猪肺炎支原体疫苗的制作方法

猪肺炎支原体疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供免疫原性组合物，其包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分，其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
【专利说明】猪肺炎支原体疫苗 发明领域
[0001] 本发明涉及猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae(M.hyopneumoniae或 M.hyo))。更具体地，本发明涉及M.hyo全细胞制备物的可溶性部分以及它在用于保护猪抵 抗地方性动物病肺炎的疫苗中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 猪中的地方性动物病肺炎，也被称为支原体肺炎，是由M.hyo引起的。该疾病是一 种慢性的、非致命性的疾病，影响各种年龄的猪。受感染的猪仅仅表现出咳嗽和发烧的轻微 症状，但是这种疾病对经济有重要的影响，因为饲料转化效率降低并且体重增长减少。地方 性动物病肺炎由受感染猪的肺排出的空气传播微生物通过鼻道在猪之间传播。M.hyo的初 次感染可能跟随着其它支原体物种（猪鼻支原体（Mycoplasmahyorhinis)和絮状支原体 (MycoplasmafIocculare))以及其它细菌病原体的继发感染。
[0004] M.hyo是小的原核微生物，能够自由生活地存在，虽然它经常被发现与真核细胞相 联系，因为它对外源留醇和脂肪酸有绝对需求。这些需求通常需要在含血清的培养基中生 长。M.hyo由细胞膜而不是细胞壁包被。
[0005] 支原体和宿主细胞表面的物理结合是地方性动物病肺炎发生和持续存在的基础。 M.hyo感染猪的呼吸道，在气管、支气管、细支气管建群。支原体产生纤毛停滞因子，其导致 呼吸道内侧的纤毛停止运动。最终纤毛退化，使猪易于受到次级病原体的感染。在感染动 物中观察到紫色到灰色的实变区域的典型病灶。对屠宰动物的调查揭示在30-80%的猪中 存在病灶。来自13个州的37个畜群的结果表明99%的畜群有符合地方性动物病肺炎典型 特征的肺炎病灶。因此，对有效预防和治疗措施的需求很大。
[0006] 抗生素如硫姆林、甲氧苄氨嘧啶、四环素和林可霉素有一些益处，但是价格昂贵并 且需要长期使用。此外，抗生素尚未被证明有效消除M.hyo的传播或二次感染。通过维持无 病原体畜群来预防有时是可行的，但是经常发生M.hyo的再次引入。由于猪肺炎的严重的 经济后果，已经在寻找针对M.hyo的疫苗。含有在含血清培养基中生长的支原体生物体制 备物的疫苗已进入市场，但是引起了对于免疫物质中存在的血清组分（例如免疫复合物或 非免疫原性特异性蛋白）诱导的副反应的关注。提供M.hyo疫苗的其它尝试已有成功者， 但是这种疾病仍然广泛流行。
[0007] Ehyo和猪圆环病毒2型（PCV2)是猪产业中遇到的两种最为普遍的病原体。被 PCV2感染的猪表现出通常被称为断奶后多系统衰竭综合征（PMWS)的综合征。PMWS的临 床特征是衰弱、皮肤苍白、瘦弱、呼吸窘迫、腹泻、黄疸（icterus)和黄疸（jaundice)。除了 PMWS之外，PCV2与几种其它的感染相关，包括假狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)、格雷 舍氏病（Glasser'sdisease)、链球菌脑膜炎、沙门氏菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食肝病和 化脓性支气管肺炎。M.hyo与地方性动物病肺炎相关，而且已被显示是猪圆环病毒相关疾病 (PCVAD)的发生中的主要辅因子。
[0008] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)由动脉炎病毒引起，该病毒与巨噬细胞，特别是存在 于肺中的巨噬细胞（肺泡巨噬细胞）有特别的亲和力。这些巨噬细胞摄取并除去入侵的细 菌和病毒，但在PRRS病毒的情况中并非如此。在PRRS病毒的情况中，它在巨噬细胞内部繁 殖，产生更多的病毒并杀死巨噬细胞。一旦PRRSV进入畜群，它便会无限期地存在并有活 性。高达40%的巨噬细胞被破坏，这使得细菌和其它病毒增殖并进行破坏。这种事件的一 个常见的实例是在幼年/老年团体（grower/finisherunits)中，当它们受到PRRS病毒感 染时，地方性动物病肺炎的严重程度显著增加。超过一半的断奶期PRRS病毒阴性的猪在进 入市场之前被感染。
[0009] 所需要的是针对猪支原体感染的改进的疫苗。优选地，M.hyo疫苗将与其它猪抗 原（如PCV2和PRRS病毒）相容，不论它们是作为单独的单次疫苗同时给予还是以即用型 疫苗的形式组合给予。提供即用型、单次剂量（single-dose)的M.hyo/PCV2组合疫苗将会 是非常合乎需要的。
[0010] 发明简述
[0011] 本发明提供免疫原性组合物，其包含猪肺炎支原体（M.hyo)全细胞制备物的可溶 性部分，其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白 结合形成的免疫复合物。在一个方面，M.hyo全细胞制备物的可溶性部分在被加入到免疫 原性组合物之前已用蛋白-A或蛋白-G进行处理。
[0012] 在一个实施方案中，M.hyo制备物的可溶性部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。在 另一个实施方案中，M.hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种M.hyo蛋白抗原。
[0013] 在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含至少一种其它抗原。在 一个实施方案中，至少一种其它抗原针对在猪中可能引起疾病的微生物提供保护。
[0014] 在一个实施方案中，微生物包括细菌、病毒或原生动物。在另一个实施方案中，微 生物选自但不限于下列种类：猪圆环病毒2型（PCV2)、猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV)、 猪细小病毒（PPV)、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis)、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida)、猪链球菌（Streptococcumsuis)、猪葡萄球菌（Staphylococcushyicus)、胸 膜肺炎放线杆菌（Actinobacillluspleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌（Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌 (Salmonellaenteritidis)、猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、猪鼻 支原体（Mycoplamahyorhinis)、猪滑液支原体（Mycoplasmahyosynoviae)、钩端螺旋体 细菌、胞内劳森氏菌（Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒（SIV)、大肠杆菌抗原、猪 痢疾短螺旋体（Brachyspirahyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻（PED) 病毒、轮状病毒、细环病毒（TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病 (Aujesky'sDisease)、典型性猪瘟（CSF)的致病原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。
[0015] 在特定的实施方案中，至少一种其它抗原是猪圆环病毒2型（PCV2)抗原，PRRS病 毒抗原或其组合。在一个实施方案中，组合物在猪中引发针对M.hyo和PCV2二者的保护性 免疫反应。在另一个实施方案中，组合物在猪中引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护 性免疫反应。
[0016] 在一个实施方案中，PCV2抗原是嵌合1型-2型圆环病毒的形式，嵌合病毒包含灭 活的表达猪圆环病毒2型0RF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。在另一个实施方案中，PCV2抗 原是重组0RF2蛋白的形式。在又一个实施方案中，重组0RF2蛋白从杆状病毒载体表达。
[0017] 在一些实施方案中，本发明的组合物进一步包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂选 自，但不限于下列种类：水包油佐剂，聚合物和水佐剂，油包水佐剂，氢氧化铝佐剂，维生素E佐剂及其组合。在另一个实施方案中，本发明的组合物进一步包含药学可接受的载体。
[0018] 在特定的实施方案中，本发明的组合物当以单次剂量给药的形式进行给药时，弓丨 发针对Ehyo的保护性免疫反应。在进一步的实施方案中，组合物当以单次剂量给药的形 式进行给药时，引发针对M.hyo和至少一种能在猪中引起疾病的其它微生物的保护性免疫 反应。在其它实施方案中，本发明的组合物当以两次剂量给药的形式进行给药时，引发针对 M.hyo和至少一种能在猪中引起疾病的其它微生物的保护性免疫反应。
[0019] 本发明还提供免疫猪以抵抗M.hyo的方法。该方法包括给猪施用包含M.hyo全细 胞制备物的可溶部分的免疫原性组合物，其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含（i) IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。在一个实施方案中，给药组合物 的M.hyo制备物的可溶部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。
[0020] 在本发明方法的一个实施方案中，组合物被肌内，皮内，经皮或皮下给药。在本发 明方法的另一个实施方案中，组合物以单次剂量的形式给药。在本发明方法的又一个实施 方案中，组合物以两次剂量的形式给药。
[0021] 在本发明方法的又一个实施方案中，组合物与至少一种其它抗原共同给药，所述 至少一种其它抗原提供针对能在猪中引起疾病的微生物，例如上述的一种或多种微生物的 保护。这种其它抗原可以与M.hyo组合物同时给予（即作为单独的单次疫苗）或者组合制 成即用型疫苗的形式。
[0022] 在进一步的实施方案中，组合物被给药给具有来自母体的Ehyo抗体的猪。在又 一个实施方案中，组合物被给药给具有来自母体的针对M.hyo和至少一种能在猪中引起疾 病的其它微生物的抗体的猪。
[0023] 在一个实施方案中，组合物被给药给3周龄或更大的猪。
[0024] 本发明进一步提供试剂盒。该试剂盒含有包含免疫原性组合物的瓶。该免疫原性 组合物包含猪肺炎支原体（M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分，其中M.hyo制备物的可溶 性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。在一个实 施方案中，该试剂盒进一步包括含有免疫原性组合物给药信息的使用说明书。
[0025] 此外，本发明提供制备根据本发明的免疫原性组合物的方法。该方法包括i)在合 适的培养基中培养M.hyo18-144小时的时间；ii)随后灭活M.hyo培养物；iii)收获灭活 的培养液，其中灭活的培养液包含M.hyo全细胞制备物，所述全细胞制备物包含可溶性液 体级分和不可溶细胞物质；iv)从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分；以及V)从分离的 可溶性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。
[0026] 附图简述
[0027] 图1是显示用进行不同处理的M.hyo抗原制备的M.hyo单价疫苗（实施例3中描 述的T02-T10)相对于安慰剂（TOl)的效力的图。结果表示为％肺损伤最小平方平均值 LungLesionLeastSquareMeanvalues)〇
[0028] 图2是显示与灭活的PCVI型-2型嵌合病毒组合的M.hyo疫苗的PCV2抗原功效 结果（PCV2抗原ELISA)的图。组合物中包含的嵌合病毒的初始水平是大约1. 6彡RP。每 个样品的状态表示为相对功效（RP)。
[0029] 图3是显示用使用不同佐剂平台的PCV/M.hyo疫苗制剂观察到的PCV2病毒血症 结果（PCV2定量PCR)的图。
[0030] 图4是显示在攻毒第1、20和42天，用使用不同佐剂平台的PCV/M.hyo疫苗制剂 观察到的PCV2抗体ELISA(S/P)血清学结果的图。
[0031] 图5是显示实施例7中所述的T02-T04处理相对于安慰剂（TOl)获得的PCV2粪 便脱落的图。结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。
[0032] 图6是显示实施例7中所述的T02-T04处理相对于安慰剂（TOl)获得的PCV2鼻 脱落的图。结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。
[0033] 图7 (A&B)是显示测定PCV2-特异性细胞介导免疫（CMI)应答的干扰 素-Y(IFN-γ)检测结果的图。接种后/攻毒前的结果显示于图7A，接种后/攻毒后的结 果显示于图7B。5xIO6个细胞的刺激被认为是显著的。
[0034] 图8显示SP-油中的PCV2/M.hyo试验性疫苗制剂的M.hyo效力。使用M.hyo处 理T02-T08的制剂相对于安慰剂（TOl)的肺部评分以图解显示在图8A中。图8B中的表显 示了处理T02-T08与安慰剂的对比。
[0035] 图9是显示用于制备PCV2-相容的蛋白-A处理的M.hyo抗原的制造过程的一个 实施方案的流程图。
[0036] 图10是显示针对PRRS病毒的杀病毒活性的佐剂评价的表。
[0037] 序列简述
[0038] SEQIDNO: 1是编码来自M.hyo的P-5722株的p46的核苷酸序列的一个实施方 案；
[0039] SEQIDNO:2是来自Mhyo的P-5722株的p46的氨基酸序列的一个实施方案；
[0040] SEQIDNO:3是编码来自M.hyo的P-5722株的p97的核苷酸序列的一个实施方 案；
[0041] SEQIDNO:4是来自M.hyo的P-5722株的p97的氨基酸序列的一个实施方案；
[0042] SEQIDNO:5是编码嵌合PCV1-2病毒的基因组序列的一个实施方案；
[0043] SEQIDN0:6是相应于猪圆环病毒0RF2的核苷酸序列的一个实施方案；
[0044] SEQIDNO:7是相应于猪圆环病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案；
[0045] SEQIDN0:8是编码嵌合PCV1-2病毒的基因组序列的一个实施方案；
[0046] SEQIDN0:9是相应于猪圆环病毒0RF2的核苷酸序列的一个实施方案；
[0047] SEQIDNO: 10是相应于猪圆环病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案；
[0048] SEQIDNO: 11是相应于猪圆环病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案；
[0049] SEQIDNO: 12是编码SEQIDNO: 11的氨基酸序列的核苷酸序列的一个实施方案；
[0050] SEQIDNO: 13是相应于猪圆环病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案；
[0051] SEQIDNO: 14是编码SEQIDNO: 13的氨基酸序列的核苷酸序列的一个实施方案；
[0052] SEQIDNO: 15是相应于猪圆环病毒0RF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案；
[0053] SEQIDN0:16是被称为P129的北美PRRS病毒分离物的非-强毒性形式的基因组 序列的一个实施方案；以及
[0054] SEQIDNO: 17是相应于被称为ISU-55的PRRS病毒分离物的0RF2至0RF5的核苷 酸序列的一个实施方案。
[0055] SEQIDNO: 18是相应于被称为ISU-55的PRRS病毒分离物的0RF6和0RF7的核苷 酸序列的一个实施方案。
[0056] 发明详述
[0057] 本发明提供免疫原性组合物，其包含猪肺炎支原体（Ehyo)全细胞制备物的可溶 性部分，其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白 结合形成的免疫复合物。 申请人:令人惊讶地发现M.hyo全细胞培养物的不可溶级分是无免 疫原性的。相反，不含IgG的M.hyo可溶性制备物是有免疫原性的，并能有效与来自其它病 原体，如PCV2的抗原组合，而在抗原之间没有分析干扰或免疫干扰。这使得本发明的M.hyo 可溶性制备物成为多价疫苗，包括单瓶，即用型制剂的有效平台。 申请人:还令人惊讶地发现 除去免疫球蛋白和不可溶细胞碎片增强了免疫原性组合物的安全性。
[0058] 如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数引 用，除非上下文另外明确规定。例如，术语"一个蛋白抗原"包括多个蛋白抗原，包括其混合 物。
[0059] 如本文所使用的，术语"包含"是指组合物和方法包括所述及的要素，但不排除其 它要素。
[0060] 如本文所定义的，M.hyo全细胞培养物的可溶性部分指在分离了不可溶物质并基 本上去除了IgG和抗原结合的免疫复合物之后的M.hyo全细胞培养物的可溶性液体级分。 M.hyo可溶性部分在文本中还可以被称为上清级分，培养物上清等等。它包含已从不可溶 蛋白，全细菌和其它不可溶M.hyo细胞物质通过传统方法（如离心、过滤或沉淀）分离的 M.hyo-表达的可溶性蛋白（M.hyo蛋白抗原）。除了包含M.hyo-特异的可溶性蛋白，M.hyo 全细胞培养物的可溶性部分还包含异源蛋白，例如那些M.hyo发酵使用的培养基中含有的 异源蛋白。
[0061] 术语"抗原"指能在动物中刺激产生抗体或T-细胞应答或二者的化合物、组合物 或免疫原性物质，包括给动物注射或被动物吸收的组合物。免疫反应可以针对整个分子或 者针对分子的一部分（例如表位或半抗原）产生。
[0062] 如本文所定义的，"免疫原性或免疫组合物"，指包含至少一种抗原的组合物，所述 抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗发生细胞和/或抗体-介导的免疫应答而导致 的免疫反应。
[0063] 本文使用的术语"免疫反应"指在动物中引发的反应。免疫反应可以指细胞免疫 (CMI);体液免疫或者可以包括二者。本发明还考虑限于免疫系统一部分的反应。通常，"免 疫反应"包括，但不限于，下述效果的一种或多种：特异性针对感兴趣的组合物或疫苗中所 包含的一种或多种抗原的抗体，B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/ 或ydT细胞的产生或激活。优选地,宿主将会显示出治疗性或保护性免疫反应,从而增强 对新的感染的抗性和/或减轻疾病的临床严重程度。这种保护将通过受感染宿主通常表现 出的症状的减少或消失、更快的恢复时间和/或受感染宿主中更低的病毒滴度来证明。 [0064] 如本文所使用的，术语"免疫原性"指能够在宿主动物中产生针对一个或多个抗原 的免疫反应。这种免疫反应构成由疫苗引发的针对特定的感染性生物体的保护性免疫的基 础。
[0065] 本文使用的"佐剂"指包含一种或多种增强对抗原免疫反应的物质的组合物。佐 剂的作用机理还不完全清楚。认为一些佐剂通过缓慢释放抗原增强免疫反应，而其它佐剂 自身具有强的免疫原性，并被认为是通过协同作用发挥功能。
[0066] 如本文所使用的，术语"多价"指包含来自于同一个物种（即猪肺炎支原体的不同 分离物）或是来自不同的物种（即来自溶血性巴斯德菌（Pasteurellahemolytica)和多杀 巴斯德菌（Pasteurellamultocida)二者的分离物）的超过一种抗原的疫苗，或者包含来 自不同属的抗原的组合的疫苗（例如，包含来自多杀巴斯德菌（Pasteurellamultocida)、 沙门氏菌（Salmonella)、大肠杆菌（Escherichiacoli)、睡眠嗜血杆菌（Haemophilus somnus)和梭菌（Clostridium)的抗原的疫苗）。
[0067] 本文使用的术语"猪"或"小猪"指猪起源的动物，而"母猪"指处于生育年龄并具 有生育能力的雌性。"小母猪"指从未怀孕的雌性猪。
[0068] 本文所使用的术语"毒性的"指保留了其在动物宿主中感染能力的分离物。
[0069]"灭活疫苗"指包含不再能复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。病 原体的来源可以是细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可以通过多种方法实现，包括冻融、化 学处理（例如用硫柳汞或福尔马林处理）、超声、辐射、热或任何其它足以防止该生物体复 制或生长但保留其免疫原性的惯用方法。
[0070] 本文使用的术语"变体"指多肽或编码多肽的核酸序列，其具有一个或多个保守氨 基酸的变化或其它微小的修饰，以使得相应的多肽与野生型多肽相比具有基本上相同的功 能。
[0071]"保守变化"表示用另一个生物学相似的残基替换氨基酸残基，或者替换核酸序列 中的核苷酸以使得编码的氨基酸残基不变或者是另一个生物学相似的残基。保守变化的实 例包括将一个疏水性残基（如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸）取代为另一个疏水性 残基，或者一个极性残基的取代，例如精氨酸取代为赖氨酸，谷氨酸取代为天冬氨酸，或谷 氨酰胺取代为天冬酰胺，等等。术语"保守变化"还包括用取代的氨基酸代替未取代的亲本 氨基酸，条件是用取代的多肽激发的抗体也能与未取代的多肽发生免疫反应。
[0072] 本文所使用的术语"药学可接受的载体"和"药学可接受的媒介物"可以互换使用， 指可以被注射到宿主中且没有副作用的包含疫苗抗原的液体媒介物。本领域已知的合适的 药学可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲液。载体可以包括助 齐U，包括但不限于稀释剂、稳定剂（即糖和氨基酸）、防腐剂、湿润剂、乳化剂、PH缓冲剂、粘 度增强添加剂、染料等。
[0073] 本文所使用的术语"疫苗组合物"包括在药学可接受媒介物中的至少一种抗原或 免疫原，用于在宿主中诱导免疫反应。疫苗组合物可以剂量形式并通过医学或兽医领域技 术人员公知的技术给药，并考虑这些因素：年龄，性别，体重，物种和受体动物的条件，以及 给药方式。给药方式可以是经皮，经粘膜给药（例如口服，经鼻，经肛门，经阴道）或者通过 肠胃外方式（皮内，经皮，肌内，皮下，静脉内或腹膜内）。疫苗组合物可以单独给药，或者 可以与其它治疗或疗法共同给药或顺序给药。给药的形式可以包括混悬剂，糖浆剂或酏剂， 以及用于肠胃外，皮下，皮内，肌内或静脉内给药（例如注射给药）的制备物，如无菌混悬液 或乳液。疫苗组合物可以作为喷雾或混合在食物和/或水中给药，或者与合适的载体、稀 释剂、或赋形剂（如无菌水、生理盐水、葡萄糖等）混合给药。组合物可以包含辅助性物质 (例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝及或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、染料 等），这取决于给药方式和所希望的制备物。可以参考标准的药学文献，例如"Remington's PharmaceuticalSciences, 〃1990制备合适的制备物，而无需过度的试验。
[0074] "北美PRRS病毒"指具有与北美PRRS病毒分离物相关的遗传特征的任何PRRS 病毒，例如，但不限于1990年代早期左右在美国首次分离的PRRS病毒（参见，例如， Collins,J.E.，etal.，1992,J.Vet.Diagn.Invest. 4:117-126);北美PRRS病毒分离 物MN-Ib(Kwang,J.etal.，1994,J.Vet.Diagn.Invest. 6:293-296);PRRS病毒的魁北克 LAF-exp91 株（Mardassi，H.etal·，1995,Arch.Virol. 140:1405-1418);和北美PRRS病毒 分离物VR2385 (Meng，X.-Jetal·，1994,J.Gen.Virol. 75:1795-1801)。北美PRRS病毒株 的其它实例在本文中描述。遗传特征指北美PRRS病毒株之间的基因组核苷酸序列相似性 和氨基酸序列相似性。中国PRRS病毒株通常与北美猪显示出大约80-93%的核苷酸序列相 似性。
[0075] "欧洲PRRS病毒"指具有与1991年左右在欧洲首次分离的PRRS病毒相关的遗传 特征的任何PRRS病毒株（参见，例如，Wensvoort,G.，etal·，1991，Vet.Q. 13:121-130)。 "欧洲PRRS病毒"在本领域中有时还指"莱利斯塔德病毒（Lelystadvirus)"。欧洲PRRS 病毒株的其它实例在本文中描述。
[0076] 如果基因修饰的病毒比未修饰的亲本株毒性较小，则它是"减毒的"。如果毒株 在确定疾病严重性的一个或多个参数上表现出统计学的显著降低，则该毒株为"毒性较小 的"。这种参数可以包括病毒血症的水平、发热、呼吸窘迫的严重性、繁殖症状的严重性或肺 损伤的数量或严重性等。
[0077] "感染性克隆"是病原体（例如病毒）的分离的或克隆的基因组，其能在实验室被 特定地和有目的地改造，然后用于再生产活体的基因修饰的生物体。从感染性克隆产生的 活体的基因修饰的生物体可以用在活体病毒疫苗中。或者，可以通过用灭活剂如福尔马林 或疏水溶剂，酸等，通过紫外线或X-射线辐射，通过加热等处理来自感染性克隆的活病毒 制备灭活的病毒疫苗。
[0078] 所有目前可获得的M.hyo疫苗都是用灭活的全细胞支原体制备物（菌苗）制造 的。相反，本发明使用猪肺炎支原体（M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分，其中M.hyo制备 物的可溶部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
[0079]Ehyo对于外源留醇和脂肪酸有绝对需求。这些需求通常需要在含血清的培养基， 例如猪血清中生长M.hyo。从M.hyo全细胞制备物的可溶性蛋白分离不可溶物质（例如通 过离心，过滤或沉淀）并不会去除猪IgG或免疫复合物。在本发明的一个实施方案中，用蛋 白-A或蛋白-G处理M.hyo可溶性部分以基本上除去培养物上清中包含的IgG和免疫复合 物。在该实施方案中，应当理解蛋白A处理发生在M.hyo发酵之后。在本文中这也可以被称 为下游蛋白A处理。在另一个实施方案中，可以使用对生长培养基的上游蛋白A处理（即 在M.hyo发酵之前）。蛋白A与IgG的Fc部分结合。蛋白G优先与IgG的Fc部分结合，但 是也可以和Fab区域结合。从粗蛋白混合物，如组织培养物上清，血清和腹水中纯化/除去 总IgG的方法是本领域已知的。
[0080] 在一些实施方案中，M.hyo制备物的可溶性部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。在 其它实施方案中，M.hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种M.hyo蛋白抗原。
[0081] 在一个实施方案中，M.hyo上清级分包含一种或多种下述M.hyo特异性蛋白抗原： 大约46kD(p46)、64kD(p64)和97kD(p97)分子量的M.hyo蛋白。在另一个实施方案中，上清 级分至少包含p46、p64和p97M.hyo蛋白抗原。本文中大约64kD的M.hyo蛋白（p64)也可 以被称为M.hyo的p65 表面抗原，由Kimetal. [Infect.Immun. 58 (8) : 2637-2643 (1990)] 和美国专利No. 5, 788, 962描述。
[0082]Futoetal.描述了M.hyo的46kD表面蛋白的克隆和表征，其可以用在本发明 的组合物中[J.Bact177:1915-1917(1995)]。在一个实施方案中，Ehyo培养物上清包含 P46,它的来自P-5722株的相应的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDN0:1和2所示。进 一步考虑的是，这种p46的变体可以用在本发明的组合物中，如下文所述。
[0083]Zhangetal.描述了M.hyo的p97粘附素蛋白的表征[11^01:· Immun. 63:1013-1019, 1995]。此夕卜，Kingetal?描述 了来自Ehyo的P-5722 株 的被称为Mhpl的124kD蛋白，并给出数据表明Mhpl和p97是同一个蛋白[Vaccine 15:25-35 (1997)]。这种p97蛋白可以用在本发明的组合物中。在一个实施方案中，M.hyo培 养物上清包括P97,它的来自P-5722株的相应的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDN0:3 和4所示。进一步考虑的是，这种p97的变体可以用在本发明的组合物中，如下文所述。
[0084]M.hyo培养物上清可以进一步包含M.hyo的特定蛋白抗原，例如但不限于大约 411^)&41)、421^)&42)、891^)&89)和651^)(口65)的蛋白。参见，01?1(1&6七31.，2000，1￥6七· MedB47:527-533和Kimetal·，1990,Infect.Immun. 58(8) :2637-2643。此外，Ehyo培养 物上清可以包含大约102kD(pl02)和216kD(p216)的M.hyo的特定蛋白抗原。参见Minnion etal的美国专利Nos. 6, 162, 435 和 7, 419, 806。
[0085] 可以使用任何M.hyo株作为起始材料产生本发明的M.hyo制备物的可溶性部分。 合适的M.hyo株可以从商业来源或学术来源获得，包括保藏机构如美国典型培养物保藏中 心（ATCC) (Manassas,Va.)和NRRL培养物保藏中心（AgriculturalResearchService,U. S.DepartmentofAgriculture，Peoria，Ill·)。ATCC单独列出了下面六个M.hyo株用于 出售：Μ·hyoATCC25095，M.hyoATCC25617，M.hyoATCC25934，M.hyoATCC27714，Μ· hyoATCC27715和M.hyoATCC25934D。用于本发明实施方案的优选的M.hyo株被认为是 P-5722-3株，ATCC#55052, 1990年5月30日按照美国专利商标局的要求的可获得性规则进 行了保藏。考虑到疾病的广泛传播，还可以通过从受到在猪中引起支原体肺炎的已知株感 染的猪的肺分泌物或组织回收M.hyo获得毒株。
[0086] 本领域技术人员应当理解M.hyo序列的变体可以被用在本发明的组合物中。这种 变体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化，且仍然保留使其能够用在免疫组合物中 的抗原特性。优选地，M.hyo变体与野生型M.hyo株的全长基因组序列具有至少80%、优选 至少85 %、更优选至少90 %、更优选至少95 %的序列同一性。免疫组合物的抗原特性可以， 例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且，当修饰的抗原提供与野生型M.hyo蛋 白相比至少70 %、优选80 %、更优选90 %的保护性免疫时，则修饰的M.hyo抗原的抗原特性 仍然保留。
[0087] 在一个实施方案中，M.hyo可溶性p46抗原被包含在本发明的组合物中，其终浓度 为大约1. 5μg/ml至大约10μg/ml，优选为大约2μg/ml至大约6μg/ml。应当注意p46 是用于M.hyo功效检测的蛋白（参见下文的实施例部分）。在另一个实施方案中，M.hyo抗 原可以以最终量为M.hyo全细胞培养物蛋白A处理的上清的大约5. 5%至大约35%的量被 包含在组合物中。
[0088] 本发明的M.hyo可溶性制备物是安全的并且对于M.hyo是有效的，且适合于单次 剂量给药。此外， 申请人:令人惊讶地发现M.hyo可溶性制备物可以有效地与来自其它病原 体的抗原组合，而在抗原之间没有免疫干扰。这使得本发明的M.hyo可溶性制备物成为多 价疫苗的有效平台。其它抗原可以与M.hyo组合物同时给药（即作为单独的单次疫苗）或 者组合成即用型疫苗的形式。
[0089] 在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种M.hyo可溶性抗原和 至少一种其它抗原。在一个实施方案中，至少一种其它抗原针对能在猪中引起疾病的微生 物提供保护。
[0090] 在一些实施方案中，至少一种其它抗原组分针对已知感染猪的细菌、病毒或原 生动物提供保护。这种微生物的实例包括，但不限于下述种类：猪圆环病毒2型（PCV2)、 猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪细小病毒（PPV)、副猪嗜血杆菌（HaemophiIus parasuis)、多杀巴斯德菌（Pasteurellamultocida)、猪链球菌（Streptococcum suis)、猪葡萄球菌（Staphylococcushyicus)、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌（Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门 氏菌（Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis)、猪红斑 丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusiopathiae)、猪鼻支原体（Mycoplamahyorhinis)、猪 滑液支原体（Mycoplasmahyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis)、猪流感病毒（SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻（PED)病毒、轮状病毒、细环病毒 (TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病、典型性猪瘟（CSF)的致病 原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。
[0091] 在一个实施方案中，本发明的免疫组合物包含至少一种M.hyo可溶性抗原（例如 两种或更多种）和PCV2抗原的组合。在另一个实施方案中，组合物在猪中引发针对M.hyo 和PCV2二者的保护性免疫反应。
[0092] 在一个实施方案中，根据本发明的M.hyo/PCV2组合疫苗以单次剂量、单瓶即用型 疫苗的形式提供。这种即用型组合疫苗不需要混合单独的疫苗，因此没有污染的风险，没有 混合工作所伴随的额外劳动，并且没有在几小时之内使用混合物的要求。而且，单瓶M.hyo/ PCV2组合疫苗使废料和冰箱储存空间减半。而且，单次剂量给药减少了对动物进行第二次 剂量给药所伴随的劳动。应当注意，虽然PCV2/M.hyo组合疫苗目前已有，但它们是以两次 剂量、即用型疫苗的形式（Circumvent?.PCVM)，或者需要同时进行单独疫苗的给药的 单次剂量，2瓶疫苗的形式（例如IngeIvacCircoFLEX?:和IngeivacMycoFLEX?: )提供。优选地，根据本发明的M.hyo/PCV2组合与其它抗原（例如PRRS病毒抗原）相容， 从而使得所有抗原可以在单次剂量中给药。
[0093] 在一些实施方案中，M.hyo/PCV2组合疫苗的PCV2抗原组分是嵌合1型-2型圆 环病毒的形式。嵌合病毒包括灭活的表达猪圆环病毒2型0RF2蛋白的重组猪圆环病毒1 型。嵌合猪圆环病毒及其制备方法在WO03/049703A2还有美国专利Nos. 7, 279, 166和 7, 575, 752中描述，通过引用的方式将其全文合并入本文。
[0094] 在一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒的基因组的全长DNA序列相应于SEQID NO: 5或其变体，如下所述。在另一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒的免疫原性0RF2衣壳 基因相应于SEQIDNO: 6。在另一个实施方案中，由嵌合PCV1-2病毒表达的免疫原性0RF2 蛋白的氨基酸序列相应于SEQIDNO:7。
[0095]在又一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒的基因组的全长DNA序列相应于SEQID N0:8。在一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒的免疫原性0RF2衣壳基因相应于SEQIDN0:9。 在另一个实施方案中，由嵌合PCV1-2病毒表达的免疫原性0RF2蛋白的氨基酸序列相应于 SEQIDNO:10。
[0096] 但是，嵌合PCV1-2病毒的PCV2 0RF2DNA和蛋白不限于上述序列，因为在PCV2分 离物中，PCV2 0RF2DNA和蛋白是高度保守的区域。
[0097] 在一些实施方案中，M.hyo/PCV2组合疫苗的PCV2抗原组分是重组0RF2蛋白的形 式。在一个实施方案中，重组0RF2蛋白从杆状病毒载体中表达。或者，可以使用其它已知 的表达载体，例如包括，但不限于副痘病毒载体。
[0098] 在一个实施方案中，重组PCV2 0RF2蛋白的序列为SEQIDN0:11，其由SEQID N0:12(GenBankAccessionNo.AF086834)编码。在另一个实施方案中，重组0RF2蛋白的序 列为SEQIDNO: 13,其由SEQIDNO: 14编码。在又一个实施方案中，重组0RF2蛋白相应 于SEQIDN0:15。在再一个实施方案中，重组PCV2 0RF2蛋白相应于SEQIDN0:7。在再 一个实施方案中，重组PCV2 0RF2蛋白相应于SEQIDN0:10。
[0099] 但是，本发明不限于上述的特定的0RF2DNA和蛋白。因为在PCV2分离物中，PCV2 0RF2DNA和蛋白是高度保守的区域，任何PCV2 0RF2作为PCV2 0RF2DNA和/或多肽的来 源用在嵌合PCV1-2病毒中或重组PCV2蛋白中都极有可能是有效的。
[0100] 用于产生PCV2 0RF2DNA和蛋白序列的合适的PCV2分离物的实例是PCV2分离物 编号40895(2001年12月7日保藏于八了0：，指定的4了0：专利保藏命名为？了4-3914)。？(^2 分离物编号40895的基因组（核苷酸）序列可以从GenBank序列号AF264042获得。用于 产生PCV2 0RF2DNA和蛋白序列的其它合适的PCV2分离物包括，但不限于下列种类：Imp. 9 99,Imp. 1010-Stoon,Imp. 1011-48121 和Imp. 1011-48285。相应于这些PCV2 分离物的基因 组序列的GenBank序列号分别是AF055391,AF055392,AF055393 和AF055394。
[0101]PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分以某些形式被用做组合物中的抗原组分。例如， PCV2 0RF2蛋白的截短和/或取代形式可以用在本发明的组合物中。
[0102] 本领域技术人员应当理解PCV2序列的变体可以用在本发明的组合物中。这种变 体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化，且仍然保留使其能够用于免疫组合物中的 抗原特性。优选地，PCV2变体与野生型PCV2分离物的全长基因组序列具有至少80%、优选 至少85 %、更优选至少90 %、更优选至少95 %的序列同一性。免疫组合物的抗原特性可以， 例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且，当修饰的抗原提供与野生型PCV2 0RF2 蛋白相比至少70%、优选80%、更优选90%的保护性免疫时，则修饰的PCV2抗原的抗原特 性仍然保留。
[0103] 免疫原性组合物中提供的PCV2抗原组分以有效诱导所希望的免疫反应，即减少 由PCV2感染导致的临床症状的发病率或减轻其严重性的抗原包含水平存在。
[0104] 在一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒以至少1. 0 <RP< 5. 0的水平被包含在本发 明的组合物中，其中RP是由相对于参考疫苗进行的ELISA抗原定量测定（体外功效检测） 确定的相对功效单位。在另一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒以大约0. 5 %至大约5 %的 20-倍（20X)浓缩体积的大量PCV1-2抗原的终浓度被包含在本发明的组合物中。
[0105] 在另一个实施方案中，PCV2 0RF2重组蛋白以至少0. 2μg抗原/ml最终免疫原性 组合物的水平（yg/ml)被包含在本发明的组合物中。在另一个实施方案中，PCV2 0RF2重 组蛋白包含水平为大约〇. 2至大约400yg/ml。在又一个实施方案中，PCV2 0RF2重组蛋白 包含水平为大约〇. 3至大约200yg/ml。在再一个实施方案中，PCV2 0RF2重组蛋白包含水 平为大约〇. 35至大约100μg/ml。在再一个实施方案中，PCV2 0RF2重组蛋白包含水平为 大约0. 4至大约50μg/ml。
[0106] 在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种M.hyo可溶性抗原 (例如两种或更多种）、猪圆环病毒2型（PCV2)抗原和PRRS病毒抗原的组合。在另一个实 施方案中，组合物在猪中引发针对M.hyo，PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。
[0107] 在一个实施方案中，根据本发明的M.hyo/PCV2/PRRS组合疫苗以单次剂量、2瓶疫 苗的形式提供。例如，在一些实施方案中，M.hyo/PCV2组合以第一瓶中的稳定液体组合物 的形式提供，PRRS病毒以第二瓶中的冻干状态提供。在一些实施方案中，其它的猪抗原可 以被加入到第一瓶或第二瓶中。
[0108] 在一个实施方案中，PRRS病毒组分以冻干的、基因修饰的活病毒的形式提供。在 给药之前，第一瓶中的M.hyo/PCV2液体形式可以被用来使第二瓶中的PRRS病毒再水化，以 使所有三种抗原可以以单次剂量给药给动物。应当注意，虽然PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗 目前已有，它们是以需要同时进行三个单独疫苗的给药的单次剂量、3-瓶疫苗的形式提供 (例如IngelvacCircoFLEX?,IngelvacMycoFLEX?和Ingelvac?PRRSMLV)。
[0109]PRRS病原体首次在荷兰被分离出来，并被命名为莱利斯塔德病毒。这种病毒在WO 92/21375(StichtingCentraalDiegeneeskundigInstituut)中描述，欧洲PRRS病毒的分 离物保藏在巴黎巴斯德研究院，保藏号为1-1102。北美类型几乎是在欧洲类型病毒分离的 同时被分离出来，并在W0-93/03760(Collinsetal.)中描述，北美类型病毒的分离物包藏 在美国典型培养物保藏中心（ATCC)，保藏号为VR-2332。
[0110] 从欧洲和北美病毒类型中均分离出不同的毒株。WO93/07898(Akzo)描述了欧 洲毒株以及源自于它的疫苗，保藏在CNCM(巴斯德研究院），保藏号为1-1140。而且，WO 93/14196 (Rhone-Merieux)描述了在法国分离出的一种新毒株，保藏在CNCM(巴斯德研究 院），保藏号为1-1153。而且，EP0595436Bl(Solvay)描述了一种新的北美类型的毒株，t匕 最初描述的那种毒性更强，以及它的疫苗。该毒株已保藏于ATCC，但是在专利申请中没有说 明保藏编号。此外，ES2074950BA(CyanamidIberica)以及它的同族GB2282811B2描述 了一种所谓的"西班牙毒株"，其不同于其它的欧洲和北美毒株。这种"西班牙毒株"已被保 藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心（EACCC)，保藏号为V93070108。
[0111] 用于本发明的M.hyo/PCV2/PRRS组合物中的合适的PRRS病毒抗原包括北美PRRS 病毒分离物、中国PRRS病毒株和欧洲PRRS病毒株，以及这些分离物/毒株的基因修饰版 本。在一个实施方案中，用于根据本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是北美PRRS病 毒。
[0112] 在一些实施方案中，用于本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是被称为P129 的北美PRRS病毒分离物或者它的活的、基因修饰的版本。优选地，基因修饰的PRRS病毒不 能产生致病感染，但是能够引发有效的针对野生型PRRS病毒感染的免疫保护反应。
[0113] 用于本发明组合物的基因修饰的PRRS病毒可以从感染性克隆产生。被称为P129 的北美PRRS病毒分离物的感染性cDNA克隆的制备在美国专利No. 6, 500, 662中描述，通 过引用将其完全合并入本文。P129cDNA的序列在Genbank序列号AF494042和美国专利 No. 6, 500, 662 中公开。
[0114] 在一个实施方案中，用于本发明组合物的P129的非-毒性形式的核苷酸序列由 SEQIDNO: 16表示。但是本发明不限于该序列。该序列和P129的其它非-毒性形式的序 列在2011年11月9日提交的国际申请NO.PCT/IB2011/055003中描述，通过引用将其全文 内容（包括基于该国际申请提交的任何美国国家阶段申请）合并入本文。优选地，PRRS病 毒被改造以防止干扰素-介导功能的下游调控。
[0115] 在其它实施方案中，用于本发明组合物中的PRRS病毒抗原组分是被称为ISU-55 的PRRS病毒分离物。ISU-55分离物保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC)，保藏号为 VR2430。ISU-55分离物的0RF2至0RF5基因的核苷酸序列由SEQIDN0:17表示。ISU-55 分离物的0RF6和0RF7基因的核苷酸序列由SEQIDNO: 18表示。
[0116] 可以用在组合物中的另一种适合的北美PRRS病毒是ISU-12,其被保藏在ATCC， 保藏号为VR2385[3x空斑纯化]和VR2386[无空斑纯化]。还有其它可用在本发明组合物 中的适合的北美PRRS病毒分离物是下列的那些：ISU-51，ISU-3927,ISU-1894,ISU-22和 ISU-79,它们被保藏在ATCC，保藏号分别为VR2498,VR2431,VR2475,VR2429 和VR2474。这些 ISU分离物任一种的基因修饰版本可以用在本发明的组合物中。这些ISU分离物和ISU-55 分离物在下述Paul,etal的美国专利中进行了详细描述：US5,695,766,6,110,467,6,25 1, 397, 6, 251, 404, 6, 380, 376, 6, 592, 873, 6, 773, 908, 6, 977, 078, 7, 223, 854, 7, 264, 802, 7 ，264, 957,和7, 517, 976,通过引用的方式将所有这些专利的全文合并入本文。
[0117] 在再一个实施方案中，用在根据本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是 保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC)，保藏号为VR-2332的北美类型或其基因修饰 版本。例如，PRRS病毒可以是基于被确定为ATCCVR2332的分离物的改造的活病毒， 其被用在BoehringerIngelheimVetmedica,Inc的INGEL/VAC?PRRSATP和 INGELVAC?PRRSMLV中。
[0118] 在再一个实施方案中，用在本发明组合物中的PRRS病毒抗原是欧洲PRRS病毒分 离物或莱利斯塔德病毒或其基因修饰版本。适合的PRRS病毒株的实例被确定为上述的保 藏号1-1102。相应于1-1102保藏物的核苷酸和氨基酸序列在Wensvoortetal的美国专 利no. 5, 620, 691中描述，通过引用将其完全合并入本文。欧洲PRRS病毒分离物或莱利斯 塔德病毒的感染性克隆的制备在美国专利No. 6, 268, 199中描述，通过引用将其完全合并 入本文。
[0119] 适合的PRRS病毒分离物的其它实例包括但不限于上述的那些。而且，PRRS病毒 分离物的活的、基因修饰的版本可以用在本发明组合物中。感染性克隆可以被用于再生产 这种活的基因修饰的生物体。
[0120] 本领域技术人员应当理解，PRRS病毒序列的变体可以被用在本发明的组合物中。 这种变体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化，且仍然保留使其能够用于免疫组合 物中的抗原特性。优选地，PRRS病毒变体与野生型PRRS病毒分离物的全长基因组序列具 有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性。免疫组合 物的抗原特性可以，例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且，当修饰的抗原提供 与野生型PRRS病毒抗原相比至少70 %、优选80 %、更优选90 %的保护性免疫时，则修饰的 PRRS病毒抗原的抗原特性仍然保留。
[0121] 在一个实施方案中，PRRS病毒抗原组分是基因修饰的活病毒，其以至少 2.I<TCID5tl < 5. 2的水平被包含在本发明的组合物中，其中TCID5tl是通过抗原定量测定 (体外功效检测）确定的50 %组织培养物感染剂量。
[0122] 本发明的M.hyo/PCV2/PRRS组合物的PCV2抗原组分可以是嵌合1型-2型圆环病 毒的形式，嵌合病毒包括灭活的表达猪圆环病毒2型0RF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。在 另一个实施方案中，本发明的M.hyo/PCV2/PRRS组合物的PCV2抗原组分是重组0RF2蛋白 的形式。
[0123] 用于M.hyo/PCV2/PRRS组合物的适合的PCV2抗原可以是来自于任何上述的PCV2 分离物，以及其它PCV2分离物。用在本发明组合物中的适合的PCV2抗原包括，但不限于上 述的PCV2序列及其变体。
[0124] 本发明的疫苗可以遵循公认的惯例进行配制，以包含可接受的用于动物，包括人 (如果适用的话）的载体，例如标准缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，和/或增溶剂，并且可 以配制成利于缓释的形式。稀释剂包括水，盐水，右旋糖，乙醇，甘油等。等张添加剂尤其包 括氯化钠，右旋糖，甘露醇，山梨醇，乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合适的疫苗媒介物 和添加剂，包括那些特别用于配制修饰的活疫苗的，对于本领域技术人员来说是公知的或 是显而易见的。参见，例如，Remington'sPharmaceuticalScience, 18thed.，1990，Mack Publishing,其通过引用被合并入本文。
[0125] 本发明的疫苗可以进一步包含尤其是一种或多种其它的免疫调节组分，例如佐剂 或细胞因子。用在本发明组合物中的合适的佐剂包括下述种类：水包油佐剂，聚合物和水 佐剂，油包水佐剂，氢氧化铝佐剂，维生素E佐剂及其组合。佐剂的一些特定的实例包括，但 不限于，完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，短小棒杆菌，卡介苗，氢氧化铝凝胶，葡聚糖，硫酸 葡聚糖，氧化铁，海藻酸钠，Bacto-佐剂，特定的合成聚合物例如聚氨基酸和氨基酸共聚物， 嵌段共聚物（CytRx,Atlanta,Ga.)，QS_21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMass·)， SAF-M(Chiron,EmeryvilleCalif·)，AMPH丨GEN?佐剂，阜苷，QuilA或其它阜苷 级分，单磷酰脂质A和阿夫立定（Avridine)脂质-胺佐剂（N,N-双十八烧基-Ν'，Ν' 一二 (2-羟甲基）-丙二酰胺），〃REGRESSIN〃 (Vetr印harm,Athens,Ga.)，石蜡油，RIBI佐剂系统 (RibiInc.，Hamilton,Mont.)，胞壁醜二肤等等。
[0126] 可用于本发明疫苗的水包油乳液包括改良的SEAM62和SEAM1/2制剂。改 良的SEAM62 是含有 5%(v/v)角鲨烯（Sigma)，1%(v/v)SPAN?85 去垢剂（ICI Surfactants)，0.7 % (v/v)TWEEN? 80 去垢剂（ICISurfactants)，2.5 % (v/v)乙 醇，ZOOygAilQuilAaOOyg/ml胆固醇，和0. 5% (v/v)卵磷脂的水包油乳液。改良的 SEAM1/2 是含有 5% (v/v)角鲨烯，1% (v/v)SPAN?85 去垢剂，0.7% (v/v)Tween80 去垢剂，2. 5% (v/v)乙醇，100yg/mlQuilA，和50yg/ml胆固醇的水包油乳液。
[0127] 可用于本发明组合物的佐剂的另一个实例是SP-油。如说明书和权利要求中所 使用的，术语"SP油"是指包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，角鲨烯，聚氧乙烯山梨醇 酐单油酸酯，和缓冲盐溶液的油状乳液。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性剂， 帮助悬浮固体和液体组分。这些表面活性剂作为商品名为Pluronic?的聚合物是商业 可获得的。优选的表面活性剂是泊洛沙姆401，其是商业可获得的，商品名为Pluronic? L-121。通常SP油乳液是免疫刺激佐剂混合物，其包含大约1-3%vol/vol的嵌段共聚物， 大约2-6%￥〇1八〇1的角藍烯，更特别是大约3-6%的角藍烯和大约0.1-0.5%￥〇1八〇1的 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，其余为缓冲盐溶液。在一个实施方案中，SP-油乳液在最终组 合物中以大约1 %至25%、优选大约2%至15%、更优选大约5%至12%v/v的量（v/v)存 在。
[0128] 用在本发明组合物中的合适佐剂的又一个实例是AMPHIGEN?佐剂，其由溶解在油 (通常是轻质液体石蜡）中的脱脂卵磷脂组成。
[0129] 可用在本发明组合物中的其它佐剂的实例是下述的专有佐剂：Microsol DiluvacForte?，双乳液佐剂系统，Emunade佐剂和Xsolve佐剂。Emunade和Xsolve佐剂 都是水包轻矿物油的乳液，但是Emunade还包含错胶,而d,l-α-生育酚乙酸酯是XSolve 佐剂的一部分。用在本发明组合物中的合适佐剂的又一个实例是ImpranFLEX?佐剂（油 包水佐剂）。合适佐剂的又一个实例是基于Carbomer(Carb〇p〇l?)的佐剂。优选的Carbopol?佐剂包括Carbopol?934聚合物和Carbopol?941聚合物。
[0130] 在一个实施方案中，佐剂或佐剂混合物以每剂量大约100μg至大约IOmg的量被 加入。在另一个实施方案中，佐剂/佐剂混合物以每剂量大约200μg至大约5mg的量被加 入。在又一个实施方案中，佐剂/佐剂混合物以每剂量大约300μg至大约Img的量被加入。
[0131] 本发明疫苗组合物中典型存在的佐剂或佐剂混合物的量（v/v)为大约1 %至 25%，优选大约2%至15%，更优选大约5%至12%v/v。
[0132] 疫苗中可以包含的其它"免疫调节剂"包括，例如一种或多种白介素，干扰素或其 它已知的细胞因子。在一个实施方案中，佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，例如 美国专利No. 6, 165, 995和6, 610, 310中分别描述的。
[0133] 另一个方面涉及制备根据本发明的免疫原性组合物的方法。该方法包括i)在合 适的培养基中培养M.hyo 18-144小时的时间；ii)随后灭活M.hyo培养物；iii)收获灭活 培养液，其中灭活培养液包含M. hyo全细胞制备物，所述全细胞制备物包含可溶性液体级 分和不可溶细胞物质；iv)从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分；以及V)从分离的可溶 性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。
[0134] 用于培养M.hyo的合适的培养基的实例是PPLO肉汤（支原体肉汤基础），当其添 加了营养强化物质时，可以用于分离和培养支原体。
[0135] 在一些实施方案中，M.hyo培养物生长直至对数生长后期，然后培养物被灭活。在 一些其它的实施方案中，通过提高pH(例如达到大约7. 8)灭活培养物。通过将产生的培养 物暴露于灭活试剂，如二乙烯亚胺（BEI)使灭活发生。在生产培养物中L-溴乙胺氢溴酸盐 (BEA)的温育过程中原位生成BEI。随后，灭活培养物的pH被中和，例如通过加入等量的中 和溶液中灭活试剂的试剂。在一些实施方案中，灭活试剂是BEI，中和试剂是硫代硫酸钠。 在一个实施方案中，灭活培养物的pH通过加入硫代硫酸钠被调节至大约7. 4。
[0136] 在一些实施方案中，使用传统方法从不可溶细胞物质分离M.hyo全细胞制备物的 可溶性液体级分。在一个实施方案中，这种分离是通过过滤步骤。在另一个实施方案中，这 种分离是通过离心步骤。在又一个实施方案中，这种分离是通过沉淀步骤。
[0137] 在一个实施方案中，灭活的、中和的M.hyo全细胞制备物用蛋白A树脂进行处理以 基本上除去其中的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。在其它实施方案中，蛋白G树脂 可被用于基本上除去可溶性液体级分中含有的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。用蛋 白A或蛋白G树脂除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物的方法是本领域公知的。
[0138] 根据另一个方面，制备根据本发明的免疫原性组合物（例如疫苗）的方法包括制 备上述的可溶性M.hyo抗原，并将其与合适的佐剂和一种或多种药学可接受的载体混合。 该方法任选地包括加入至少一种其它猪抗原，例如上述的PCV2抗原和/或PRRS病毒抗原。
[0139] 本发明的另一个方面涉及试剂盒。"试剂盒"指组合在一起的多个组分。在一个实 施方案中，根据本发明的试剂盒包括一个瓶（或其它合适的容器），其含有包含猪肺炎支原 体（Ehyo)全细胞制备物的可溶性部分的免疫原性组合物，其中Ehyo全细胞制备物的可 溶性部分基本不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。任选地， 试剂盒可以进一步包括使用说明书。使用说明书包括免疫原性组合物的给药信息。
[0140] 在一些实施方案中，含有M.hyo全细胞制备物的可溶性部分的瓶进一步包含PCV2 抗原。在一些实施方案中，瓶中的M.hyo/PCV2组合以即用型液体组合物的形式提供。
[0141] 在其它实施方案中，试剂盒包括第二个瓶，其包含PRRS病毒抗原。在一些实施方 案中，PRRS病毒抗原是基因修饰的活病毒的形式，其以冻干的状态被提供。在这种例子中， 使用说明书将会包含用含有M.hyo/PCV2组合的瓶中的液体内容物使PRRS病毒再水化的说 明。使用说明书还将包含获得的M.hyo/PCV2/PRRS三价制剂的给药信息。
[0142] 在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物被给药给具有源自母体的针对 M.hyo的抗体的猪。在其它实施方案中，本发明的免疫原性组合物被给药给具有源自母体的 针对M.hyo和至少一种能在猪中引起疾病的其它微生物的抗体的猪。
[0143] 在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物，例如单价或多价疫苗，被给药给3 周龄或更大的小猪。但是，所考虑的是，根据本发明的单价或多价疫苗还可以用于给配种前 的小母猪进行再接种。如本领域所知道的，小母猪是从未怀孕过的雌性猪。接种的小母猪 会通过初乳将母体的抗体传给哺乳期的新生幼崽。
[0144] 进一步考虑的是，本发明的单价或多价疫苗可以用于每年给种猪群进行再接种。 优选地，根据本发明的单价或多价疫苗以单次剂量被给药给猪（例如小猪或小母猪）。在一 个实施方案中，根据本发明的多价疫苗不需要在给药前混合单独的单价疫苗，即它以即用 型制剂的形式被提供。在另一个实施方案中，多价制剂需要将第一个瓶中包含的二价疫苗 和第二个瓶中包含的单价疫苗混合。任选地，其它的抗原可以被加入到这些瓶中的任一个 中。
[0145] 在一些实施方案中，免疫力的开始是在用根据本发明的单价或多价疫苗组合物接 种后2-3周。在其它实施方案中，免疫力的持续时间为用根据本发明的单价或多价疫苗组 合物接种后大约17-23周。
[0146] 下述实施例描述了根据本发明的优选材料和程序。但是，应当理解这些实施例仅 以举例说明的方式被提供，其中任何内容都不应视为是对发明整个范围的限制。 实施例
[0147] 实施例I:PCV2可组合M.hyo抗原的猪肺炎支原体产生方法
[0148]M.hyo发酵和灭活
[0149] 种子规模和抗原生产的培养基按下述制备。按照制造商的说明（即21g/L)制备 猪心衍生的胸膜肺炎样生物体（PPLO)肉汤（BDBiosciences目录No. 21498)，并将酵母提 取物制备成21g/L，在USP中。然后将酵母提取物溶液以6. 25%的浓度加入到PPLO中，力口 热至121°C并> 30分钟使混合物灭菌。将盐酸半胱氨酸制备成90g/L并过滤灭菌。在每 升USP水中加入450g右旋糖，然后加热灭菌，制备右旋糖溶液。为了制备最终的培养基， 向基础培养基中加入10 %的猪血清，然后加入0.01 %的半胱氨酸和1.0 %的右旋糖。培 养基用10%v:v的猪肺炎支原体（P-5722-3株）对数生长期培养物接种。将培养物置于 37°C，并将pH和d0分别保持在7. 0和25%。在对数生长晚期，通过二乙烯亚胺（binary ethylenimine，ΒΕΙ)，一种由2-溴乙胺氢溴酸盐产生的氮杂环丙烷化合物灭活使培养物灭 活。具体地，通过加入2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA)至终浓度为4mM并温育24小时，将pH提高 至7.8来使灭活发生。通过以1:1的摩尔比加入硫代硫酸钠并再温育24小时来中和BEI。 灭活的培养液置于2-8°C直至进一步处理。
[0150] 实施例2 :嵌合猪圆环病毒（cPCV) 1-2产生方法
[0151] 通过将致病性猪圆环病毒2型（PCV2)的免疫原性衣壳基因克隆到非致病性猪圆 环病毒1型（PCVl)的基因组骨架中构建CPCV1-2。嵌合DNA克隆的构建过程例如在美国 专利No. 7, 279, 166中描述，通过引用将其全文合并入本文。嵌合病毒的感染性贮存物从 Dr.X.J.MengjVirginiaPolytechnicInstituteandStateUniversity,Blacksburg,VA 处获得，并用于感染在添加了 〇. 05 %乳白蛋白水解物（LAH)，30μg/mL硫酸庆大霉素和5 % 胎牛血清的最小必需培养基（MEM)中生长的猪肾（PK)-15细胞。得到的cPCVl-2感染的 PK-15细胞使用相同的生长培养基通过连续传代4次进行扩增，除了培养基中含有2-3%胎 牛血清。第五次传代被冷冻、融化和过滤，得到的裂解物被用于制备前主种子（pre-master seed)和后续的主种子。
[0152] 用于生产病毒种子的培养基与生产病毒贮存物中使用的一样。对于生长培养基， MEM、0ptiMEM或等同物是可用于培养PK-15细胞系进行生长的基础培养基。生长培养基可 以添加最多10%的牛血清，最多0. 5%的乳白蛋白水解物，最多0. 5%的牛血清白蛋白和最 多30μg/mL的庆大霉素。对于病毒繁殖培养基，使用MEM，OptiMEM或等同物。病毒繁殖培 养基可以添加最多〇. 5%的乳白蛋白水解物，最多2 %的牛血清，最多0. 5 %的牛血清白蛋 白和最多30μg/mL的庆大霉素。最多5g/L的葡萄糖和最多5mmol/L的L-谷氨酰胺可以 根据需要被加入到生长培养基和/或病毒繁殖培养基中以维持细胞。
[0153]cPCVl-2主种子病毒被加入到PK-15细胞的细胞悬液中并吸附最多3小时。种子 病毒在生长基础培养基中被稀释以提供0. 1-0. 0001的感染复数（MOI)。
[0154]PK-15细胞培养物在细胞种植时，或在细胞达到大约20%至50%汇合时用工作种 子病毒进行最初的接种。这种最初的传代可以被称为"一步感染法"，用于产生抗原贮存物， 或者可以被进一步用于连续传代。对于连续传代，cPCVl-2感染的PK-15细胞通过以1:5-20 的比例连续分裂被进一步扩增到第7代以进行病毒繁殖。含有来自于上一代的感染细胞 悬液的培养物培养基作为下一代的种子物。每一代的cPCVl-2感染的细胞在36±2°C温育 3-14天直至细胞达到彡90%汇合。在病毒复制过程中，cPCVl-2病毒引起可观察到的细胞 病性改变。收获时，观察到细胞变圆以及相当多的漂浮的碎片。还观察到培养物被细菌或 真菌污染的可见证据。cPCV抗原的收获之间的温育时间在下述的表1中提供：
[0155]表1收获cPCV抗.原的最fa.和最长时间
【权利要求】
1. 一种免疫原性组合物，其包含猪肺炎支原体（M. hyo)全细胞制备物的可溶性部分， 其中所述M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗原与免疫球蛋白结合 形成的免疫复合物。
2. 权利要求1的组合物，其中所述可溶性部分在被加入到所述免疫原性组合物中之前 已用蛋白-A或蛋白-G进行处理。
3. 权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述M. hyo制备物的可溶性部分包含至少 一种M. hyo蛋白抗原。
4. 权利要求3的组合物，其中所述M. hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种 M. hyo蛋白抗原。
5. 权利要求3的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种其它抗原。
6. 权利要求5的组合物，其中所述至少一种其它抗原针对能在猪中引起疾病的微生物 提供保护。
7. 权利要求6的组合物，其中所述微生物包含细菌、病毒或原生动物。
8. 权利要求7的组合物，其中所述微生物选自猪圆环病毒2型（PCV2)、猪繁 殖和呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪细小病毒（PPV)、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida)、猪链球菌（Streptococcum suis)、猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门 氏菌（Salmonella choleraesuis)、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis)、猪红斑 丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪鼻支原体（Mycoplama hyorhinis)、猪 滑液支原体（Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis)、猪流感病毒（SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻（PED)病毒、轮状病毒、细环病毒 (TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病、典型性猪瘟（CSF)的致病 原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。
9. 权利要求8的组合物，其中所述至少一种其它抗原是猪圆环病毒2型（PCV2)抗原、 PRRS病毒抗原或其组合。
10. 权利要求9的组合物，其中所述组合物引发针对M. hyo和PCV2的保护性免疫反应。
11. 权利要求9的组合物，其中所述组合物在猪中引发针对M. hyo、PCV2和PRRS病毒 的保护性免疫反应。
12. 权利要求9的组合物，其中所述PCV2抗原是嵌合1型-2型圆环病毒的形式，所述 嵌合病毒含有灭活的表达猪圆环病毒2型0RF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。
13. 权利要求9的组合物，其中所述PCV2抗原是重组0RF2蛋白的形式。
14. 权利要求13的组合物，其中所述重组0RF2蛋白从杆状病毒载体表达。
15. 权利要求1至14任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
16. 权利要求15的组合物，其中所述佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐 齐?、氢氧化铝佐剂、维生素 E佐剂及其组合。
17. 权利要求1至16任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含药学可接受的载体。
18. 权利要求1至17任一项的组合物，其中所述组合物当以单次剂量给药的形式进行 给药时，引发针对M. hyo的保护性免疫反应。
19. 权利要求6的组合物，其中所述组合物当以单次剂量给药的形式进行给药时，引发 针对M. hyo和至少一种能在猪中引起疾病的其它微生物的保护性免疫反应。
20. -种免疫猪抵抗猪肺炎支原体（M. hyo)的方法，包括给猪施用权利要求1的组合 物。
21. 权利要求20的方法，其中所述组合物被肌内、皮内、经皮或皮下给药。
22. 权利要求20或权利要求21的方法，其中所述组合物以单次剂量的形式给药。
23. 权利要求20至22任一项的方法，其中所述M. hyo制备物的可溶性部分含有至少一 种M. hyo蛋白抗原。
24. 权利要求23的方法，其中所述组合物与至少一种其它抗原共同给药，所述至少一 种其它抗原针对能在猪中引起疾病的微生物提供保护。
25. 权利要求24的方法，其中所述微生物选自猪圆环病毒2型（PCV2)、猪繁 殖和呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪细小病毒（PPV)、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida)、猪链球菌（Streptococcum suis)、猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门 氏菌（Salmonella choleraesuis)、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis)、猪红斑 丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪鼻支原体（Mycoplama hyorhinis)、猪 滑液支原体（Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis)、猪流感病毒（SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻（PED)病毒、轮状病毒、细环病毒 (TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病、典型性猪瘟（CSF)的致病 原和猪传染性肠胃炎的致病原，或其组合。
26. 权利要求20至25任一项的方法，其中所述组合物被给药给具有来自母体的M. hyo 抗体的猪。
27. 权利要求24的方法，其中所述组合物被给药给具有来自母体的针对M. hyo和至少 一种能在猪中引起疾病的其它微生物的抗体的猪。
28. 权利要求20至27任一项的方法，其中所述组合物被给药给3周龄或更大的猪。
29. -种试剂盒，其包含： 含有免疫原性组合物的瓶，所述免疫原性组合物包含猪肺炎支原体（M. hyo)全细胞制 备物的可溶性部分，其中所述M. hyo制备物的可溶性部分基本上不含（i)IgG和（ii)由抗 原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
30. 权利要求29的试剂盒，进一步包括含有免疫原性组合物给药信息的使用说明书。
31. -种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括： i) 在合适的培养基中培养M. hyo 18-144小时的时间； ii) 随后灭活所述M. hyo培养物； iii) 收获灭活的培养液，其中所述灭活的培养液包含M. hyo全细胞制备物，所述全细 胞制备物包含可溶性液体级分和不可溶细胞物质； iv) 从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分； V)从分离的可溶性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。
【文档编号】A61K39/12GK104271154SQ201380023655
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2012年4月4日
【发明者】J·E·高尔文, G·P·尼采尔, J·K·加勒特, J·R·Ii·库拉维克, T·L·里克, M·M·斯马茨尔 申请人:硕腾有限责任公司