一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因oh-tci及其表达方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达载体和应用，合成优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI，构建重组质粒pUC18-T-OH-TCI和pET43.1-OH-TCI，并转到大肠杆菌中，筛选阳性转化子，经实验结果表明重组大肠杆菌分泌表达了融合蛋白NusA-OH-TCI，经thrombin酶切后，获得具有明显抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性的重组rOH-TCI，本发明采用大肠杆菌表达系统可以获得高表达量、高活性的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI，克服了以其他方式获取OH-TCI的成本高、表达量低的缺点。在医药、化工等行业具有广泛应用前景。
【专利说明】—种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前从国产眼镜蛇科眼镜王蛇中首次分离得到了蛇毒Kunitz-型蛋白酶抑制剂0H-TCI，是目前自然界发现的唯一同时具有胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制活性且对二者抑制活性基本相同的Kunitz-家族成员。OH-TCI与抑肽酶Aprotinin同属Knitz-型蛋白酶抑制剂，二者的成熟肽均由58个氨基酸残基组成。但二者胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性有明显的差异。抑肽酶(Aprotinin)是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抑制纤溶酶、激肽释放酶和保护血小板的作用。在临床上，主要用于治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量。
[0003]OH-TCI是从眼睛王蛇蛇毒少量提取获得。由于其来源困难，不能进行工业化生产，采取DNA重组技术生产蛋白酶抑制剂OH-TCI是解决其供需矛盾的有效途径。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术中利用大肠杆菌表达系统生产眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI所存在的外源 蛋白的表达在细胞周质空间、翻译后加工不理想、产量低的不足，提供了一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用。本发明采用大肠杆菌表达系统可以获得高表达量、高活性的rOH-TCI，不受原材料来源的限制，克服了以其他方式获取OH-TCI的成本高、表达量低和活性低的缺点。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现:
[0006]本发明提供了一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因0H-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
[0007]克隆所述基因的特异性引物为:
[0008]引物F1: 5，-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3 ’ ；
[0009]引物Rl: 5，-ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3，。
[0010]在所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位点，3’端加有HandIII酶切位点。
[0011]本发明还提供了所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI编码产生的蛋白酶抑制剂OH-TCI，其具有序列表SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0012]含有所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI的重组载体，所述重组载体为PUC18-0H-TCI 和 pET43.1-OH-TC10
[0013]本发明还提供了所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI在在制备治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量的药物或保健品中的应用。所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI具有对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。
[0014]本发明选择眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因0H-TCI，根据大肠杆菌密码子的偏好性对基因序列进行优化，并人工合成优化后的OH-TCI基因，将其与PUC18-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒PUC18-0H-TCI，以重组质粒pUC18-0H-TCI为模板，用F1、Rl引物进行PCR扩增得到目的基因片段0H-TCI。将合成的优化后的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI与载体pET43.1a连接，构建了重组质粒pET43.1-0H-TCI。将重组质粒PET43.1-0H-TCI经化学转化法转到大肠杆菌BL21中，在含抗生素Ampicillin筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于LB液体培养基中，将菌株按2%接种量接入LB培养基中，于37°C,210r/min摇床培养至0D600值达到0.5-0.6时，加IPTG，28°C温度下诱导表达，同时进行最佳诱导表达条件的探索，以确定表达的最佳条件。诱导结束后，离心收集菌体细胞。超声破碎，离心。菌体裂解物上清进行SDS-PAGE，得到与预期一致大小约为73kD的目的条带。N1-NTA亲和层析纯化融合蛋白NusA-OH-TCI ;融合蛋白NusA-OH-TCI连接处设计有thrombin的酶切位点,用thrombin酶切融合蛋白，通过HPLC方法制备重组rOH_TCI。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定重组rOH-TCI的分子量。由于thiOmbin酶切，在重组rOH-TCI的N端残留两个氨基酸Gly-Ser，结果表明，重组蛋白rOH_TCI蛋白分子量与理论基本一致(6490.40Da)。重组rOH-TCI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶具有明显抑制活性。 [0015]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:本发明利用大肠杆菌表达系统来作为生产眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI的表达系统，它具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高和良好的发酵性能等优点，本发明优化后的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI的基因经大肠杆菌表达系统产生的蛋白酶抑制剂OH-TCI具有高活性、高表达量的优点。
[0016]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
λ.Μ
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【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是原始OH-TCI序列与本发明优化后OH-TCI基因序列对比图谱。
[0018]图2是本发明中重组表达质粒pET43.1-0H-TCI示意图谱。
[0019]图3是本发明中重组表达质粒pET43.1-0H-TCI的测序图谱。
[0020]图4 是本发明中 pET43.1-0H-TCI 蛋白表达的 SDS-PAGE 图谱，1、ρΕΤ43.1-0H-TCI/BL21 诱导前；2、pET43.1-0H-TCI/BL21 诱导后；3、pET43.1-0H-TCI/BL21 诱导后菌体超声离心上清；4、pET43.1-0H-TCI/BL21诱导后菌体超声离心沉淀；5、N1-NTA树脂纯化NusA-OH-TCI融合蛋白；M、MAKER蛋白分子量。
[0021]图5是本发明中重组蛋白rOH-TCI (rOT)的HPLC纯化图谱。
[0022]图6是本发明中rOH-TCI质谱分析图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0024]实施例1
[0025]一、OH-TCI基因的选择、优化和合成
[0026]1、OH-TCI基因的选择[0027]眼镜王蛇毒中分离新型蛋白酶抑制剂OH-TCI，属于Kunitz-家族，成熟分子由58个氨基酸组成，它是目前已报道唯一对胰蛋白酶和糜蛋白酶同时具有优良抑制活性的蛋白分子。
[0028]2、OH-TCI基因序列的优化
[0029]外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白有效表达的重要因素。本发明根据大肠杆菌密码子偏好性，将OH-TCI基因的大肠杆菌低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。OH-TCI基因的核苷酸序列与Genbank中OH-TCI基因序列对比如附图1所示。
[0030]在图1中，图谱上面一条序列是Genbank中OH-TCI基因序列(NCBI序列号:EU246692.1)，下面一条是优化后的OH-TCI基因序列，两者对比后的横线部分为相同碱基，标示部分为差异碱基。
[0031]图1表明，与Genbank中OH-TCI序列相比，优化后的OH-TCI有38个碱基发生了置换。
[0032]通过专业软件分析，所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位点(CCCGGG)，3’端加有HandIII酶切位点(AAGCTT)。酶切位点如SEQ ID No:1所示的核苷酸中的下划线所
【权利要求】
1.一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因d/TJ，其具有序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI，其特征在于克隆所述基因的特异性引物为: 引物 Fl:5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ ；
引物 Rl:5’ -ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3’。
3.根据权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI，其特征在于在所述OH-TCI基因的5 ’端加有I酶切位点，3 ’端加有Heindl 11酶切位点。
4.权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因d/TJ编码产生的蛋白酶抑制剂OH-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.含有权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI的重组载体。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为PUC18-0H-TCI和pET43.1-0H-TCI。
7.权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI的表达方法，其特征在于它包括以下步骤:将所述的基因与pUClS-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒PUC18-0H-TCI,以pUC18-0H-TCI为模板，用F1、Rl引物进行PCR扩增得到目的基因片段OH-TCI，构建重组质粒pET43.1-0H-TCI并将其转到大肠杆菌BL21中，筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于液体培养基中，将菌株按2%接种量接入LB培养基中，于37°C，210r/min摇床培养至0D_值达到0.5-0.6时，加IPTG，28°C温度下诱导表达，诱导结束后，离心收集菌体细胞，纯化融合蛋白NusA-OH-TCl，用thrombin酶切融合蛋白得到重组蛋白酶抑制剂rOH-TCl。
8.根据权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI在制备治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量的药物或保健品中的应用。
9.根据权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI在制备治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量的药物或保健品中的应用，其特征在于所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI具有对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。
【文档编号】A61P1/18GK103740730SQ201410001201
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】孙同毅 申请人:潍坊医学院