一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于缺血性心肌病移植治疗的干细胞制剂及其制备方法，本发明制剂由间充质干细胞，心肌干细胞和血管内皮干细胞组成，溶剂为患者的富含血小板血浆裂解液。所述干细胞表达相应的特异性标识，同时不表达相应的非特异性标识。制备方法包括下述步骤：（1）胎盘和脐带间充质干细胞制备；（2）使用不同的诱导培养系将步骤（1）的间充质干细胞诱导为心肌干细胞和血管内皮干细胞；（3）制备溶剂富含血小板血浆裂解液；（4）混匀并制备成干细胞制剂。本发明来源丰富，易于制备；采集方便，供着无痛苦；而且移植后免疫排斥低；本发明包括多种干细胞，可以发挥多种细胞联合作用的优势。溶剂取材方便，能直接用于患者；增强移植效果。
【专利说明】一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种治疗用干细胞制剂及其制备方法，具体涉及一种用于缺血性心肌病移植治疗的干细胞制剂及其制备方法，属于干细胞生物技术和细胞移植领域。
【背景技术】
[0002]目前心血管类疾病的发生率和死亡率在全世界范围内均占到第一位，缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy, I CM)在心血管类疾病中占到50%以上,每年造成约1700万人死亡，而目前我国缺血性心肌病的发病率仍在逐年上升。缺血性心肌病属于冠心病的一种特殊类型或晚期阶段，是指由于冠状动脉粥样硬化导致心肌长期缺血，引起的以弥漫性纤维化为主的心肌病变，又称心肌硬化或心肌纤维化。该病发病的主要原因是心肌长期慢性缺血，而心肌缺血是心肌供氧量不足，使血氧供需失去平衡而导致心肌细胞减少坏死、凋亡、心肌纤维化、心肌瘢痕和心力衰竭。心肌供氧量受心动周期、神经支配、心肌代谢产物以及血管壁和血小板源性生物活性物质的影响。该病导致的心肌细胞大范围不可逆损失，成年心肌细胞属于非再生细胞，坏死心肌由纤维、瘢痕组织替代，随后发生心室重塑导致心腔进行性增大与心力衰竭，VT、VF等恶性心律失常发生率显著增高，以及随后的心室重塑，仍是患者慢性心功能不全和劳动力永久丧失甚至死亡的主要原因。目前的药物治疗、介入治疗以及外科的冠脉搭桥虽然可使症状缓解或使血管再通，但不能使坏死心肌再生。这些治疗对于冠脉弥漫性狭窄病变、远端血管过细和经过多次手术的患者也很难奏效。心脏移植又存在技术复杂、费用昂贵和供体稀缺等问题，因此不可能短期内广泛推广。
[0003]随着生命科学的飞速发展，一些新兴的生物技术和方法被应用于缺血性心脏病的治疗，并取得了长足的进展。由于干细胞具有多向分化的潜能，可以通过细胞移植技术直接分化为心肌样细胞或血管内皮细胞，增加梗死区的血管密度，并通过分泌作用产生心肌连接蛋白和其他细胞因子，发挥对心肌梗死的治疗作用。干细胞治疗缺血性心肌病的实验研究已显示出巨大的潜力，而近年进行的相关临床研究也取得重要进展。自2001年首例干细胞治疗心肌梗死患者，至今已经历10余年发展历程。目前干细胞治疗临床心脏疾病主要用于于三个方面:①急性心肌梗死；②陈旧心梗伴心功能异常或缺血性心肌病；③慢性心绞痛不适合再血管化治疗和药物治疗效果不佳者。
[0004]目前用于研究干细胞移植治疗缺血性心肌病的细胞制剂种类有:①骨髓源细胞；②CD133+和CD34+的干细胞；③骨髓和脂肪源的间充质干细胞；④心肌源的干细胞；⑤骨骼肌纤维细胞等 等。但因来源有限及免疫排斥等问题，这些细胞的实用性受到极大限制。近来研究表明，骨髓源细胞随着年龄增长其细胞数量和增殖、分化能力也显著下降，较难以满足临床需求。目前为止，大量的研究和实验结果显示，不论是骨髓干细胞、间充质干细胞、还是胚胎干细胞对于缺血性心肌病的治疗都有明显的效果。单纯的骨髓干细胞群体里含有极少量的间充质干细胞，如果不通过体外的进一步扩增，很难达到治疗效果。还有其它细胞，像巨噬细胞等，也必须通过体外的扩增才能达到应有的治疗效果。另外，临床上进行的干细胞应用研究分为自体和异体两种。自体干细胞的利用具有比较好的安全性，但由于来自患者本身，干细胞的自身生长和分化能力有一定的局限性，特别是部分患者由于自身患病可能很难再提供自身的干细胞。异体干细胞的利用主要受限是免疫排斥反应和可能的遗传疾病传染。
[0005]为了解决上述局限及问题，本发明提供了一种用于治疗缺血性心肌病的干细胞制剂及其制备方法，对干细胞治疗缺血性心肌病具有特别重要的临床意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种来源丰富、易于获得、免疫原性弱，异体移植后免疫排斥反应发生率低的治疗缺血性心肌病的干细胞制剂及其制备方法。本发明所要解决的技术是弥补缺血心肌病目前常规治疗方法的不足。
[0007]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，是由间充质干细胞、心肌干细胞、血管内皮干细胞和富含血小板血浆裂解液制备而成。
[0008]进一步的，所述的间充质干细胞浓度为40 X IO6个/ml~60 X IO6个/ml，所述的心肌干细胞浓度为20X 106个/ml~30X IO6个/ml，所述的血管内皮干细胞浓度为20X106个/ml ~30X IO6 个/ml。
[0009]进一步的，所述的富含血小板血浆裂解液的体积分数为100%。
[0010]进一步的，所述的间充质干细胞、心肌干细胞和血管内皮干细胞是来源于胎盘和脐带的组织细胞经体外分别分离纯化和诱导扩增而成。
[0011]进一步的，所述的间充质干细胞表达⑶105、⑶90、⑶73和⑶29，不表达⑶34和CD14。
[0012]进一步的，所述的 心肌干细胞表达心肌特异性标识Sca-1、C-kit和⑶31,不表达非心肌特异性标识⑶34。
[0013]进一步的，所述的血管内皮干细胞表达血管内皮特异性标识⑶31、⑶34、⑶105和vffF,不表达非血管内皮特异性标识⑶45。
[0014]进一步的，所述的富含血小板血浆裂解液是用患者的外周血制备而成。
[0015]一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征是由下述步骤组成:
(1)从胎盘和脐带中将组织干细胞经过体外分离培养、纯化和扩增，得到胎盘和脐带干细胞即间充质干细胞；
(2)将步骤(1)中的部分细胞在体外诱导和扩增培养，制备心肌干细胞；
(3)将步骤(1)中的部分细胞在体外诱导和扩增培养，制备血管内皮干细胞；
(4)制备富含血小板血浆裂解液；
(5)将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)制备的干细胞在步骤(4)制备的富含血小板血浆裂解液中混匀，制备成细胞制剂。
[0016]进一步的，所述步骤(1)包括以下步骤:
第一步，将去除血溃的胎盘和脐带组织机械剪碎成Imm3的小块，用浓度为lmg/ml的胶原酶I浸润，在37°C消化3小时，每15分钟温和震荡一次；
第二步，100目筛网过滤收集细胞；加入D-Hank’ s平衡盐溶液冲洗细胞3次，离心力200g，8 分钟；第三步，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为
4.8 X IO3~I X 104/cm2，接种于T75培养瓶中，为原代细胞，置于37°C、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，48小时后补液，72小时后换液；
第四步，细胞长到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间3~4分钟，待胞质回缩，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化；将细胞悬液离心5分钟，离心力为200g，将原代细胞以1:1的比例进行传代，为第一代细胞；传代第二天更换培养液；
第五步，直至细胞彼此融合，铺满瓶底再重复第四步骤操作。第二代以后按1:3或1:4的比例传代。经过不断扩增和纯化，得到胎盘和脐带组织干细胞即间充质干细胞。
[0017]进一步的，所述步骤(2)包括:取步骤(1)培养得到的第三至五代干细胞悬液，细胞浓度为5X105/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系，其中含有10 μ mo I/L的5-氮胞苷，每皿含诱导体系8ml。诱导作用24小时后吸取诱导体系，用D-Hank’s平衡盐溶液洗涤后改用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系继续培养2周。然后扩增三至五代后收集使用。
[0018]进一步的，所述步骤(3)包括:取步骤(1)培养得到的第三至五代干细胞悬液，细胞浓度为5X105/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的EMG-2培养系，其中含有50 μ g/L的血管内皮生长因子和10 μ g/L的人碱性成纤维生长因子，每孔含诱导体系lml。诱导2周，每3天更换一次诱导培养基体系。然后扩增三至五代后收集使用。
[0019]进一步的,所述步骤(4)包括:采集患者静脉血,加入3.8%枸橼酸钠做为抗凝剂，抗凝剂与所取静脉血的比例为1:9，以200g离心20min，收集上层清液，即为富含血小板血浆。富含血小板血浆经过零下80°C`冰箱和37°C水浴锅快速冷冻及解冻一次，离心后的上清液即是富含血小板血浆裂解液。
[0020]本发明相对于现有技术具有以下优点和效果:
1.本发明干细胞制剂及制备方法提供了可以将所需细胞从胎盘和脐带组织中分离扩增和诱导培养出来的方法，解决了细胞来源受限的问题，细胞制备容易，可大规模产业化生产。所提供的细胞制剂不但细胞来源丰富，易于获得；采集方便，供着无痛苦；而且移植后免疫排斥低。
[0021]2.本发明干细胞制剂及制备方法联合包括多种细胞混合使用，用于治疗缺血性心肌病，疗效明显，从根本上提供了一种治疗缺血性心肌病的方法，可使缺血区促进血管新生作用和细胞移植介导的血管再生；通过静脉输注的方式进入外周血循环中，参与心脏、四肢缺血区的血管生长，可在干细胞治疗缺血性心肌病中发挥巨大的作用。其中:a、间充质干细胞作用优势主要集中于两方面，一方面是可以分化为心肌样细胞，参与心脏的修复，提高心功能；另一方面是移植入体内的间充质干细胞通过旁分泌机制促进血管再生、提高毛细血管密度，挽救濒死心肌、增强心肌收缩力，缩小瘢痕，从而提高心功能。b、具有特有的蛋白质Sca-1的心肌干细胞，它具有最优良的心脏修复能力，能直接迁移到因心脏病发作受损的组织中，并且再生、改善了心脏泵血的能力；心肌干细胞也是心脏自身的多能干细胞，具备特异性心肌分化的潜能，可直接向心肌、内皮和平滑肌等定向分化，在心脏组织的再生修复中具有重要的作用；c、血管内皮干细胞是维持血管内膜及瓣膜抗栓性的最关键的种子细胞，在用于修复心肌梗死患者的心脏的过程中发挥关键性作用。
[0022]3.本发明干细胞制剂中溶剂是富含血小板血浆裂解液，采用患者的外周血制备而成，取材方便，且用量不大，既无外源基因干扰，能直接用于患者；同时，含有细胞生长分化所需的多种生长因子，不同于传统的细胞溶剂，可延长干细胞制剂保存时间，并可增强细胞移植后的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中: 图1是本发明实施例的干细胞制剂的细胞生长状态图，其中图1A所示为间充质干细胞培养第三代第4天的生长状态图，图1B所示为心肌干细胞诱导成功后培养第三代第4天的的生长状态图，图1C所示为血管内皮干细胞诱导成功后培养第三代第4天的的生长状态图。
[0024]图2是本发明实施例的干细胞制剂的细胞生长曲线图，其中图2D所示为间充质干细胞的生长曲线图，图2E所不为心肌干细胞的生长曲线图，图2F所不为血管内皮干细胞的生长曲线图；生长曲线图以生长天数为横坐标轴，以光吸收度为纵坐标轴。
[0025]图3是本发明实施例的干细胞制剂的细胞生长周期检测图，其中图3G所示为间充质干细胞的细胞周期图，图3H所示为心肌干细胞的细胞周期图，图31所示为血管内皮干细胞的细胞周期图；细胞周期图以DAN量(DNA Content)为横坐标轴，以细胞数量(Number)为纵坐标轴。
[0026]图4是本发明动物实验细胞移植后大鼠超声心动图结果，其中图4J所示实验组较心肌梗死组LVESD明显下降；图4K所示实验组较心肌梗死组LVEDD明显下降；图4L所示实验组较心肌梗死组LVFS明显升高。
[0027]图5是细胞移植后大鼠心脏天狼星红染色结果，其中图5M/N/0中橙色区域为胶原组织，图5M为假手术组，图5N为心肌梗死组，图50为实验组；图5P所示为各组平均胶原容积分数(CVF)，实验组较心肌梗死组CVF明显降低。
【具体实施方式】
[0028]下面以具体实施例和缺血性心肌病动物模型为例结合附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不受限于下述实施例。
[0029]实施例1:制备干细胞的实验条件:为确保细胞体外采集、分离、培养、冻存等操作规范化和标准化，得到符合临床应用级别的细胞，确保细胞治疗疾病以安全、有效的方式进行，应遵循国内外相关法规，以及中国良好生产规范(Good Manufacturing Practice,GMP)的要求，建立细胞体外操作的一系列标准操作规程(Standard Operating Procedure,SOP)。
[0030]实施例2:胎盘和脐带干细胞即间充质干细胞的制备方法是:将去除血溃的胎盘和脐带组织机械剪碎成Imm3的小块，用浓度为lmg/ml的胶原酶I浸润，在37°C消化3小时，每15分钟温和震荡一次；100目筛网过滤收集细胞；加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞3次，离心力200g，8分钟；用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为4.8X 10，1X 104/cm2，接种于T75培养瓶中，为原代细胞，于37°C、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，48小时后补液，72小时后换液；细胞长到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间3~4分钟，待胞质回缩，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化；收集细胞悬液离心5分钟，离心力为200g，将原代细胞以1:1的比例进行传代，为第一代细胞；传代第二天更换培养液；直至细胞彼此融合，铺满瓶底再重复本步骤的消化和传代操作。第二代细胞及以后按1:3或1:4的比例传代。经过不断扩增和浓缩，三代后收集得到比较纯化的胎盘和脐带组织干细胞即间充质干细胞。间充质干细胞生长状态为长梭型细胞，如图1A所示。
[0031]间充质干细胞的生长活性测定:收集扩增两代后的间充质干细胞，调整细胞密度至5.0X 103/ml，接种于96孔板内，接种后连续7天利用MTT法进行检测；每组6孔，同时以无细胞培养液作为空白对照，于490nm处分光光度计检测各组细胞的光吸收值，取均值绘制生长曲线。结果如图2D间充质干细胞的生长曲线图所示，传代后的细胞在第I至2天处于滞留期，增值部明显，第3至5天进入对数生长期，细胞增殖加速，第6至7天进入平台期。
[0032]间充质干细胞的细胞周期检测:收集扩增两代后的间充质干细胞，调整细胞密度至1.0X 106~2.0X 107ml，D-Hank’S平衡盐溶液洗涤3次，加入1ml预冷的体积分数为70%的乙醇，充分吹打制成单细胞悬液，4°C条件下固定24小时后，离心，去上清，沉淀物重悬在Iml碘化丙啶中(含核糖核酸酶A质量浓度10μ g/ml，碘化丙啶质量浓度50 μ g/ml )，4°C条件下孵育20分钟后，以流式细胞仪检测分析细胞周期。结果如图3G间充质干细胞的细胞周期图所示，大部分细胞处于静止状态，少部分细胞处于增殖期。
[0033]间充质干细胞表面标记物检测鉴定:收集扩增两代后的间充质干细胞，1500转离心5分钟；弃上清，加 D-Hank’ s平衡盐溶液重悬，吸取100 μ L细胞悬液(约3.0X IO5个细胞)加入流式细胞管内；按量分别加入检测抗体，阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE,其它管分别加入鼠抗人抗体 CD105-FITC，CD90-FITC，CD73-PE，CD29-FITC，CD34-PE 和⑶14-PE，，避光孵育30min ;每样品管加入1.5~2mL PBS溶液洗一次，1500转离心5分钟；弃上清，每样品管加300 μ L PBS溶液重悬，进行流式检测。结果表明培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照:0.11% ;阳性表达:CD105-97.55%，CD90-98.84%，CD73-95.60%，CD29-90.14% ;而阴性表达:CD34-1.91%、CD14-0.81%。
[0034]实施例3:心肌干细胞的制备方法是:取第三至五代部分胎盘和脐带组织干细胞悬液，细胞浓度为5X IO5/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系，其中含有lOymol/L的5-氮胞苷，每皿含诱导体系8ml。诱导作用24小时后吸取诱导体系，用D-Hank’s平衡盐溶液洗涤后改用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系继续培养2周。然后扩增三代后收集使用；心肌干细胞诱导成功后的生长状态也为长梭型细胞，如图1B所示。
[0035]心肌干细胞的生长活性测定:收集诱导扩增两代后的心肌干细胞，调整细胞密度至5.0 X 103/ml，接种于96孔板内，接种后连续7天利用MTT法进行检测；每组6孔，同时以无细胞培养液作为空白对照，于490nm处分光光度计检测各组细胞的光吸收值，取均值绘制生长曲线。结果如图2E心肌干细胞的生长曲线图所示，传代后的细胞在第I至2天处于滞留期，增值部明显，第3至5天进入对数生长期，细胞增殖加速，第6至7天进入平台期。[0036]心肌干细胞的细胞周期检测:收集诱导扩增两代后的心肌干细胞，调整细胞密度至1.0X 106~2.0X 107ml，D-Hank’S平衡盐溶液洗涤3次，加入1ml预冷的体积分数为70%的乙醇，充分吹打制成单细胞悬液，4°C条件下固定24小时后，离心，去上清，沉淀物重悬在Iml碘化丙啶中(含核糖核酸酶A质量浓度10μ g/ml，碘化丙啶质量浓度50 μ g/ml )，4°C条件下孵育20分钟后，以流式细胞仪检测分析细胞周期。结果如图3H心肌干细胞的细胞周期图所示，大部分细胞处于静止状态，少部分细胞处于增殖期。
[0037]心肌干细胞表面标记物检测鉴定:收集诱导扩增两代后的心肌干细胞，1500转离心5分钟；弃上清，加D-Hank’ s平衡盐溶液重悬，吸取100 μ L细胞悬液(约3.0X IO5个细胞)加入流式细胞管内；按量分别加入检测抗体，阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，其它管分别加入鼠抗人抗体Sca-1-FITC，C-kit-PE，CD31-FITC和CD34-PE，避光孵育30min ；每样品管加入1.5~2mL PBS溶液PBS洗一次，1500转离心5分钟；弃上清，每样品管加300 μ L PBS溶液重悬，进行流式检测。结果表明培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照:0.51% ;阳性表达:Sca-1-87.36%, C-kit-88.91%, CD31-93.77% ;而阴性表达:CD34_0.91%。
[0038]实施例4:血管内皮干细胞的制备方法是:取第三至五代部分胎盘和脐带组织干细胞悬液，细胞浓度为5X IO5/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的EMG-2培养系，其中含有50 μ g/L的血管内皮生长因子和10 μ g/L的人碱性成纤维生长因子，每孔含诱导体系lml。诱导2周，每3天更换一次诱导培养基体系。然后扩增三代后收集使用；血管内皮干细胞诱导成功后的生长状态也为长梭型细胞，如图1C所示。
[0039]血管内皮干细胞的生长活性测定:收集诱导扩增两代后的血管内皮干细胞，调整细胞密度至5.0X 103/ml，接种于96孔板内，接种后连续7天利用MTT法进行检测；每组6孔，同时以无细胞培养液作为空白对照，于490nm处分光光度计检测各组细胞的光吸收值，取均值绘制生长曲线。结果如图2F血管内皮干细胞的生长曲线图所示，传代后的细胞在第I至2天处于滞留期，增值部明显，第3至5天进入对数生长期，细胞增殖加速，第6至7天进入平台期。
[0040]血管内皮干细胞的细胞周期检测:收集诱导扩增两代后的血管内皮干细胞，调整细胞密度至1.0X IO6~2.0X 106/ml，D-Hank’S平衡盐溶液洗涤3次，加入1ml预冷的体积分数为70%的乙醇，充分吹打制成单细胞悬液，4°C条件下固定24小时后，离心，去上清，沉淀物重悬在Iml碘化丙啶中(含核糖核酸酶A质量浓度10 μ g/ml，碘化丙啶质量浓度50 μ g/ml)，4°C条件下孵育20分钟后，以流式细胞仪检测分析细胞周期。结果如图31血管内皮干细胞的细胞周期图所示，大部分细胞处于静止状态，少部分细胞处于增殖期。
[0041]血管内皮干细胞表面标记物检测鉴定:收集诱导扩增两代后的血管内皮干细胞，1500转离心5分钟；弃上清，加D-Hank’ s平衡盐溶液重悬，吸取100 μ L细胞悬液(约3.0Χ105个细胞)加入流式细胞管内；按量分别加入检测抗体，阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE,其它管分别加入鼠抗人抗体 CD31- FITC，CD34-PE，CD105-FITC，vffF-FITC和CD45-FITC，避光孵育30min ;每样品管加入1.5~2mL PBS溶液PBS洗一次，1500转离心5分钟；弃上清，每样品管加300 μ L PBS溶液重悬，进行流式检测。结果表明培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照:0.88% ；阳性表达:CD31-97.86%，CD34-85.25%，CD105-98.31%, vffF-86.62% ;而阴性表达:CD45_0.56%。[0042]实施例5:富含血小板血浆裂解液制备方法是:取患者静脉血9ml，加入3.8%枸橼酸钠lml，200g离心20min，收集上层清液，即为富含血小板血浆。富含血小板血浆经过零下80°C冰箱和37°C水浴锅快速冷冻及解冻一次，离心后的上清液即是富含血小板血浆裂解液。
[0043]实施例6:干细胞制剂的制备方法为:分别收集经检测并鉴定合格的细胞，分别检测细胞活力，活细胞均在95%以上，细胞数满足细胞制剂条件:心肌干细胞数为29 X IO6个，血管内皮干细胞数为25X 106个，间充质干细胞数为56X 106个。三种细胞悬液混合并离心，最后重悬于Iml富含血小板血浆裂解液中，制备而成干细胞制剂。
[0044]实施例7:细胞制剂的缺血性心肌病动物模型实验
大鼠心肌梗死造模和细胞制剂输注实验:采用开胸冠状动脉结扎的方法制作大鼠缺血性心肌病模型，选取36只体重为275±25g的雄性大鼠随机分组:实验组，心肌梗死组和假手术组。实验前12小时起禁食，每次术前30分钟腹腔内注入利多卡因lmg/kg麻醉，气管插管连接小动物呼吸机，胸骨左缘三、四肋间开胸，假手术组游离冠脉左前降支不结扎，另外两组大鼠在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部2~3_处结扎左前支。心肌梗死判断标准:心肌苍白，心电图ST段抬高。术后三个小时，取制备成功的干细胞制剂，1000转离心8分钟，用医用生理盐水重悬为IXlO7个/ml ;实验组大鼠经尾静脉移植0.1ml的细胞制剂，心肌梗死组大鼠注射0.1ml医用生理盐水。细胞移植术后第0、7、14、28天用超声测量各组大鼠心功能:左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)和左室短轴缩短率(LVFS) ;28天心脏取材后称重计算心肌肥厚指数，用天狼星红染色法检测心肌胶原含量，计算平均胶原容积分数(CVF)。结果:1.细胞移植后0、7、14、28天各组大鼠分别行超声心动图，结果如图4所示，其中图4J所示实验组较心肌梗死组LVESD明显下降；图4K所示实验组较心肌梗死组LVEDD明显下降；图4L所示实验组较心肌梗死组LVFS明显升高。实验组大鼠较心肌梗死组心功能明显改善，LVESD和LVEDD明显下降而LVFS显著升高(P〈0.01)。2.细胞移植后实验组心肌肥厚指数显著降低，较心肌梗死组P〈0.01。3.细胞移植后大鼠心脏天狼星红染色`结果如图5所示，其中图5M/N/0中橙色区域为胶原组织，图5M为假手术组，图5N为心肌梗死组，图50为实验组；图5P所示为各组平均胶原容积分数(CVF),实验组较心肌梗死组CVF明显降低(P〈0.01)。
【权利要求】
1.一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:由间充质干细胞、心肌干细胞、血管内皮干细胞和富含血小板血浆裂解液制备而成。
2.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的间充质干细胞浓度为40X 106个/ml~60X IO6个/ml，所述的心肌干细胞浓度为20X106个/ml~30X IO6个/ml，所述的血管内皮干细胞浓度为20X IO6个/ml~30X IO6个/ml。
3.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的富含血小板血浆裂解液的体积分数为100%。
4.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的间充质干细胞、心肌干细胞和血管内皮干细胞是来源于胎盘和脐带的组织细胞经体外分别分离纯化和诱导扩增而成。
5.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的间充质干细胞表达⑶105、⑶90、⑶73和⑶29，不表达⑶34和⑶14。
6.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的心肌干细胞表达心肌特异性标识Sca-1、C-kit和⑶31，不表达非心肌特异性标识⑶34。
7.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的血管内皮干细胞表达血管内皮特异性标识⑶31、⑶34、⑶105和vWF，不表达非血管内皮特异性标识⑶45。
8.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂，其特征在于:所述的富含血小板血浆裂解液是用患者的外周血制备而成。
9.权利要求1所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于:由下述步骤组成:` 步骤(1):从胎盘和脐带中将组织干细胞体外分离培养、纯化和扩增，得到胎盘和脐带干细胞即间充质干细胞； 步骤(2):将步骤(1)中的部分细胞在体外诱导和扩增培养，制备心肌干细胞； 步骤(3):将步骤(1)中的部分细胞在体外诱导和扩增培养，制备血管内皮干细胞； 步骤(4):制备富含血小板血浆裂解液； 步骤(5):将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)制备的干细胞在步骤(4)制备的富含血小板血浆裂解液中混匀，制备成细胞制剂。
10.根据权利要求9所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)包括以下步骤: 第一步，将去除血溃的胎盘和脐带组织机械剪碎成Imm3的小块，用浓度为lmg/ml的胶原酶I浸润，在37°C消化3小时，每15分钟温和震荡一次； 第二步，100目筛网过滤收集细胞；加入D-Hank’ s平衡盐溶液冲洗细胞3次，离心力200g，8 分钟； 第三步，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为(4.8 X 103~1 X IO4) /cm2，接种于T75培养瓶中，为原代细胞，置于37°C、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，48小时后补液，72小时后换液； 第四步，细胞长到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间3~4分钟，待胞质回缩，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化；将细胞悬液离心5分钟，离心力为200g，将原代细胞以1:1的比例进行传代，为第一代细胞；传代第二天更换培养液； 第五步，直至细胞彼此融合，铺满瓶底再重复第四步骤操作；第二代以后按1:3或1:4的比例传代；经过不断扩增和纯化，得到胎盘和脐带干细胞即间充质干细胞。
11.根据权利要求9所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)包括:取步骤(1)培养得到的第三至五代干细胞悬液，细胞浓度为5X IO5/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系，其中含有10 μ mol/L的5-氮胞苷，每皿含诱导体系8ml ;诱导作用24小时后吸取诱导体系，用D-Hank’s平衡盐溶液洗涤后改用10%胎牛血清的低糖DMEM培养系继续培养2周；然后扩增三至五代后收集使用。
12.根据权利要求9所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)包括:取步骤(1)培养得到的第三至五代干细胞悬液，细胞浓度为5X IO5/皿接种于IOOmm培养皿，贴壁24小时后，加入诱导体系，采用10%胎牛血清的EMG-2培养系，其中含有50μ g/L的血管内皮生长因子和10μ g/L的人碱性成纤维生长因子，每孔含诱导体系Iml ;诱导2周，每3天更换一次诱导培养基体系；然后扩增三至五代后收集使用。
13.根据权利要求9所述的一种治疗缺血性心肌病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)制备富含血小板血浆裂解液包括:取患者静脉血，加入3.8%枸橼酸钠做为抗凝剂，抗凝剂与所取静脉血的比例为1:9，以200g离心20min，收集上层清液，即为富含血小板血浆；富含血小板血浆经过零下80°C冰箱和37°C水浴锅快速冷冻及解冻一次，离心后的上清液即是富含血小板血浆`裂解液。
【文档编号】A61K35/34GK103860597SQ201410072972
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】周萱 申请人:奥思达干细胞有限公司