 μ g/mL、12.5 μ g/mL>25 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL,并继续培养48h。IlOOrpm离心5min去除培养液，用无菌PBS缓冲液(pH值为7.4)洗孔板，重复洗板三次后每孔加入新鲜不含药物的RPMI1640培养液继续培养24h，每孔加入无菌MTT溶液(5mg/mL，购自上海榕柏生物技术公司)，继续培养4h，3000rpm离心8min后弃去含有MTT的培养液，用100 μ L/孔DMSO重新溶解紫色结晶，振荡IOmin后使用酶标仪于562nm和620nm下读取其OD值。同样条件下以不加药物的空白组作为对照。
[0066]IC50即50%抑制浓度，是抑制半数癌细胞生长时的药物浓度，IC5tl越低，说明细胞毒性越大。最后，按以下公式计算细胞存活率，并绘制细胞存活率曲线图，见图6所示。具体计算公式如下:
[0067]细胞存活率(%)=(试验组OD值/空白对照组OD值)X 100%
[0068]同样条件下用MCF-7/ADR (购自ATCC细胞库)代替细胞SK0V-3。
[0069]该负载姜黄素的载药微胶囊对SK0V-3、MCF-7/ADR的IC5tl分别为3.7 μ g/mL和
5.4 μ g/mL,细胞毒性均高于姜黄素裸药7.8 μ g/mL。
[0070]实施例4:负载姜黄素的载药微胶囊的体外释放规律
[0071]分别精密量取实施例1方法制备的2.0mL姜黄素载药微胶囊3份，然后分别放入纤维素透析袋(截留分子量2KD)，夹紧后分别浸入500mL的pH值为5.0、6.8以及7.4的PBS缓冲溶液中，温度为37°C，磁力搅拌速度为100r/min。在设定的时间点(5min、lOmin、30min、lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、15h、20h)取样 ImL,同时加入 ImL 的新鲜缓冲溶液进行补充，保持溶液总体积不变。取出的样品溶液经0.45 μ m的微孔滤膜(醋酸纤维素酯膜)过滤后，采用高效液相色谱检测姜黄素的含量(色谱条件同实施例1)，计算出姜黄素的累积释放率。不同PH下的姜黄素载药微胶囊药物累积释放曲线如图7所示。
[0072]累积释放率(%)=(某时刻释放的药物量/胶囊负载的药物总量)X 100%
[0073]结果表明载药微胶囊释放速率随着pH的降低而增加，且在pH5.0时药物的释放量最高。说明本发明制备的载药微胶囊药物可实现在溶酶体内快速释放，而在生理环境下(pH7.4)缓慢释放,具有细胞祀向可控释放功能。
[0074]实施例5:负载姜黄素的载药微胶囊被细胞摄取情况
[0075]姜黄素能在受激发后自发荧光，因此可采用倒置荧光显微镜直接观察载药微胶囊在耐药肿瘤细胞MCF-7/ADR中的摄取情况，具体实验流程如下:将培养瓶中生长良好的MCF-7/ADR细胞经胰酶消化并计数后用RPMI1640培养基配制成1.5mL细胞悬浮液接种于打孔皿中，密度为IOX IO4/孔。将打孔皿放置于37°C培养箱中培养24h使得细胞完全贴壁生长，然后将原培养基弃掉加入经新鲜培养基稀释100倍的实施例1获得的载药微胶囊，370C下药物作用2h后，将药物溶液弃掉并用4°C预冷的PBS (pH7.4和pH6.8)分别洗涤细胞三次除去游离的载药微胶囊，然后上机观察，实验结果如图8所示，从图中可以看出，pH6.8时载药微胶囊更易被细胞摄取。
【权利要求】
1.一种肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述微胶囊以待载药物纳米颗粒为囊芯，以聚乙烯亚胺和β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺交替包裹囊芯形成壳体，在壳体外包覆含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺作为最外层，并在最外层表面键合聚乙烯醇链段。
2.如权利要求1所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述待载药物纳米颗粒的粒径为80~150nm。
3.如权利要求1所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述待载药物为姜黄素或紫杉醇。
4.如权利要求1所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述微胶囊按如下方法制备:(I)将待载药物颗粒溶于体积浓度40~60%有机溶剂水溶液中，在1000W、25°C的超声分散条件下滴加I~4mg/mL聚乙烯亚胺水溶液,超声分散30~300min,获得待载药物纳米粒子胶体溶液；所述有机溶剂水溶液中有机溶剂为无水乙醇或无水丙酮；所述有机溶剂水溶液的体积用量以待载药物质量计为1000~4000mL/g，所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物质量比为I~5:1 ; (2)向步骤(1)获得的待载药物纳米粒子胶体溶液中加入质量浓度0.05~0.1%的β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，在1000W、25°C的条件下超声分散5~IOmin后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，获得沉淀a ;所述β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液中β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺与待载药物质量比为0.1~1:1 ; (3)在步骤(2)获得的沉淀a中加入质量浓度0.05~0.1%的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C的条件下超声分散5~IOmin后磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，获得沉淀b ；所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.1~1:1 ; (4)向步骤(3)获得的沉淀b中加入质量浓度0.05~0.1%β -羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，重复步骤(2)和步骤(3)操作2~10次，获得沉淀c ； (5)将步骤(4)最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.05~0.1%的含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5~IOmin后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，离心去除洗涤液后加入0.1~0.5mg/mL的聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液，室温搅拌反应I~5h，反应液经离心、超纯水洗涤、冷冻干燥，获得所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊；所述含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺水溶液中含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.03~0.2:1，所述聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液中聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯与待载药物的质量比为0.006~1:1。
5.如权利要求4所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述步骤(1)所述的聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为2~4:1。
6.如权利要求4所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述步骤(1)超声分散100~300min，步骤(2)~步骤(4)超声分散每次各5min。
7.如权利要求4所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述步骤(1)中聚乙烯亚胺水溶液滴加速度为0.01~0.2mL/min。
8.如权利要求4所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于步骤(5)所述冷冻干燥的条件为-30~-50°C冷冻干燥8~12h。
9.如权利要求4所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊，其特征在于所述微胶囊按如下方法制备:(I)将待载药物溶于体积浓度40~60%有机溶剂水溶液中，在1000W、25°C超声分散条件下以0.05~0.2mL/min的速度滴加I~4mg/mL聚乙烯亚胺水溶液,超声分散200~300min,获得待载药物纳米粒子胶体溶液；所述有机溶剂水溶液中有机溶剂为无水乙醇或无水丙酮；所述有机溶剂水溶液的体积用量以待载药物质量计为1000~4000mL/g，所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为2~4:1 ; (2)向步骤(1)获得的胶体溶液中加入质量浓度0.05~0.1%的β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，在200rpm/min下磁力搅拌IOmin后12000rpm/min离心10min、超纯水洗漆,离心去除洗漆液，获得沉淀a;所述β-羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液中羧酸酰胺化的聚烯丙基胺与待载药物质量比为0.25~0.5:1 ; (3)在步骤(2)获得的沉淀a中加入质量浓度0.05~0.1%的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min,再在200rpm/min下磁力揽拌IOmin后12000rpm/min离心lOmin、超纯水洗涤，离心去除洗涤液，获得沉淀b ;所述聚乙烯亚胺水溶液中聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.25~0.5:1 ; (4)向步骤(3)获得的沉淀b中加入质量浓度0.05~0.1%β_羧酸酰胺化的聚烯丙基胺水溶液，重复步骤(2)和步骤(3)操作2~10次，获得沉淀c ； (5)将步骤(4)最终获得的沉淀c中加入质量浓度0.05~0.1%的含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺水溶液，在1000W、25°C条件下超声分散5min后置于25°C恒温培养箱中，磁力搅拌充分后离心、超纯水洗涤，离心去除洗涤液后加入0.05~0.lmg/mL聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液，室温搅拌反应I~5h，反应液离心，沉淀超纯水洗涤后-40°C冷冻干燥8h，获得所述肿瘤细胞靶向载药微胶囊；所述含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺水溶液中含有缩酮侧链的聚乙烯亚胺与待载药物的质量比为0.1~0.2:1，所述聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯水溶液体中聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺丙酸酯与待载药物的质量比为0.05~1:1o
【文档编号】A61K31/12GK103933014SQ201310755526
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】梁媛媛, 郭卫强, 章鹏飞, 焦艳华, 俞春娜, 陈灿玉 申请人:杭州师范大学