一种兔抗中缅树鼩抗血清的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种兔抗中缅树鼩抗血清的制备方法，该方法步骤流程包括：实验动物的选择、血清的制备方法、初次免疫、加强免疫、血清效价测试；所述的血清的制备方法步骤流程包括：采血、止血、血清的制备、对照血清的作用；所述的血清效价测试采用双向免疫扩散法。本发明提供的兔抗中缅树鼩抗血清的制备方法，使用自己制备的抗血清进行中缅树鼩UCP1含量的测定，结果误差一般在3%～5%，减小了误差的范围；利用初次免疫和加强免疫的步骤，降低了生产成本，UCP1含量测定的效果好，经济收益大。
【专利说明】一种兔抗中緬树齣抗血清的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于中緬树駒抗血清的【技术领域】，尤其涉及一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法。
【背景技术】
[0002]肥胖是当今世界人类身体健康所面临的严重威胁，可导致一些危害人类身体健康的主要疾病风险显著增加。肥胖主要是由于能量摄入与消耗之间不协调而出现大量白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)堆积的结果。在人体中，由于过度饮食和很少锻炼，出现肥胖是不可避免的。据世界卫生组织调查，目前有超过15亿人的体重过重(体重指数，BMI>25)，肥胖的人数超过5亿(BMI>30)，且这些数字还在不断的增加(World Health0rganisation2013)。最近FDA又取缔了利莫那班和西布曲明，使得药物治疗受到很大的限制。因此，急需开发治疗肥胖的新方法。
[0003]以能量消耗，即生物能量学途径治疗肥胖是极富吸引力、也可能是最有效的途径。首先，就目前使用的各种药物来看，几乎没有一种药物能有效而无副作用的治疗肥胖。第二，最近的研究结果证明了成年人体内确实存在具有活性的褐色脂肪组织(Brown adiposetissue, BAT)，从而使得这种高能耗组织有可能成为治疗肥胖的靶器官。第三，现在已经证明增加能量消耗能够非常有效地降低体重。
[0004]哺乳动物的脂肪组织主要分为两种类型:白色脂肪组织和褐色脂肪组织，两者在形态、功能以及基因 表达谱系上都存在差异。WAT的主要功能是以甘油三酯的形式储存多余的能量及分泌一些激素和细胞因子来调节动物的能量代谢。体内白色脂肪的过度积累可导致肥胖及随之而来的代谢疾病；而BAT是非常特化的产热组织，其主要功能是参与非颤抖性产热(Nonshivering thermogenesis, NST),主要通过冷暴露而大量产热消耗能量。其产热的机制是通过线粒体内膜上的分子标志蛋白解偶联蛋白-1 (Uncoupling protein-1,UCPl)将脂肪酸氧化与ATP产生解偶联，把能量直接以热量的形式散失而不生成ATP，即通过解偶联作用消耗脂肪产生的热量。解偶联蛋白属于线粒体阴离子载体蛋白族。BAT细胞中UCPl介导的质子漏而产生的NST可以在冷暴露下动物维持正常体温或消耗高能量密度食物中多余能量方面起到重要的作用。通过敲击UCPl基因的小鼠代谢表型研究表明，UCPl在进行NST中具有关键作用。UCPl基因敲击小鼠在冷暴露条件下由于缺少BAT-NST能力而表现出致命的低体温现象(life-threatening hypothermia)。最近,研究证明了人体BAT确实具有NST能力。从临床内分泌学的角度来看，如果能找出让人体内BAT大量增生的方法或显著增强其活性，就很可能成为治疗肥胖症的有效途径。而BAT的产热能力主要依赖于其线粒体内膜上的分子标记蛋白:UCP1，UCPl表达增加是BAT产热能力增强的主要分子机制。UCPl基因水平的调节在UCPl含量和BAT产热调节中起着决定作用，是BAT产热生理调节的中心。中緬树駒已被国家十二五科技支撑计划列为新一批实验动物，该项目涉及很多与人类相关的疾病模型，本单位在该项目中承担当中緬树駒肥胖模型的开发，而UCPl含量的测定在中緬树駒肥胖模型的开发中起着关键作用。现在国内一般采用UCPl免疫试剂盒进行UCPl含量的测定，该方法操作方便，快捷，但成本高。但中緬树駒在进化上与灵长类比较接近，用鼠类试剂盒进行测定，特异性低，误差较大。目前，传统的中緬树駒抗血清存在制备成本高、误差较大、UCPl含量测定的效果差问题。
【发明内容】
[0005]本发明实施例的目的在于提供一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，旨在解决传统的中緬树駒抗血清存在制备成本高、误差较大、UCPl含量测定的效果差问题。
[0006]缩略语和关键术语定义:
[0007]解偶联蛋白-1(Uncoupling protein-1, UCPl)
[0008]福氏完全佐剂(completeFreunds adjuvant, CFA)
[0009]不完全福氏佐剂(incompleteFreunds adjuvant, IFA)
[0010]本发明实施例是这样实现的，一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，该方法步骤流程包括:实验动物的选择、血清的制备方法、初次免疫、加强免疫、血清效价测试；所述的血清的制备方法步骤流程包括:采血、止血、血清的制备、对照血清的作用；所述的血清效价测试采用双向免疫扩散法；
[0011]所述的实验动物的选择是指选择刚性成熟，生活力强、健康的雄性家兔3~5只，体重2~3kg，在室温及自然光照条件下适应3d，3只用于实验，2只备用。
[0012]所述的血清的制备方法是指实验当日，每只动物先采取血清3~5ml，作为对照血清于-20°C条件下保存备用；
[0013]所述的采血是指将动物禁食24h，然后用75%的酒精棉球擦拭动物耳根，用剪刀在近耳根处除毛，再用甲苯擦拭耳缘静脉刺激静脉扩张，在耳缘静脉上纵切开口 0.2~
0.3cm，用编好号的离心管取血；
[0014]所述的止血是指采血后静脉自行止血，然后将棉球放在切口处摁住I~2min ；
[0015]所述的血清的制备是指将采到的新鲜血液在室温静置2h，不要晃动，防止溶血，然后至于温度4°C条件下静置过夜，用移液器把上层血液转移到新的离心管中，在温度4°C条件下将2500g离心lOmin，小心取出上层血清于温度_20°C条件下保存，得到制备好的血清；
[0016]所述的对照血清的作用是指对照血清用于对照免疫后的血清效价及是否存在交叉反应；
[0017]所述的初次免疫是指将实验组动物每只注射UCPl约15 μ g (电泳纯)，加双蒸水补足 UCPl 溶液至 0.5mI,再加福氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA) 0.5ml,充分乳化混匀，以一滴混匀后的溶液在水表面不扩散为止；分别于动物两后足垫处进行皮下注射，每点0.5ml ；3只实验动物分组如下:实验组2只，注射抗原PCFA乳剂(加UCPl);对照组I只，只注射CFA，不加UCPl，用双蒸水补足体积；
[0018]所述的加强免疫是指动物经过初次免疫两周后，再次注射抗原，用量与初次免疫相同，但乳化剂使用不完全福氏佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA);注射方法改为背部皮下多点注射。
[0019]所述的血清效价测试是指加强免疫后一周，采血，制备血清，方法与血清的制备方法步骤相同，用纯化后的UCPl检测是否有抗体产生，并确定抗血清的效价，如果达到1:32以上，此后每四周用多点注射的方法加强免疫一次，方法与加强免疫步骤相同，就可每周制备血清30~50ml，即为兔抗中緬树駒抗血清，分管保存于温度-20°C条件下，备用，方法与血清的制备方法步骤相同；
[0020]测试血清的效价采用双向免疫扩散法，该双向免疫扩散法包括:
[0021]用PBS缓冲液，酸碱度pH为7.2，配制含1.5%琼脂糖的溶液，于直径3cm的培养皿中倒成平板，平板厚度要均匀且无气泡；
[0022]将平板置于温度4°C条件下放置过夜，打孔，中央一空，边缘4~6孔；
[0023]中央孔内加入适量的抗原或抗血清，边缘孔内加入适量的抗血清或抗原，室温放置过夜；
[0024]用考马斯亮蓝(R-250)染色液染色，观察结果，以确定抗血清的效价。
[0025]进一步，所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法测定结果误差一般在3%~5%，传统的测定技术采用UCPl免疫试剂盒进行UCPl含量的测定，误差一般在10%左右，大大减少了结果误差。
[0026]进一步，所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法成本在800元左右，现在国内市场上UCPl免疫试剂盒的价格为8000元左右，大大降低了生产成本。
[0027]效果汇总
[0028]本发明提供的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，使用自己制备的抗血清进行中緬树駒UCPl含量的测定，结果误差一般在3%~5%，减小了误差的范围；利用初次免疫和加强免疫的步骤，降低了生产成本。兔抗中緬树駒抗血清的制备方法误差小、成本低、UCPl含量测定的效果好，经济收益大。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是本发明实施例提供的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法的步骤流程图；
[0030]图2是本发明实施例提供的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法的血清的制备方法的步骤流程图；
[0031]图3是本发明实施例提供的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法的血清效价测试的双向免疫扩散法的步骤流程图。
【具体实施方式】
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0034]如图1所示，一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，该方法步骤流程包括:实验动物的选择SlOl、血清的制备方法S102、初次免疫S103、加强免疫S104、血清效价测试S105 ；所述的血清的制备方法S102步骤流程包括:采血S201、止血S202、血清的制备S203、对照血清的作用S204 ;所述的血清效价测试S105采用双向免疫扩散法；
[0035]所述的实验动物的选择SlOl是指选择刚性成熟，生活力强、健康的雄性家兔3~5只，体重2~3kg，在室温及自然光照条件下适应3d，3只用于实验，2只备用。[0036]所述的血清的制备方法S102是指实验当日，每只动物先采取血清3~5ml，作为对照血清于-20°C条件下保存备用；
[0037]所述的采血S201是指将动物禁食24h，然后用75%的酒精棉球擦拭动物耳根，用剪刀在近耳根处除毛，再用甲苯擦拭耳缘静脉刺激静脉扩张，在耳缘静脉上纵切开口 0.2~
0.3cm，用编好号的离心管取血；
[0038]所述的止血S202是指采血后静脉自行止血，然后将棉球放在切口处摁住I~2min ；
[0039]所述的血清的制备S203是指将采到的新鲜血液在室温静置2h，不要晃动，防止溶血，然后至于温度4°C条件下静置过夜，用移液器把上层血液转移到新的离心管中，在温度4°C条件下将2500g离心lOmin，小心取出上层血清于温度_20°C条件下保存，得到制备好的
血清；
[0040]所述的对照血清的作用S204是指对照血清用于对照免疫后的血清效价及是否存在交叉反应；
[0041]所述的初次免疫S103是指将实验组动物每只注射UCPl约15 μ g(电泳纯)，加双蒸水补足 UCPl 溶液至 0.5ml,再加福氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA) 0.5ml,充分乳化混匀，以一滴混匀后的溶液在水表面不扩散为止；分别于动物两后足垫处进行皮下注射，每点0.5ml ；3只实验动物分组如下:实验组2只，注射抗原PCFA乳剂(加UCP1);对照组I只，只注射CFA ，不加UCPl，用双蒸水补足体积；
[0042]所述的加强免疫S104是指动物经过初次免疫两周后，再次注射抗原，用量与初次免疫相同，但乳化剂使用不完全福氏佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA);注射方法改为背部皮下多点注射。
[0043]所述的血清效价测试S105是指加强免疫后一周，采血，制备血清，方法与血清的制备方法步骤相同，用纯化后的UCPl检测是否有抗体产生，并确定抗血清的效价，如果达到1:32以上，此后每四周用多点注射的方法加强免疫一次，方法与加强免疫步骤相同，就可每周制备血清30~50ml，即为兔抗中緬树駒抗血清，分管保存于温度_20°C条件下，备用，方法与血清的制备方法步骤相同；
[0044]测试血清的效价采用双向免疫扩散法，该双向免疫扩散法包括:
[0045]S301:用PBS缓冲液，酸碱度pH为7.2，配制含1.5%琼脂糖的溶液，于直径3cm的培养皿中倒成平板，平板厚度要均匀且无气泡；
[0046]S302:将平板置于温度4°C条件下放置过夜，打孔，中央一空，边缘4~6孔；
[0047]S303:中央孔内加入适量的抗原或抗血清，边缘孔内加入适量的抗血清或抗原，室温放置过夜；
[0048]S304:用考马斯亮蓝(R-250)染色液染色，观察结果，以确定抗血清的效价。
[0049]进一步，所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法测定结果误差一般在3%~5%，传统的测定技术采用UCPl免疫试剂盒进行UCPl含量的测定，误差一般在10%左右，大大减少了结果误差。
[0050]进一步，所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法成本在800元左右，现在国内市场上UCPl免疫试剂盒的价格为8000元左右，大大降低了生产成本。
[0051]工作原理[0052]如图1所示，一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法步骤流程包括:实验动物的选择SlOl、血清的制备方法S102、初次免疫S103、加强免疫S104、血清效价测试S105 ;所述的血清的制备方法S102步骤流程包括:采血S201、止血S202、血清的制备S203、对照血清的作用S204 ;所述的血清效价测试S105采用双向免疫扩散法；本发明提供的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，使用自己制备的抗血清进行中緬树駒UCPl含量的测定，结果误差一般在3%~5%，减小了误差的范围；利用初次免疫和加强免疫的步骤，降低了生产成本。
[0053]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所 作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，所述的血清的制备方法是指将采到的新鲜血液在室温静置2h，不要晃动，防止溶血，然后至于温度4°C条件下静置过夜，用移液器把上层血液转移到新的离心管中，在温度4°C条件下将2500g离心lOmin，小心取出上层血清于温度_20°C条件下保存，得到制备好的血清。
2.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:实验动物的选择是指选择刚性成熟，生活力强、健康的雄性家兔3~5只，体重2~3kg，在室温及自然光照条件下适应3d，3只用于实验，2只备用。
3.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，所述的血清的制备方法是指实验当日，每只动物先采取血清3~5ml，作为对照血清于-20°C条件下保存备用; 所述的采血是指将动物禁食24h，然后用75%的酒精棉球擦拭动物耳根，用剪刀在近耳根处除毛，再用甲苯擦拭耳缘静脉刺激静脉扩张，在耳缘静脉上纵切开口 0.2~0.3cm，用编好号的离心管取血。
4.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:止血；止血是指米血后静脉自行止血，然后将棉球放在切口处据住1~2min ； 对照血清的作用是指对照血清用于对照免疫后的血清效价及是否存在交叉反应。
5.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:初次免疫是指将实验组动物每只注射UCPl约15 μ g，加双蒸水补足UCPl溶液至0.5ml，再加福氏完全佐剂0.5ml，充分乳化混匀，以一滴混匀后的溶液在水表面不扩散为止；分别于动物两后足垫处进行皮下注射，每点0.5ml ；3只实验动物分组如下:实验组2只，注射抗原PCFA乳剂(加UCP1);对照组I只，只注射CFA，不加UCP1，用双蒸水补足体积。
6.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:加强免疫是指动物经过初次免疫两周后，再次注射抗原，用量与初次免疫相同，但乳化剂使用不完全福氏佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA);注射方法改为背部皮下多点注射。
7.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:血清效价测试是指加强免疫后一周，采血，制备血清，方法与血清的制备方法步骤相同，用纯化后的UCPl检测是否有抗体产生，并确定抗血清的效价，如果达到1:32以上，此后每四周用多点注射的方法加强免疫一次，方法与加强免疫步骤相同，就可每周制备血清30~50ml，即为兔抗中緬树駒抗血清，分管保存于温度_20°C条件下，备用，方法与血清的制备方法步骤相同。
8.如权利要求1所述的兔抗中緬树駒抗血清的制备方法，其特征在于，该制备方法进一步包括:测试血清的效价采用双向免疫扩散法，该双向免疫扩散法包括: 用PBS缓冲液，酸碱度pH为7.2，配制含1.5%琼脂糖的溶液，于直径3cm的培养皿中倒成平板，平板厚度要均匀且无气泡； 将平板置于温度4°C条件下放置过夜，打孔，中央一空，边缘4~6孔； 中央孔内加入适量的抗原或抗血清，边缘孔内加入适量的抗血清或抗原，室温放置过夜； 用考马斯亮蓝(R-250)染色液染色，观察结果，以确定抗血清的效价。
【文档编号】A61K49/00GK103800921SQ201410068189
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】王政昆, 朱万龙, 张 浩, 高文荣, 章迪, 沐远 申请人:云南师范大学