miR-1255a和肿瘤治疗药物的联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域。更具体而言，本发明涉及小RNA分子及其医药用途。本发明提供了miR-1255a和肿瘤治疗药物的联合应用。更具体而言，本发明提供了一种具有影响肿瘤治疗效果的药用组合物，包括有效量的1）miR-1255a激动剂和2）肿瘤治疗药物。
【专利说明】miR-1255a和肿瘤治疗药物的联合应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域。更具体而言，本发明涉及小RNA分子及其医药用途。【背景技术】
[0002]microRNA的异常表达可导致肿瘤细胞的耐药性。例如，Cl iment等发现乳腺癌患者由于Ilq染色体上miR_125b的缺失导致蒽环霉素类化疗药的耐药性增加，同时乳腺癌患者对紫杉醇、5-氟尿嘧啶、拓扑替康等化疗药也产生耐药性。已有专利申请公开了基于microRNA的方法用于乳腺癌的诊断、预后和治疗(US2006/029889，克劳斯等；US2010/0297627, Watson et al.)。在乳腺癌患者检测和治疗中，仍然存在如下问题:化学治疗的肿瘤治疗药物存在抗药性，且成本高、价格昂贵；micr0RNA检测成本高。
[0003]通过代谢组学技术可以获得大量的代谢物定性定量结果，经过筛选，有望发现特异的、灵敏的、与疾病诊断或治疗相关的生物标志物，也可为新药开发提供药物靶点。例如，Beckonert等(Beckonert et al.，2003)利用1H-NMR代谢组学技术对乳腺肿瘤样本(49个)和正常乳腺组织样本(39个)进行分析，并寻找特征差异代谢物。结果发现，组织中卵磷脂、尿苷二磷酸己糖、磷酸乙醇胺的浓度随着肿瘤等级的升高而增加，且在恶性肿瘤样本中可检测到超高浓度的牛磺酸，结果表明这几种脂类代谢物与高度恶性乳腺癌肿瘤密切相关。然而，迄今为止，未涉及利用代谢组学技术寻找有差异变化的microRNA的应用。
[0004]在小分子miR-145在糖尿病等炎症代谢性疾病治疗中，经实验证实，在高糖、高脂情况下，该microRNA参与糖尿病血管病变等代谢疾病的炎症病变发生发展，可用于制备治疗炎症药物，尤其是制备治疗糖尿病等炎症代谢性疾病药物及制备检测糖尿病制剂。MiR-145可成为糖尿病病人检测指标之一，并作为糖尿病大血管病变等炎症性疾病的治疗靶点。该种方案仍然存在以下的问题:使用的miR-145检测方法，如miRNA芯片，成本太高。
[0005]因此，本领域中需要解决检测与药物敏感性相关的mi croRNA分子时，耗时长，成本高的问题；并且需要提供用于乳腺癌患者治疗的新治疗物，从而避免化疗药物的耐药性。
【发明内容】
[0006]发明人基于MTT法和代谢组学技术，高效地筛选了与药物敏感性相关的microRNA,发现了与肿瘤细胞的药物敏感性有关的microRNA分子miR_1255a，并因此制备了一种影响药物敏感性的药用组合物。
[0007]本发明人发现microRNA分子miR_1255a与肿瘤细胞的药物敏感性有关，并且基于代谢组学技术，在乳腺癌细胞药物治疗后，鉴定该microRNA分子对细胞代谢水平的扰动作用。
[0008]基于上述发现，在一方面，本发明提供了 microRNA分子miR_1255a的治疗用途。所述治疗用途是miR-1255a可降低肿瘤治疗药物的浓度，从而节省肿瘤治疗药物的成本并减轻乳腺癌患者的痛苦。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤治疗药物是紫杉醇。
[0009]在另一方面中，本发明还提供了一种具有影响肿瘤治疗效果的药用组合物，用于节省化疗药物的成本并减轻乳腺癌患者的痛苦。在本申请中，影响肿瘤治疗效果即抑制肿瘤细胞药物敏感性和影响肿瘤细胞代谢水平。即miR-1255a激动剂在与肿瘤治疗药物一块使用时有协同效应。所述药物组合物包括有效量的I) miR-1255a激动剂和2)肿瘤治疗药物。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤治疗药物是紫杉醇。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1示出miR-1255a对MCF7细胞紫杉醇药物敏感性的影响。
[0011]图2示出核磁谱图分析药物组合物对细胞整体代谢水平的影响。
[0012]图3示出PCA得分图分析药物组合物对细胞代谢水平的影响。
[0013]图4示出PCA负载图分析药物组合物对细胞代谢水平的影响。
【具体实施方式】
[0014]本发明提供了一种具有抑制肿瘤细胞药物敏感性和影响肿瘤细胞代谢水平的药物组合物，其包括有效量的l)miR-1255a激动剂和2)肿瘤治疗药物。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还包括3)药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤治疗药物是紫杉醇。
[0015]在本申请中，miR-1255a激动剂是是直接将miR-1255a的成熟序列(SEQ ID NO:1 ；miR-1255a的前体序列为SEQ ID NO: 2)经过特殊化学修饰(如全链上的甲基化修饰、5’端和3’端的硫代修饰和3’端的胆固醇修饰)而合成的,它通过模拟内源性miR-1255a的作用来调节靶基因的表达。
`[0016]在本申请中，有效量是指足以产生生物活性的药物组合物的量，所选用的剂量水平取决于多种因素，包括药物组合物的活性、给药途径、与其他药物或治疗方法的组合、所治疗患者的严重程度等。优选地，最合适的剂量由本领域内普通技术人员来评定。
[0017]在本申请中，本发明的药物组合物在无菌的和无热源的条件下制备。所述药物组合物的制备方法在本领域技术人员的能力范围之内，可参考Remington’s PharmaceuticalScience,第 17 版，MackPublishing Company, Easton, Pa.(1985)中其公开内容所描述的。
[0018]在本申请中，合适的药学上可接受的载体包括水、缓冲水溶液、生理盐水、0.4%的盐水等。本发明的药物组合物包括常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和PH调节剂。合适的添加剂包括例如生理生物相容性缓冲剂(盐酸氨丁三醇)、螯合剂(DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物(DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)、钙或钠盐(氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。本发明的药物组合物可以液态形式包装或冻干。
[0019]本发明的固体药物组合物，可用常规的药学上可接受的无毒载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
[0020]用于将核酸导入细胞的方法在此领域内有很多，其包括但不限于脂质体包裹RNA法、电穿孔法、磷酸钙介导的转化、DEAE-葡聚糖介导的转化、病毒和非病毒载体等。
[0021]除非另有说明，根据制造商的说明书使用实施例中提到的可商购试剂。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员之一所通常理解的含义相同。下文描述了示例性的方法和材料，然而与本文描述的那些类似或等价的方法和材料也可用于实施或测试本发明。所述材料、方法和实施例仅是示例性的，不意欲对范围进行限制。
[0022]实施例
[0023]1)细胞生长测定
[0024]将生长状态良好的MCF7细胞以8 X IO3个/mL的密度接种于96孔板中，置于37°C、5%C02的培养箱中过夜培养，参照广州锐博生物科技有限公司提供的miRNA转染说明书将miR-1255a激动剂转入MCF7细胞，转染24小时后，紫杉醇(T7402，Sigma-Aldrich)药物处理24小时，然后进行3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基溴化四氮唑蓝(简称MTT)检测。简而言之，每孔中加入10 μ L的0.5mg/mL MTT (Sigma),于37°C培养箱中继续孵育4小时，最后加入150 μ L DMSO (Amerso)，振荡10分钟，用酶标仪测量570nm波长下的OD值。
[0025]2)miR_1255a 激动剂转染
[0026]miR-1255a激动剂是直接将miR-1255a的成熟序列(SEQ ID NO:1)经过特殊化学修饰(全链上的甲基化修饰、5’和3’端的硫代修饰和3’端的胆固醇修饰)而合成的，它通过模拟内源性miR-1255a的作用来调节靶基因的表达。将MCF7细胞铺板于96孔板中，过夜培养。待细胞密度达到40-50%时，用49.75 μ L无血清培养基(Opt1-MEM)稀释
.0.25μL20ymol/L miR_1255a激动剂(miR40005906，广州锐博生物科技有限公司)储存液。轻轻混匀，使其局部浓度达到100NΜ，每孔加入50 μ L上述混合液。待转染4_6小时后，每孔再加入50 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养基。
[0027]3) IH-NMR代谢组学实验
[0028]Α)细胞处理及分组
[0029]将生长状态良好的MCF7细胞接种于6孔板中，过夜培养，待细胞密度为60_70%时，细胞进行如下处理:
[0030]第1组:miR-1255a激动剂阴性对照转染细胞24h，转染方法同上。再加lmg/mL的紫杉醇药物处理细胞24h ；
[0031 ] 第2组:lmg/mL的紫杉醇药物处理细胞24h ；
[0032]第3组:miR_1255a激动剂转染细胞24h，转染方法同上。再加lmg/mL的紫杉醇药物处理细胞24h ；
[0033]第4组:miR-1255a激动剂转染细胞24h，转染方法同上；
[0034]第5组:miR-1255a激动剂阴性对照转染细胞24h，转染方法同上；
[0035]第6组:空白对照组。
[0036]B)样品预处理
[0037]将6孔板中的培养基取出，1000rpm, 4°C离心5min，吸出ImL上清至离心管中，并放置于冰上。加入ImL乙腈至离心管中，混匀，25000rpm，4°C，离心20min。吸取上清液，将上清液置于氮吹仪中，吹去有机溶剂乙腈，放于_80°C冰箱中保存过夜。再用冻干机将样品冻成干粉状。
[0038]C)样品处理
[0039]向冻干粉状的样品中加入600 μ L D2O,使其溶解。HOOOrpm离心8min，取上清液550 μ L，加入已加有50 μ L TSP (2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸)的重水溶液(D20，lmg/mL)的5mm核磁共振管中待用。
[0040]对于每个样本，分别采用PRESAT(核磁谱图的分析技术)脉冲序列(Presaturation预饱和脉冲序列)采集样本数据。谱宽为9000Hz，采样点数32k，采样时间4s，累加次数64次，弛豫延迟为2s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。对自由感应衰减(freeinduction decay, FID)信号数据填零后，加上0.5Hz的线增宽因子，经傅立叶变换后得到IH-NMR谱图。将TSP定标为δ0。
[0041 ] 4) IH-NMR数据处理及分析
[0042]经傅里叶变换得到的IH-NMR谱图经过相位调整和基线校正后，对范围在δ 0.4-9.4内的谱按每段0.01ppm进行分段积分，排除范围在δ 4.7-5.1之间的谱，积分按每张谱的总积分强度进行归一化处理，处理后所得积分数据保存至Excel。
[0043]将保存的Excel 积分数据输入到 SIMCA-P+软件(ν10.04，Umetrics, Umea,Sweden)中，进行模式识别处理。数据采用Pareto标度化(Pareto scaling)预处理后再进行PCA (主成分分析)分析。PCA是一种非监督的模式识别方法，主要应用于观察组别之间的分离趋势以及实验中是否存在异常点。结果以得分图(scores plot)和负载图(loadingsplot)的形式表示，得分图表示数据点的分布趋势，点的聚集说明样本之间(观测变量)具有高度相似性，而点的离散则说明观测变量之间存在明显的差异。负载图表示导致样本差异的变量，变量离原点的空间距离越远，说明该变量对样本造成的差异越大。并对负载图进行T-test检验,寻找差异代谢物，结果以Heatmap图形式表不。
[0044]本发明制备的药物组合物治疗MCF7细胞后，明显影响细胞的生长。实验结果如图1所示，其中ago-microRNA为miR_1255a激动剂；NC为miR_1255a激动剂的阴性对照(miR04201，广州锐博生物科技有限公司)，该阴性对照是一种通用的阴性对照，经过生物信息学分析表明其序列与人、小鼠、大鼠的基因序列有最小的同源性(至少有5个碱基不匹配)，并经过大量实验证实其可行性，可用于人、小鼠、大鼠的miRNA实验的阴性对照。
[0045]本发明制备的药物组`合物影响MCF7细胞的代谢水平，实验结果如图2-4所示，从核磁谱图中可见(图2)，化学位移值在δ 0.8-1.4区段、δ 1.8-2.6区段、δ 3-4区段中峰高都有差异，表明与阴性转染加药组相比，代谢物在miR-1255a转染加药组中有所改变。PCA得分图结果(图3)说明代谢物在两组中有明显差异，足够将两组样本区分开。负载图(图4)也显示化学位移在δ 2.73,2.74,1.32,1.33,1.34,1.92等处离原点空间距离较远，提示该处化学位移所代表的化合物可能是造成组别差异的代谢物。并在PCA负载图中，通过t-test 检验(设定 Ρ〈0.01，FDR〈0.01)。
【权利要求】
1.一种具有影响肿瘤治疗效果的药用组合物，包括有效量的l)miR-1255a激动剂和2)肿瘤治疗药物。
2.权利要求1的药用组合物，所述肿瘤治疗药物是紫杉醇。
3.权利要求1或2的药用组合物，还包括3)药学上可接受的载体。
4.权利要求1或2的药用组合物，还包括药物赋形剂和/或添加剂。
5.权利要求1或2的药用组合物，所述miR-1255a的序列是SEQID N0.1。
6.权利要求1或2的药用组合物，所述miR-1255a激动剂是全链上的甲基化修饰、5’和3’端的硫代修饰和3’端的胆固醇修饰。
7.miR-1255a激动剂用于制备降低肿瘤治疗药物的浓度药物的用途。
8.权利要求7的用途，所述肿瘤治疗药物是紫杉醇。
9.权利要求7或8的用途，所述miR-1255a的序列是SEQID N0.1。
10.权利要求7或8的用途，所述miR-1255a激动剂是全链上的甲基化修饰、5’和3’端的硫代修饰和3’端的胆固 醇修饰。
【文档编号】A61K48/00GK103705924SQ201410003495
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】熊江辉, 乔文艳, 梁峰吉, 聂淑媛, 李溪 申请人:香港中文大学深圳研究院